細(xì)菌肝素前體-葡萄糖醛酸-5-差向異構(gòu)酶以及使用其的多糖的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種細(xì)菌肝素前體-葡萄糖醛酸-5-差向異構(gòu)酶 (heparosan-glucuronicacid-5-epimerase)。具體而言，本發(fā)明涉及一種具有將N-乙酰 基細(xì)菌肝素前體的葡萄糖醛酸殘基異構(gòu)化為艾杜糖醛酸殘基的活性和/或?qū)⑼耆摿蛩?化·N-乙?；嗡氐陌盘侨┧釟埢悩?gòu)化為葡萄糖醛酸殘基的活性的源自非洲大蝸牛 的酶；具有該活性的多肽；編碼該多肽的核酸、含有該核酸的載體、保持該核酸和/或該載 體的宿主細(xì)胞、該多肽的制造方法、使用該酶和/或該多肽的己糖醛酸殘基被異構(gòu)化的多 糖的制造方法等。
【背景技術(shù)】
[0002] 本申請(qǐng)的說明書中有使用以下簡(jiǎn)寫符號(hào)的情況。
[0003]GAG:糖胺聚糖
[0004]PG:蛋白多糖
[0005]GlcNAc:N-葡糖胺乙酰萄糖胺
[0006]GlcNS:N-硫酸化葡糖胺
[0007]GlcN:葡糖胺
[0008]GlcA:葡萄糖醛酸
[0009] IdoA:艾杜糖醛酸
[0010] IdoA(2S) :2-0-硫酸化艾杜糖醛酸
[0011]HexA:己糖醛酸
[0012]aMan:2, 5-脫水甘露糖
[0013]AS :acharan硫酸（acharan sulfate)
[0014]ACH: acharan(2-0-脫硫酸化AS)
[0015]NAH:N-乙?；?xì)菌肝素前體
[0016]NSH:N-脫乙?；-硫酸化細(xì)菌肝素前體
[0017]HEP:肝素
[0018] ⑶SNAc-HEP :完全脫硫酸化·N-乙?；嗡?br>[0019] ⑶SNS-HEP :完全脫硫酸化·N-再硫酸化肝素
[0020] HS:硫酸乙酰肝素
[0021] C5_epi :細(xì)菌肝素前體-N-硫酸-葡萄糖醛酸-5-差向異構(gòu)酶
[0022] HG-5印i :細(xì)菌肝素前體-葡萄糖醛酸-5-差向異構(gòu)酶
[0023]已知AcharanSulfate(AS)是從非洲大蝸牛（Achatinafulica)分離出來的糖 胺聚糖（GAG)的一種，為包含下述結(jié)構(gòu)式（1)所示的由GlcNAc和IdoA(2S)構(gòu)成的二糖 (-[4GlcNAcal-4Id0A(2S)α1]-)進(jìn)行重復(fù)聚合的結(jié)構(gòu)的直鏈狀的GAG(非專利文獻(xiàn)1、2)。 另外，已知AS具有與作為糖鏈骨架共同的GAG的肝素（HEP)或硫酸乙酰肝素（HS)相似的 生理活性，具體地顯示出血管新生抑制活性（非專利文獻(xiàn)3)、免疫刺激活性（非專利文獻(xiàn) 4)、降低血糖活性（非專利文獻(xiàn)4)、抗凝血活性（非專利文獻(xiàn)5)、抗腫瘤活性（非專利文獻(xiàn) 6)、幽門螺桿菌（Helicobacterpylori)的粘附抑制活性（非專利文獻(xiàn)7)等。
[0024]
[0025]HEP和HS的生物合成根據(jù)對(duì)基因敲除小鼠或突變細(xì)胞株所表達(dá)的糖鏈結(jié)構(gòu)的解 析、或?qū)γ傅牡孜锾禺愋赃M(jìn)行評(píng)價(jià)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以明確的是，依次進(jìn)行包含由GlcNAc和 GlcA構(gòu)成的二糖（_[4GlcNAcal-4GlcA0 1]-)進(jìn)行重復(fù)聚合的結(jié)構(gòu)的GAG即N-乙?；?xì) 菌肝素前體（NAH)的合成、N-脫乙?；蚇-硫酸化、GlcA殘基向IdoA殘基的異構(gòu)化、0-硫 酸化（非專利文獻(xiàn)8、9)。在這些步驟中，GlcA殘基向IdoA殘基的異構(gòu)化通過細(xì)菌肝素前 體-N-硫酸-葡萄糖醛酸-5-差向異構(gòu)酶（C5-印i，EC:5. 1. 3. 17)被催化。即，已知有關(guān) HEP和HS的生物合成的公知的C5-印i均是以NAH被N-脫乙?；捅籒-硫酸化而生成的 GAG即N-脫乙?；う?硫酸化細(xì)菌肝素前體（NSH)作為底物，而并不是以NAH本身作為底 物（非專利文獻(xiàn)10~14、專利文獻(xiàn)1、2)。
