酶標(biāo)儀定量檢測多樣本中β-葡萄糖醛酸苷酶的方法和試劑盒的制作方法
【專利摘要】一種酶標(biāo)儀定量檢測多樣本中β-葡萄糖醛酸苷酶的方法和試劑盒。試劑盒中包括β-葡萄糖醛酸酶標(biāo)準(zhǔn)品及工作液、酚酞葡萄糖醛酸反應(yīng)液、終止反應(yīng)試劑、pH計等。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：可同時檢測多樣本中的β-葡萄糖醛酸酶濃度，檢測耗時較短；靈敏度高，檢測限低至39.0625U/mL；方法線性范圍廣，檢測濃度范圍為39.0625U/mL～12500U/mL，跨越3個數(shù)量級；準(zhǔn)確度高；試劑和樣本使用量較少；本試劑盒操作方便：不用分多次加樣，一次加樣即可；并且不需要清洗步驟既，減少操作步驟，又不會造成交叉污染而導(dǎo)致結(jié)果不可信；而且可以保存好檢測樣本，以備重復(fù)檢測所用。
【專利說明】酶標(biāo)儀定量檢測多樣本中β-葡萄糖醛酸苷酶的方法和試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明屬于生化分析領(lǐng)域，具體涉及用酶標(biāo)儀定量同時檢測多個樣本中β -葡萄糖醛酸苷酶的方法和檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】:
[0002]葡萄糖苷醛酸酶是一種溶酶體酶，它促進(jìn)體內(nèi)許多葡萄糖苷脂類β-D-糖苷鍵水解。
[0003]現(xiàn)在技術(shù)方法中，檢測糞便中葡萄糖醛酸酶的方法局限于紫外分光光度計和全自動生化儀。
[0004]這兩種方法共同存在以下缺點(diǎn):
[0005]1、試劑使用量較大
[0006]2、需要較多量的樣本
[0007]另外，紫外分光光度計和全自動生化儀檢測時，需要較多量的樣本，如果樣本量不夠，不能進(jìn)行檢測。
[0008]3、耗時較長
[0009]當(dāng)需要同時檢測多份樣本時，用紫外分光光度計和全自動生化儀需要一份份樣本分別檢測，耗時較長，造成實(shí)際操作中的工作效率降低。
[0010]紫外分光光度計法的檢測過程是將每一個樣本反應(yīng)后形成的絡(luò)合物，經(jīng)過透光度和吸光度的換算得出的數(shù)值，每一次讀數(shù)均需有空白對照和測定樣本讀數(shù)，將兩者做差，求得相應(yīng)的吸光度值，再將吸光度值和標(biāo)準(zhǔn)品的濃度一一對應(yīng)后，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。此過程需要時間較長，每一個樣本檢測平均需要2分鐘。
[0011]全自動生化儀檢測除與紫外分光光度計的耗時長導(dǎo)致的結(jié)果不準(zhǔn)確外，還有可能導(dǎo)致樣本或標(biāo)準(zhǔn)品的交叉污染的可能。
[0012]4、需要清洗步驟
[0013]紫外分光光度計檢測需要清洗比色皿，全自動生化儀需要清洗劑清洗加樣針。
[0014]5、結(jié)果不準(zhǔn)確
[0015]紫外分光光度計法檢測誤差較大。由于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(一般為五點(diǎn))的吸光度不是同時讀取的，檢測酶活的時間不同步，時間延長會使得檢測到的酶活有所降低，故此得出的標(biāo)準(zhǔn)曲線會有差異，而且是不可避免的系統(tǒng)誤差。此外每次樣本的取樣檢測都是人工操作，也會有操作的誤差。
[0016]全自動生化儀對樣本的檢測比紫外分光光度計在檢測時會好一些，主要表現(xiàn)在加樣的準(zhǔn)確性，但是，每一樣本的檢測時長并沒有縮短，并且全自動生化儀操作還有一個不可缺少的步驟就是清洗加樣針，這樣，一旦清洗不夠徹底，就會造成交叉污染，從而導(dǎo)致結(jié)果不可信。
[0017]6、不利于原始樣本的保存[0018]紫外分光光度計檢測所需樣本量較大(即便是用最小量的比色皿，由于方法的限制，樣本用量也要ImL)，檢測過后，因多個樣本使用的是同一組(2個?3個)比色皿，所以，回收檢測后的樣本與原始樣本相比，從理論上講和實(shí)際操作均有污染的可能，不利于樣本保存。
[0019]全自動生化儀檢測樣本所需的樣本量雖較紫外分光光度計少些(200yL?500 μ L)，但每次檢測后的樣本都因檢測方法的原因也無法保存。
