高溫木聚糖酶基因和高溫α-葡萄糖醛酸苷酶基因及其蛋白表達與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程和生物質(zhì)利用領(lǐng)域，具體涉及高溫木聚糖酶基因和高溫 α-葡萄糖醛酸苷酶基因及其蛋白表達與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】：
[0002] 植物細胞壁是自然界中存在的最主要的可再生資源，在世界能源日益緊缺的情況 下，這些資源越來越受到重視。植物細胞壁主要包括纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。木聚糖是 植物細胞壁中含量僅次于纖維素的多糖，是半纖維素的主要組成成分，并以數(shù)量多、組分易 提取等特征成為最具潛力的可再生資源。木聚糖是由吡喃木糖以β-l，4_糖苷鍵連接而成 雜合高聚物，聚合度為150-200 (Scheller，H.V.，P.Ulvsk〇V.2010)。來源不同的木聚糖具 有不同的側(cè)鏈取代基，如葡萄糖醛酸殘基、乙?；?、阿拉伯糖等，這些長短不同的取代基所 組成的側(cè)鏈往往是木聚糖降解的限速因素（Dodd, D.，I. K. Cann. 2009)。
[0003] 事實上，自然界存在的木聚糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，含有大量的側(cè)鏈取代基，其完全水解需要 多種酶組成的木聚糖降解酶系統(tǒng)協(xié)同作用才能完成。木聚糖酶（β-l，4-endo_xylanase， EC3. 2. I. 8)存在于第5、7、8、10、11和43糖苷水解酶家族，是降解木聚糖主鏈的關(guān)鍵 酶。它能以內(nèi)切方式隨機切割木聚糖主鏈骨架的β-1，4-糖苷鍵，從而產(chǎn)生不同長度的 低聚木糖和少量的木糖或帶有不同分支側(cè)鏈的木寡糖，使木聚糖聚合度降低（Dodd，D.，I. K. Cann. 2009)。目前許多研究致力于開發(fā)更適合工業(yè)應(yīng)用的木聚糖酶，如工程菌的構(gòu)建、高 產(chǎn)菌株的選育、耐高溫、耐酸堿木聚糖酶的發(fā)掘等（Juturu，V.，J. C. mi. 2012)。高溫木聚糖 酶因其在高溫下的高水解活性以及較好的熱穩(wěn)定性在造紙、飼料、食品、醫(yī)藥和能源等領(lǐng)域 均有廣泛的應(yīng)用（Collins, T.，C. Gerday, et al. 2005)。
[0004] α -葡萄糖醒酸苷酶（a -glucuronidase,EC3. 2. L 139)來源于糖苷水解酶家族4 和67,能水解4-0-甲基葡萄糖醛酸（4-0-MelGlcA)與木聚糖主鏈上木糖殘基之間的α-1， 2-糖苷鍵（Yeoman，C.J.，Y. Han，et al. 2010)。當木聚糖酶與木聚糖底物結(jié)合時，側(cè)枝的 4-0-甲基葡萄糖醛酸會對木聚糖酶的作用產(chǎn)生空間位阻，使得木聚糖酶不能結(jié)合和分解臨 近側(cè)枝的木聚糖從而降低木聚糖酶的水解效率。有研究證實，α-葡萄糖醛酸苷酶和木聚 糖酶同時存在時會協(xié)同作用提高木聚糖的水溶性，加速低聚木糖的產(chǎn)生（Yeoman，C. J.，Υ. Han, et al. 2010)。同時α-葡萄糖醒酸苷酶能進一步釋放被木聚糖酶水解產(chǎn)生的木寡糖 上的4-0-甲基葡萄糖醒酸，使其能進一步被β -木糖苷酶（β -xylosidase，EC3. 2. 1. 37) 徹底水解（Yeoman，C. J.，Y. Han，et al. 2010)。因此α -葡萄糖醛酸苷酶是木聚糖降解酶系 中非常重要的一員，它的生物技術(shù)潛力越來越受到人們的關(guān)注。
[0005] 木聚糖的水解產(chǎn)物一低聚木糖是由2-7個木糖以β-1，4_糖苷鍵連接而成的功 能性低聚糖。低聚木糖具有優(yōu)良的生理功能，能顯著增殖腸道雙歧桿菌，抑制腸道有害細 菌，改善腸道菌群（Menezes, C. R. d.，L. R. Durrant. 2008)。低聚木糖能促進人體對鈣的吸 收，改善糖尿病癥狀，抗齲齒，是理想的甜味劑，因此在食品、飼料、醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有廣 闊的應(yīng)用前景（Vazquez, M.，J· Alonso, et al. 2000)。目前低聚木糖的大規(guī)模生產(chǎn)主要以富 含木聚糖的天然木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)(如秸桿、玉米芯等）為原料，采用化學(xué)法或酶解法制 備而成。我國是一個農(nóng)業(yè)大國，秸桿、玉米芯、甘蔗渣和紅薯渣等農(nóng)業(yè)廢棄物富含木聚糖，雖 數(shù)量龐大，但生物轉(zhuǎn)化率低。借助基因工程技術(shù)生產(chǎn)高效木聚糖酶制劑，降低環(huán)境污染，提 高天然木聚糖的生物轉(zhuǎn)化和農(nóng)業(yè)產(chǎn)品品質(zhì)成為解決問題的關(guān)鍵。