[0026] 關(guān)于非洲大蝸牛，對(duì)生物合成蛋白多糖（PG)的酶組進(jìn)行了全面鑒定的蛋白質(zhì)組 分析，從與已知蛋白的同源性來看，發(fā)現(xiàn)了各種生物合成PG的核心蛋白或GAG的酶（非專 利文獻(xiàn)15)。對(duì)于HEP和HS的合成體系而言，發(fā)現(xiàn)了推定為NAH的合成酶、N-脫乙?；? N-硫酸化酶和0-硫酸化酶的蛋白。然而，卻沒有發(fā)現(xiàn)與已知的差向異構(gòu)酶即C5-印i具有 同源性的蛋白質(zhì)。另外，對(duì)于非洲大蝸牛而言，參與AS的生物合成的酶級(jí)聯(lián)還未得以闡明， 合成IdoA的酶所作用的底物、通過酶反應(yīng)而得到的產(chǎn)品是不清楚的。
[0027]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0028] 專利文獻(xiàn)
[0029] 專利文獻(xiàn)1 :國(guó)際公開第1998/048006號(hào)小冊(cè)子
[0030] 專利文獻(xiàn)2 :國(guó)際公開第2002/046379號(hào)小冊(cè)子
[0031] 非專利文獻(xiàn)
[0032]非專利文獻(xiàn)1 :KimYS,JoYY,Chang頂，Toida T, ParkY,Linhardt RJ.，JBiol Chem. 1996May 17；271 (20) :11750-5.
[0033]非專利文獻(xiàn)2 :Kim YS，Ahn MY，Wu SJ，Kim DH，Toida T，Teesch LM，Park Y，Yu G,LinJ, Linhardt RJ. , Glycobiology. 1998Sep；8(9) :869-77.
[0034]非專利文獻(xiàn)3 :Ghosh AK, HirasawaN,LeeYS, Kim YS, Shin KH, RyuN,Ohuchi K. ,Br J Pharmacol. 20020ct；137(4) :441-8.
[0035]非專利文獻(xiàn)4 :Shim JY, Lee YS, Jung SH, Choi HS, Shin KH, Kim YS.，Arch Pharm Res. 2002Dec ;25 (6) :889-94.
[0036]非專利文獻(xiàn)5 :LiDW, LeeIS,SimJS，ToidaT,LinhardtRJ,KimYS.，Thromb Res.2004；113(1) :67-73.
[0037]非專利文獻(xiàn)6 :Joo EJ, Yang H, Park Y, Park NY, Toida T, Linhardt RJ, Kim YS.，J Cell Biochem. 2010Aug 1；110(5) :1272-8.
[0038]非專利文獻(xiàn)7 :Sim JS, Hahn BS, Im AR, Park Y, Shin JE, Bae EA, Kim DH, Kim YS. , Glycoconj J. 2011Aug ；28 (6) :411-8.
[0039]非專利文獻(xiàn)8 :Lindahl U, Kusche-Gullberg M, Kjellen L.，J Biol Chem. 1998Sep 25 ;273 (39) :24979-82.
[0040]非專利文獻(xiàn)9 :Esko JD, Lindahl U.，J Clin Invest. 2001Jul ; 108 (2) :169-73.
[0041]非專利文獻(xiàn)10 :Campbell P, Hannesson HH, Sandback D, Roden L, Lindahl U, Li JP.，J Biol Chem. 19940ct 28 ;269 (43) :26953-8.