[0020]因此，目前急需要建立一種新的檢測糞便中葡萄糖醛酸苷酶的方法和檢測試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】
:
[0021]本發(fā)明的目的是提供一種β -葡萄糖醛酸酶濃度定量檢測方法和檢測試劑盒，可同時檢測多份樣本，使用試劑量較少，且用較少量標(biāo)本也能進(jìn)行檢測。
[0022]本發(fā)明提供了一種多樣本同時定量檢測β_葡萄糖醛酸苷酶的方法，其特征為用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測，且操作方法是:
[0023]I)繪制“吸光度值一 葡萄糖醛酸苷酶濃度”標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0024]2)將待測標(biāo)本與酚酞葡萄糖醛酸反應(yīng)液混合進(jìn)行反應(yīng)，測定生成的反應(yīng)產(chǎn)物醌類化
[0025]合物的吸光度值；
[0026]3)根據(jù)所繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計算待測樣品的β -葡萄糖醛酸酶濃度；
[0027]所述吸光度值是用酶標(biāo)儀讀取的吸光度值，設(shè)置酶標(biāo)儀波長為540_550nm。
[0028]所述“酚酞葡萄糖醛酸反應(yīng)液”，是將酚酞葡萄糖醛酸與去離子水和磷酸鹽緩沖液混合，攪拌溶解得到。每10mg3.0mM酚酞葡萄糖醛酸需加入2_4mL去離子水和l_3mL的磷酸鹽緩沖液。
[0029]所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法是將不同濃度的β -葡萄糖醛酸苷酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別與酚酞葡萄糖醛酸混合后，分別用酶標(biāo)儀測定吸光度值；然后以每種葡萄糖醛酸苷酶標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制“吸光度值一 β -葡萄糖醛酸苷酶濃度”標(biāo)準(zhǔn)曲線。所述β-葡萄糖醛酸苷酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液是將葡萄糖醛酸苷酶標(biāo)準(zhǔn)品溶于工作液中，所述工作液是含0.3%?I %小牛血清的磷酸鹽緩沖液，其pH為6.8-7.0。
[0030]工作液中優(yōu)選含有0.5%小牛血清。
[0031 ] 上述步驟2)中，為控制反應(yīng)進(jìn)程，可加入終止反應(yīng)試劑，為酸或堿，可選用無機(jī)酸或堿或有機(jī)酸或堿。如堿性甘氨酸、硫酸、30%?40%濃度氫氧化鈉等，優(yōu)選用甘氨酸與堿的水溶液；
[0032]對每種樣品分別進(jìn)行上述步驟2)的操作，并將多個待測標(biāo)本轉(zhuǎn)移至同一個96孔酶標(biāo)板上，可以對多種樣本同時進(jìn)行測定。
[0033]當(dāng)需要檢測糞便樣本中的β_葡萄糖醛酸苷酶時，待測便標(biāo)本需進(jìn)行前處理，按如下方式進(jìn)行:將樣本從樣本保存液中取出，用離心機(jī)離心，然后計算樣本的濕重濃度；再渦旋混勻后，置于上述工作液中，再離心，取上清。
[0034]如果是溶液樣本，如血液等體液的檢測可以直接進(jìn)行。
[0035]以下是本發(fā)明一種較為優(yōu)選的操作過程的具體操作步驟:[0036]I)制備符合試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)要求的便標(biāo)本
[0037]先將樣本從樣本保存液中取出3mL，于常溫離心機(jī)內(nèi)離心，3000轉(zhuǎn)/分，離心20分鐘，計算濃度；將計算好濃度的樣本，渦旋混勻后，取出10yL至上述工作液中，混勻后，于高速離心機(jī)內(nèi)離心，9000g/分，離心8-10分；取上清至新的標(biāo)記好的1.5mL離心管內(nèi)
[0038]2)制備酚酞葡萄糖醛酸反應(yīng)液，標(biāo)記為試劑A