[0006] 熱解纖維素菌Caldicellulosiruptorlactoaceticus 6A是從冰島喊性熱泉 中分離得到的嚴格厭氧的革蘭氏陽性菌，生長溫度為50-78°C，最適溫度為68°C，耐受 ρΗ5· 8-8. 2，最適 pH 接近 7. 0 (Mladenovska, Z.，I. M. Mathrani, et al. 1995)。其能夠 分解和利用纖維素、果膠、淀粉和木聚糖，分泌的高溫酶類具有非?？捎^的工業(yè)應(yīng)用前景 (Mladenovska, Z.，I. M. Mathrani, et al. 1995)。但該菌產(chǎn)生的木聚糖降解酶系組分復(fù)雜， 分離純化困難，加之其生長條件苛刻，生長密度低，不適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。因此采用基 因工程技術(shù)將此類嗜熱微生物的重要糖苷水解酶基因進行異源高效表達一直是研究的熱 點。本發(fā)明以pET-28b為表達載體，以Escherichia coli BL21 (DE3)為宿主菌構(gòu)建了 C. Iactoaceticus木聚糖酶基因 XynlOA和α-葡萄糖醛酸苷酶基因 XynlOA重組工程菌，成 功實現(xiàn)了木聚糖酶XynlOA和α -葡萄糖醛酸苷酶Agu67A的高效表達，該項發(fā)明將為今后 工業(yè)化利用該高溫木聚糖酶XynlOA和α -葡萄糖醛酸苷酶Agu67A降解天然木聚糖和木質(zhì) 纖維素原料奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 發(fā)明目的：
[0008] 本發(fā)明的目的是彌補現(xiàn)有天然木聚糖酶解工藝效率低，以及木聚糖酶制劑活性 低、產(chǎn)量少、穩(wěn)定性差等問題，提供一種高溫木聚糖酶基因 XynlOA和一種α -葡萄糖醛酸苷 酶Agu67A及其重組載體和重組工程菌，以及這兩種酶的表達方法和應(yīng)用。包括：
[0009] 1.本發(fā)明提供一種來源于熱解纖維素菌Caldicellulosiruptor Iactoaceticus 6A的高溫木聚糖酶XynlOA，其基因序列如SEQ ID NO: 1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 2 所示。
[0010] 2.本發(fā)明還提供一種來源于C. Iactoaceticus 6A的高溫α -葡萄糖醒酸苷酶 Agu67A，其基因序列如SEQ ID NO: 3所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
[0011] 3.本發(fā)明提供包含上述木聚糖酶基因的重組載體pET-28b-XynlOA和包含上述 α -葡萄糖醛酸苷酶基因的重組載體pET-28b-Agu67A。
[0012] 4.本發(fā)明提供包含上述木聚糖酶XynlOA和α -葡萄糖醛酸苷酶Agu67A的重組 菌，所述菌株為大腸桿菌Escherichia coli BL21 (DE3)。
[0013] 5.本發(fā)明提供制備上述木聚糖酶XynlOA和α -葡萄糖醛酸苷酶Agu67A的方法。
[0014] 6.本發(fā)明提供上述高溫木聚糖酶XynlOA和α -葡萄糖醒酸苷酶Agu67A在酶解天 然木聚糖和木質(zhì)纖維素原料上的協(xié)同應(yīng)用，優(yōu)選其在水解櫸樺木木聚糖及其在制備低聚木 糖中的應(yīng)用。
[0015] 技術(shù)方案：
[0016] 為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0017] (1)上述高溫木聚糖酶基因 XynlOA和α -葡萄糖醛酸苷酶基因 Agu67A工程菌的 構(gòu)建
[0018] 提取熱解纖維素菌Caldicellulosiruptor lactoaceticus 6A的基因組，分別設(shè) 計引物擴增木聚糖酶基因 XynlOA、α -葡萄糖醛酸苷酶基因 Agu67A和載體pET-28b。得到 的木聚糖酶基因片段和載體pET-28b用Nhe I和Hind III進行雙酶切，連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌 ToplO感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆測序，獲得重組表達載體pET-28b-XynlOA。提取重組質(zhì) 粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Escherichia coli BL2KDE3)感受態(tài)細胞，獲得木聚糖酶基因 XynlOA重 組菌。α-葡萄糖醛酸苷酶基因片段和質(zhì)粒pET-EK DNA用T4 DNA Polymerase處理后，連接 轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆測序，獲得重組表達載體pET-EK-Agu67A。 提取重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coli BL21 (DE3)感受態(tài)細胞，獲得α-葡萄糖醛酸苷酶基 因 Agu67A重組菌。