[0042]非專利文獻(xiàn)11 :Li J, Hagner-McWhirter A, Kjellen L, Palgi J, Jalkanen M，Lindahl U.，J Biol Chem. 19970ct 31 ;272 (44) :28158-63.
[0043]非專利文獻(xiàn)12 :Hagner-Mcwhirter A, Lindahl U, Li Jp.，Biochem J. 2000Apr 1; 347Pt 1 :69-75.
[0044]非專利文獻(xiàn)13 :Li JP, Gong F,ElDarwish K, Jalkanen M, Lindahl U.，J Biol Chem. 2001Jun 8 ;276 (23) :20069-77.
[0045]非專利文獻(xiàn)14 :Crawford BE, Olson SK, Esko JD, Pinhal MA.，J Biol Chem. 2001 Jun 15 ;276 (24) :21538-43.
[0046]非專利文獻(xiàn)15 :Gesteira TF，Coulson-Thomas VJ，Ogata FT, Farias EH, Cavalhe iro RP, de Lima MA, Cunha GL, Nakayasu ES, Almeida IC, Toma L, Nader HB. , Biochim Biophys Acta. 2011Dec;1814(12) :1862-9.

【發(fā)明內(nèi)容】

[0047] 發(fā)明要解決的問題
[0048]本發(fā)明的問題在于，提供一種細(xì)菌肝素前體-葡萄糖醛酸-5-差向異構(gòu)酶 (HG-5epi)。具體而言，本發(fā)明的問題在于，提供一種具有將NAH的GlcA殘基異構(gòu)化為IdoA 殘基的活性和/或?qū)ⅱ荢NAc-HEP的IdoA殘基異構(gòu)化為GlcA殘基的活性（以下總稱為 "HG-5印i活性"。）的源自非洲大蝸牛的酶；具有該活性的多肽；編碼該多肽的核酸；含有 該核酸的載體；保持該核酸和/或該載體的宿主細(xì)胞；該多肽的制造方法；使用該酶和/或 該多肽的HexA殘基被異構(gòu)化的多糖的制造方法等。
[0049] 用于解決問題的方案
[0050] 本發(fā)明人等著眼于AS以GlcNAc和IdoA(2S)作為構(gòu)成成分、且為骨架中不含 GlcNS的GAG，認(rèn)為非洲大蝸牛中存在與參與HEP和HS的生物合成的公知的C5-印i底物特 異性完全不同的新型的差向異構(gòu)酶。即，本發(fā)明人等認(rèn)為在非洲大蝸牛中存在以NAH作為 底物的異構(gòu)酶即HG-5印i，參與AS的生物合成。
[0051] 本發(fā)明人等為了解決上述問題而進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)作為新型異構(gòu)酶的 HG-5印i存在于非洲大蝸牛中，成功地從非洲大蝸牛中分離出對(duì)HG-5印i進(jìn)行編碼的DNA， 從而完成了本發(fā)明。
[0052]SP，本發(fā)明如下示例。
[0053] [1]
[0054] 一種源自非洲大蝸牛的酶，其具有以下的（A)和（B)的特征：
[0055] (A)具有將N-乙酰基細(xì)菌肝素前體的葡萄糖醛酸殘基異構(gòu)化為艾杜糖醛酸殘基 的活性和/或?qū)⑼耆摿蛩峄う?乙?；嗡氐陌盘侨┧釟埢悩?gòu)化為葡萄糖醛酸殘基 的活性；
[0056] (Β)實(shí)質(zhì)上不具有將Ν-硫酸化細(xì)菌肝素前體的葡萄糖醛酸殘基異構(gòu)化為艾杜糖 醛酸殘基的活性和/或?qū)⑼耆摿蛩峄う?再硫酸化肝素的艾杜糖醛酸殘基異構(gòu)化為葡萄 糖醛酸殘基的活性。