[0039]稱量10mg3.0mM酚酞葡萄糖醛酸放入10mL燒杯中，加入3.6mL去離子水和2.0mL的磷酸鹽緩沖液。攪拌直到完全溶解。此試劑現(xiàn)用現(xiàn)配。
[0040]3)制備終止反應(yīng)試劑，標(biāo)記為試劑B
[0041]稱量0.75g甘氨酸至含有25mL去離子水的10mL燒杯中，攪拌直到完全溶解。使用pH計、IN氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至10左右。轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶內(nèi)，標(biāo)記好并于2_8°C穩(wěn)定一周。
[0042]4)制備不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品檢測液
[0043]用工作液對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋，得到10個濃度的稀釋液；
[0044]如濃度為12500U/mL、10000U/mL、5000U/mL、2500U/mL、1250U/mL、625U/mL ;312.5U/mL、156.25U/mL、78.125U/mL、39.0625U/mL
[0045]取每一種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液10 μ L分別與90 μ L步驟2)得到的試劑A混勻；
[0046]5)制備待測物檢測稀釋液
[0047]取稀釋好的樣品10 μ L與90 μ L步驟2)得到的試劑A混勻；
[0048]6)終止反應(yīng)
[0049]于反應(yīng)孔內(nèi)加入等體積的試劑B混勻，待測；
[0050]7)測定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值，繪制濃度一吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0051]A將上述不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品檢測稀釋液轉(zhuǎn)移至同一個96孔酶標(biāo)板上，利用酶標(biāo)儀分別讀取每種濃度標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值；設(shè)置酶標(biāo)儀激發(fā)波長540-550nm。
[0052]B以標(biāo)準(zhǔn)品每種β -葡萄糖醛酸苷酶濃度為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的吸光度值為縱坐標(biāo)繪制“吸光度值一 β -葡萄糖醛酸苷酶濃度”標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0053]8)測定待測物吸光度值
[0054]方法同步驟7) A ;
[0055]9)計算待測樣品濃度
[0056]將待測樣品吸光度值代入步驟7)Β得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出待測樣品的濃度。
[0057]本發(fā)明用終點(diǎn)法經(jīng)酶標(biāo)儀檢測的方法驗(yàn)證了本方法的準(zhǔn)確度(見實(shí)施例3)。
[0058]用本發(fā)明的酶標(biāo)儀法與紫外分光光度計的方法相比，酶標(biāo)儀檢測結(jié)果更準(zhǔn)確，且重復(fù)性好(見實(shí)施例3中“三、試驗(yàn)結(jié)果”)。
[0059]本方法的創(chuàng)新點(diǎn)是:
[0060]1、首次采用標(biāo)準(zhǔn)β -葡萄糖醛酸酶濃度作為酶標(biāo)法中的β -葡萄糖醛酸酶標(biāo)準(zhǔn)對便樣品進(jìn)行定量；
[0061]2、靈敏度高:可檢測低至39.0625U/mL的β -葡萄糖醛酸酶濃度；
[0062]3、方法線性范圍廣:可檢測39.0625U/mL?12500U/mL的β -葡萄糖醛酸酶濃度，跨越3個數(shù)量級；
[0063]4、準(zhǔn)確度高:首次采用高準(zhǔn)確度的酶標(biāo)法對標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行定量，得到的量值不確定度低，準(zhǔn)確度高。