[0019] (2)上述高溫木聚糖酶XynlOA和α-葡萄糖醛酸苷酶Agu67A的制備
[0020] 將含有上述木聚糖酶基因 XynlOA和α -葡萄糖醛酸苷酶基因 Agu67A的重組菌進 行放大培養(yǎng)，加入IPTG誘導(dǎo)表達。然后通過超聲破碎、65°C熱失活、Ni-NAT親和層析對重 組蛋白進行分離，并通過Superdex200凝膠層析進一步純化得到重組木聚糖酶XynlOA和 α -葡萄糖醛酸苷酶Agu67A。通過SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白的表達和純化情況，并測定 純化蛋白的濃度，分析重組木聚糖酶XynlOA和α -葡萄糖醒酸苷酶Agu67A的酶學(xué)性質(zhì)。
[0021] (3)上述高溫木聚糖酶XynlOA和α -葡萄糖醛酸苷酶Agu67A在降解天然木聚糖 和木質(zhì)纖維素原料上的應(yīng)用
[0022] 稱取一定量預(yù)處理天然木聚糖和木質(zhì)纖維素原料，實驗組1加入一定量的重組木 聚糖酶XynlOA酶液，實驗組2加入一定量的重組木聚糖酶XynlOA和α -葡萄糖醛酸苷酶 Agu67A酶液，于80°C、ρΗ6. 5條件下80rpm振蕩水解，每隔一段時間取樣，離心取上清液用 對羥基苯甲酸酰肼（P_hydroxybenzoic acid hydrazide，PHBAH)法測定還原糖含量，用薄 層層析法定性分析兩個實驗組天然木聚糖和木質(zhì)纖維素原料水解液的成分。
[0023] 有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的木聚糖酶XynlOA最適反應(yīng)溫度為 80°C，最適pH為6. 5,并在pH為6. 0-8. 0范圍內(nèi)均有較高活性。該酶儲存在pH為4. 5-8. 5 范圍的緩沖液中IOh活性保持70%以上，儲存在pH為7. 0-8. 5范圍的緩沖液中24h活性保 持65%以上。木聚糖酶XynlOA對天然木聚糖和半纖維素原料的降解率達到80%以上，酶 解產(chǎn)物中木寡糖含量為80-98%，木糖含量為2-20%。木聚糖酶XynlOA與α -葡萄糖醛酸 苷酶Agu67A在80°C、ρΗ6. 5條件下協(xié)作可以有效酶解天然木聚糖和半纖維素，酶解產(chǎn)物中 木二糖含量為4-46%，木糖含量為52-95%，葡萄糖醛酸1-2%。該來源的木聚糖酶XynlOA和 α -葡萄糖醛酸苷酶Agu67A適用于80°C左右，偏中性條件下對木聚糖的降解，具有酶易純 化、最適反應(yīng)溫度高、熱穩(wěn)定性好以及在偏堿性條件下穩(wěn)定等特性，有望在多種工業(yè)生產(chǎn)過 程中獲得廣泛應(yīng)用。
【附圖說明】
[0024] 圖1重組木聚糖酶XynlOA (A)和α -葡萄糖醛酸苷酶Agu67A (B)在大腸桿菌 BL21 (DE3)中表達的SDS-PAGE分析；
[0025] 其中：M :低分子量標準；1 :超聲后離心上清；2 :65°C水浴30min后離心上清；3 : Ni-NAT親和層析純化蛋白。
[0026] 圖2Superdex200凝膠層析純化后重組木聚糖酶XynlOA (A)和α -葡萄糖醒酸苷 酶 Agu67A (B)的 SDS-PAGE 分析；
[0027] 圖3重組木聚糖酶XynlOA的最適溫度；
[0028] 圖4重組木聚糖酶XynlOA的最適pH (A)和pH穩(wěn)定性（B);
[0029] 圖5重組木聚糖酶XynlOA和α -葡萄糖醛酸苷酶Agu67A的活性分析；
[0030] 圖6木聚糖酶XynlOA和α -葡萄糖醛酸苷酶Agu67A協(xié)同酶解樺木木聚糖的TLC (A)和還原糖分析（B)。
【具體實施方式】
[0031] 實施例1 :高溫木聚糖酶基因 XynlOA和α -葡萄糖醛酸苷酶基因 Agu67A工程菌 的構(gòu)建
[0032] I. 1基因組DNA的提取
[0033] 用細菌基因組 DNA 提取試劑盒提取 Caldicellulosiruptorlactoaceticus 6A 細 菌基因組，得到基因組DNA，-20°C凍存?zhèn)溆谩?br>[0034] 1.2引物設(shè)計
[0035] 根據(jù)已發(fā)表C. Iactoaceticus 6A基因組信息，預(yù)測木聚糖酶和α -葡萄糖醒酸苷 酶基因，設(shè)計如下2對引物：<