[0057] [2]
[0058] 一種多肽，其為選自由以下的（Α)~（C)組成的組。
[0059] (Α)含有以下的（al)或（a2)的氨基酸序列的多肽，
[0060] (al)序列號(hào)2中的氨基酸編號(hào)1~601所示的氨基酸序列，
[0061] (a2)序列號(hào)2中的氨基酸編號(hào)34~601所示的氨基酸序列。
[0062] ⑶含有在前述（A)的多肽的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加1個(gè)或幾 個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列，且具有將N-乙酰基細(xì)菌肝素前體的葡萄糖醛酸殘基異構(gòu)化 為艾杜糖醛酸殘基的活性和/或?qū)⑼耆摿蛩峄う?乙?；嗡氐陌盘侨┧釟埢悩?gòu)化 為葡萄糖醛酸殘基的活性的多肽。
[0063] (C)含有向前述㈧或⑶的多肽添加了肽標(biāo)簽的融合多肽的氨基酸序列，且具有 將Ν-乙?；?xì)菌肝素前體的葡萄糖醛酸殘基異構(gòu)化為艾杜糖醛酸殘基的活性和/或?qū)⑼?全脫硫酸化·Ν-乙?；嗡氐陌盘侨┧釟埢悩?gòu)化為葡萄糖醛酸殘基的活性的多肽。
[0064] [3]
[0065] 一種多肽，其具有以下的（Α)~（C)的特征。
[0066] (Α)具有將Ν-乙?；?xì)菌肝素前體的葡萄糖醛酸殘基異構(gòu)化為艾杜糖醛酸殘基 的活性和/或?qū)⑼耆摿蛩峄う?乙酰化肝素的艾杜糖醛酸殘基異構(gòu)化為葡萄糖醛酸殘基 的活性。
[0067] (Β)最適pH為 5. 5 ~6. 0。
[0068](C)在0· 1% (w/v)以上的脫氧膽酸鈉的存在下，實(shí)質(zhì)上失去前述活性。
[0069] [4]
[0070] -種核酸，其對(duì)前述酶或前述多肽進(jìn)行編碼。
[0071] [5]
[0072] -種DNA，其為選自由以下的⑷~（C)組成的組。
[0073] ⑷含有以下的（al)或（a2)的堿基序列的DNA，
[0074] (al)序列號(hào)1中的堿基編號(hào)1~1806所示的堿基序列，
[0075] (a2)序列號(hào)1中的堿基編號(hào)100~1806所示的堿基序列。
[0076] ⑶與由和前述㈧的DNA互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的DNA在嚴(yán)格的條件下雜交，且對(duì) 具有將N-乙?；?xì)菌肝素前體的葡萄糖醛酸殘基異構(gòu)化為艾杜糖醛酸殘基的活性和/或 將完全脫硫酸化·N-乙?；嗡氐陌盘侨┧釟埢悩?gòu)化為葡萄糖醛酸殘基的活性的多 肽進(jìn)行編碼的DNA。
[0077] (C)含有在前述⑷或⑶的DNA中添加了編碼肽標(biāo)簽的DNA的融合DNA的堿基 序列，且對(duì)具有將N-乙?；?xì)菌肝素前體的葡萄糖醛酸殘基異構(gòu)化為艾杜糖醛酸殘基的 活性和/或?qū)⑼耆摿蛩峄う?乙?；嗡氐陌盘侨┧釟埢悩?gòu)化為葡萄糖醛酸殘基的 活性的多肽進(jìn)行編碼的DNA。
[0078] [6]
[0079] -種載體，其含有前述核酸和/或前述DNA。
[0080] [7]
[0081] -種宿主細(xì)胞，其保持前述核酸、前述DNA和/或前述載體。
[0082] [8]
[0083] 一種多肽的制造方法，其包括以下的（Α)和（Β)。
[0084] (Α)使用前述宿主細(xì)胞，對(duì)具有將Ν-乙?；?xì)菌肝素前體的葡萄糖醛酸殘基異構(gòu) 化為艾杜糖醛酸殘基的活性和/或?qū)⑼耆摿蛩峄う?乙?；嗡氐陌盘侨┧釟埢悩?gòu) 化為葡萄糖醛酸殘基的活性的多肽進(jìn)行表達(dá)的工序。
[0085] (Β)收集前述（Α)的工序中所表達(dá)的多肽的工序。
[0086] [9]
[0087] 一種多肽，其是通過前述方法得到的。
[0088] [10]
[0089] 一種己糖醛酸殘基被異構(gòu)化的多糖的制造方法，其包括以下工序：將酶和/或多 肽與包含由Ν-乙酰萄糖胺殘基和己糖醛酸殘基構(gòu)成的二糖的多糖接觸，所述酶和/或多肽 對(duì)將具有將Ν-乙?；?xì)菌肝素前體的葡萄糖醛酸殘基異構(gòu)化為艾杜糖醛酸殘基的活性和 /或?qū)⑼耆摿蛩峄う?乙酰化肝素的艾杜糖醛酸殘基異構(gòu)化為葡萄糖醛酸殘基的活性。
[0090] [11]
[0091] -種己糖醛酸殘基被異構(gòu)化的多糖的制造方法，其包括以下工序：將前述酶和/ 或前述多肽與包含由Ν-乙酰萄糖胺殘基和己糖醛酸殘基構(gòu)成的二糖的多糖接觸。
[0092] [12]
[0093] -種多糖，其是通過前述方法得到的。
[0094] [13]
[0095] -種多糖，其含有Ν-乙?；?xì)菌肝素前體的葡萄糖醛酸殘基被異構(gòu)化為艾杜糖 醛酸殘基的結(jié)構(gòu)。
[0096] [14]
[0097] 前述多糖，存在于多糖的骨架中的己糖醛酸殘基中的艾杜糖醛酸殘基的比率為 20%~75%。
【附圖說明】
[0098] 圖1是將進(jìn)行柱精制而得到的HG_5epi的溶出組分供于在還原條件下的SDS-聚 丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)而得到的凝膠的CBB染色后的照片。
[0099] 圖2是表示HPLC柱后標(biāo)記法（postcolumnlabelingmethod)的流程圖的圖。
[0100] 圖3是表示將NAH或⑶SNAc-HEP進(jìn)行N-脫乙?；蛠喯跛岱纸庵?、供于HPLC 柱后標(biāo)記法而得到的色譜圖的圖。
[0101] 圖4是表示將與粗精制HG-5epi接觸的NAH進(jìn)行N-脫乙酰化和亞硝酸分解之后、 供于HPLC柱后標(biāo)記法而得到的色譜圖的圖。
[0102] 圖5是表示將與粗精制HG-5印i接觸的NSH進(jìn)行亞硝酸分解之后、供于HPLC柱后 標(biāo)記法而得到的色譜圖的圖。
[0103] 圖6是表示將與HG-5印i接觸的NAH進(jìn)行N-脫乙?；蛠喯跛岱纸庵?、供于 HPLC柱后標(biāo)記法而得到的色譜圖的圖。
【具體實(shí)施方式】
[0104] (1)本發(fā)明的酶
[0105] 本發(fā)明的酶是具有以下的（A)和（B)的特征的源自非洲大蝸牛的酶。
[0106] ㈧具有將NAH的GlcA殘基異構(gòu)化為IdoA殘基的活性和/或?qū)ⅱ荢NAc-HEP的 IdoA殘基異構(gòu)化為GlcA殘基的活性。
[0107] (B)實(shí)質(zhì)上不具有將NSH的GlcA殘基異構(gòu)化為IdoA殘基的活性和/或?qū)?⑶SNS-HEP的IdoA殘基異構(gòu)化為GlcA殘基的活性。
[0108] 此處所謂的"源自非洲大蝸牛"是指能夠從非洲大蝸牛中取得。
[0109] 本發(fā)明的酶是具有HG-5印i活性的酶。此處所謂的"HG-5印i活性"如上所述，是 指將NAH的GlcA殘基異構(gòu)化為IdoA殘基的活性和/或?qū)⑼耆摿蛩峄-乙?；嗡?(⑶SNAc-HEP)的IdoA殘基異構(gòu)化為GlcA殘基的活性。HG-5印i活性可通過使用例如后述 的〈實(shí)施例14>、〈實(shí)施例16>或〈實(shí)施例17>所述的HPLC柱后標(biāo)記法的方法進(jìn)行測(cè)定。 另外，HG-5印i活性也可通過使用例如后述的〈實(shí)施例20>或〈實(shí)施例21>所述的放射性同 位素的方法進(jìn)行測(cè)定。具體而言，將NAH的GlcA殘基異構(gòu)化為IdoA殘基的活性可根據(jù)后 述的〈實(shí)施例14>、〈實(shí)施例16>、〈實(shí)施例20>或〈實(shí)施例21>的方法進(jìn)行測(cè)定。另外，具 體而言，將⑶SNAc-HEP的IdoA殘基異構(gòu)化為GlcA殘基的活性可根據(jù)后述的〈實(shí)施例17> 的方法進(jìn)行測(cè)定。
[0110] 本發(fā)明的酶可具有將NAH的GlcA殘基異構(gòu)化為IdoA殘基的活性及將⑶SNAc-HEP 的IdoA殘基異構(gòu)化為GlcA殘基的活性的兩者，也可僅具有其一者。例如本發(fā)明的酶可具 有將NAH的GlcA殘基異構(gòu)化為IdoA殘基的活性，且實(shí)質(zhì)上不具有將⑶SNAc-HEP的IdoA 殘基異構(gòu)化為GlcA殘基的活性。
[0111] NAH是包含由GlcNAc殘基和GlcA殘基構(gòu)成的二糖的多糖。⑶SNAc-HEP是包含 由GlcNAc殘基和GlcA殘基構(gòu)成的二糖、及由GlcNAc殘基和IdoA殘基構(gòu)成的二糖的多糖。 以下也將GlcA和IdoA總稱為"HexA"。即，NAH和CDSNAc-HEP均為包含由GlcNAc殘基和 HexA殘基構(gòu)成的二糖的多糖。
[0112] NAH和CDSNAc-HEP是本發(fā)明的酶所作用的底物的示例，并不對(duì)本發(fā)明的酶所作用 的底物進(jìn)行限定。即，本發(fā)明的酶只要具有HG-5印i活性，進(jìn)而，也可具有包含由GlcNAc殘 基和HexA殘基構(gòu)成的二糖的其它的多糖（NAH和⑶SNAc-HEP以外的多糖）中的、對(duì)鄰接 于GlcNAc殘基的HexA殘基進(jìn)行異構(gòu)化的活性。此處所謂的"其它的多糖"，只要為包含由 GlcNAc殘基和HexA殘基構(gòu)成的二糖的多糖，沒有特別限制。此處所謂的"其它的多糖"，更 具體而言，為包含由GlcNAc殘基和GlcA殘基構(gòu)成的二糖和/或由GlcNAc殘基和IdoA殘 基構(gòu)成的二糖的多糖。此處所謂的"HexA殘基的異構(gòu)化"是指，從GlcA殘基向IdoA殘基的 異構(gòu)化和/或從IdoA殘基向GlcA殘基的異構(gòu)化。
[0113] 此處所謂的"由GlcNAc殘基和HexA殘基構(gòu)成的二糖"是指，GlcNAc殘基和HexA 殘基連接而成的二糖。此處所謂的"由GlcNAc殘基和HexA殘基構(gòu)成的二糖"中的GlcNAc殘基和HexA殘基的連接的順序沒有限制。作為"由GlcNAc殘基和HexA殘基構(gòu)成的二糖"， 具體而言，例如可舉出下述結(jié)構(gòu)式（2)~（5)所示的二糖。
[0114] 即，關(guān)于本發(fā)明的酶，具體而言，例如可為具有將存在于多糖的骨架中的下述結(jié)構(gòu) 式（2)所示的由GlcNAc殘基和GlcA殘基構(gòu)成的二糖（GlcNAcal-4GlcA)異構(gòu)化為下述結(jié) 構(gòu)式（3)所示的由GlcNAc殘基和IdoA殘基構(gòu)成的二糖（GlcNAcal-4IdoA)的活性、和/ 或?qū)⒋嬖谟诙嗵堑墓羌苤械南率鼋Y(jié)構(gòu)式（3)所示的二糖異構(gòu)化為下述結(jié)構(gòu)式（2)所示的二 糖的活性的酶。
[0115]
[0116] 另外，關(guān)于本發(fā)明的酶，具體而言，例如可為具有將存在于多糖的骨架中的下述結(jié) 構(gòu)式（4)所示的由GlcA殘基和GlcNAc殘基構(gòu)成的二糖（GlcAβl-4GlcNAc)異構(gòu)化為下述 結(jié)構(gòu)式（5)所示的由IdoA殘基和GlcNAc殘基構(gòu)成的二糖（IdoAal-4GlcNAc)的活性、和 /或?qū)⒋嬖谟诙嗵堑墓羌苤械南率鼋Y(jié)構(gòu)式（5)所示的二糖異構(gòu)化為下述結(jié)構(gòu)式（4)所示的 二糖的活性的酶。
[0117]
[0118] 通過本發(fā)明的酶異構(gòu)化為IdoA殘基的GlcA殘基在NAH等多糖中的位置沒有特別 限制。即，關(guān)于這樣的GlcA殘基，包括在NAH等多糖的骨架中有存在于還原末端的情況、存 在于非還原末端的情況、存在于多糖的骨架中間部位的情況這3種，可為其中任意情況。
[0119] 通過本發(fā)明的酶異構(gòu)化為GlcA殘基的IdoA殘基在⑶SNAc-HEP等多糖中的位置 沒有特別限制。即，關(guān)于這樣的IdoA殘基，在⑶SNAc-HEP等多糖的骨架中有存在于還原末 端的情況、存在于非還原末端的情況、存在于多糖的骨架中間部位這3種情況，可為其中任 意的情況。
[0120] 另外，本發(fā)明的酶為實(shí)質(zhì)上不具有C5-印i活性的酶。此處所謂的"C5-印i活性" 是指，將NSH的GlcA殘基異構(gòu)化為IdoA殘基的活性和/或?qū)⑼耆摿蛩峄-再硫酸化 肝素（⑶SNS-HEP)的IdoA殘基異構(gòu)化為GlcA殘基的活性。C5-印i活性可通過使用例如后 述的〈實(shí)施例15>或〈實(shí)施例18>所述的HPLC柱后標(biāo)記法的方法進(jìn)行測(cè)定。具體而言，將 NSH的GlcA殘基異構(gòu)化為IdoA殘基的活性，可根據(jù)后述的〈實(shí)施例15>的方法進(jìn)行測(cè)定。 另外，具體而言，將⑶SNS-HEP的IdoA殘基異構(gòu)化為GlcA殘基的活性，可根據(jù)后述的〈實(shí) 施例18>的方法進(jìn)行測(cè)定。
[0121] 此處所謂的"實(shí)質(zhì)上不具有活性"是指，在將對(duì)應(yīng)活性的多糖與酶接觸前后進(jìn)行比 較的情況下，IdoA含量完全沒有變化（增加或減少）、或幾乎沒有變化（增加或減少）。即， 例如"實(shí)質(zhì)上不具有C5-印i活性"是指，在將NSH與酶接觸前后進(jìn)行比較的情況下，IdoA含 量完全沒有變化（增加或減少）、或幾乎沒有變化（增加或減少）、和/或在將CDSNS-HEP 與酶接觸前后進(jìn)行比較的情況下，IdoA含量完全沒有變化（增加或減少）、或幾乎沒有變化 (增加或減少）。
[0122] 此處所謂的"IdoA含量"是指，存在于多糖的骨架中的HexA殘基中的IdoA殘基的 比率，8卩，IdoA殘基的總數(shù)除以HexA殘基的總數(shù)（GlcA殘基的總數(shù)與IdoA殘基的總數(shù)的合 計(jì)）并進(jìn)行百分比換算而得的數(shù)值。這樣的IdoA含量例如可根據(jù)后述的〈實(shí)施例14>、〈 實(shí)施例15>、〈實(shí)施例16>、〈實(shí)施例17>或〈實(shí)施例18>的方法進(jìn)行測(cè)定。因此，此處所謂 的"IdoA含量幾乎沒有變化"是指，例如將與本發(fā)明的酶接觸前后的多糖分別供于HPLC柱 后標(biāo)記法，在對(duì)IdoA含量進(jìn)行測(cè)定并比較的情況下，只發(fā)生測(cè)定誤差程度的變化，具體而 言，只發(fā)生5%以下、2%以下、