[0064]5、試劑使用量較少，不需要較多量的樣本
[0065]6、耗時較短:酶標(biāo)儀不用分多次加樣，一次即可。并且可同時檢測多樣本
[0066]7、不需要清洗步驟:不用清洗板孔，既減少操作步驟，又不會造成交叉污染而導(dǎo)致結(jié)果不可信。
[0067]8、可以保存好檢測樣本，以備重復(fù)檢測所用
[0068]酶標(biāo)儀檢測后的樣本可以用保鮮膜封好，保存兩周，以供樣本的復(fù)查。而紫外法和全自動生化儀則做不到。
[0069]本發(fā)明還提供了一種標(biāo)儀法定量檢測β -葡萄糖醛酸酶酶試劑盒，試劑盒中包括β-葡萄糖醛酸酶標(biāo)準(zhǔn)品、酚酞葡萄糖醛酸反應(yīng)液、終止反應(yīng)試劑、pH計，且所述終止反應(yīng)試劑是無機(jī)或有機(jī)酸或堿，其特征是:
[0070]3)試劑盒中包括酶標(biāo)板；
[0071]4)配制標(biāo)準(zhǔn)品檢測液的工作液中含有0.5%小牛血清。
[0072]所述終止反應(yīng)試劑優(yōu)選是甘氨酸與堿的水溶液，優(yōu)選配方是0.75g甘氨酸、25mL去離子水、IN氫氧化鈉；
[0073]所述配制β -葡萄糖醛酸酶標(biāo)準(zhǔn)品的工作液優(yōu)選是:ρΗ = 6.8的PBS，包含磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉及含有0.3%?I %小牛血清。
[0074]所述酚酞葡萄糖醛酸反應(yīng)液優(yōu)選是:每10mg3.0mM酚酞葡萄糖醛酸需加入2_4mL去離子水和l_3mL的磷酸鹽緩沖液。
[0075]所述酶標(biāo)板優(yōu)選96孔酶標(biāo)板。
[0076]試劑盒中還具有制備便標(biāo)本用的pH7.0的磷酸鹽緩沖液。
[0077]本試劑盒的優(yōu)點(diǎn)是:
[0078]1、彌補(bǔ)了現(xiàn)有酶類檢測試劑盒中不能對糞便中β -葡萄糖醛酸酶進(jìn)行定量檢測的缺點(diǎn)；
[0079]2、靈敏度高:可檢測β -葡萄糖醛酸酶的酶活低至312.5U/mL ；
[0080]3、檢測范圍廣:可檢測312.5U/mL?10000U/mL的酶活，跨越3個數(shù)量級；
[0081]4、操作簡便、需要的檢測儀器設(shè)備常規(guī)；
[0082]5、標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確度高。
[0083]而酶標(biāo)儀檢測不需要清洗檢測所需的96孔板。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0084]圖1為酶標(biāo)儀法檢測糞便中β -葡萄糖醛酸酶濃度(312.5U/mL?10000U/mL)與酚酞葡萄糖醛酸化合物吸光度的關(guān)系
[0085]圖2為酶標(biāo)儀法檢測糞便中β -葡萄糖醛酸酶濃度(39.0625U/mL?125000U/mL)與酚酞葡萄糖醛酸化合物吸光度的關(guān)系；及酶標(biāo)儀法對葡萄糖醛酸酶定量的線性范圍；
[0086]圖3和圖4是本方法與現(xiàn)有技術(shù)方法(即酶標(biāo)儀法與紫外分光光度計法)測定結(jié)果比較。其中:
[0087]圖3是酶標(biāo)儀檢測糞便中β -葡萄糖醛酸酶(156.25U/mL?10000U/mL)與酚酞葡萄糖醛酸化合物吸光度的關(guān)系；
[0088]圖4是紫外分光光度計法檢測糞便中β -葡萄糖醛酸酶(156.25U/mL?10000U/mL)與酚酞葡萄糖醛酸化合物吸光度的關(guān)系。
【具體實(shí)施方式】
[0089]實(shí)施例1 β -葡萄糖醛酸酶濃度與酚酞葡萄糖醛酸化合物吸光度的關(guān)系
[0090]一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
[0091]探索糞便中葡萄糖醛酸酶濃度及其與酚酞葡萄糖醛酸化合物是否存在線性關(guān)系。
[0092]二、材料與方法:
[0093]1.β -葡萄糖醛酸酶檢測原理:通過提取糞便標(biāo)本中β -葡萄糖醛酸酶，并將之與酚酞葡萄糖醛酸發(fā)生醛酸反應(yīng)，用堿性溶液終止反應(yīng)，得到顯色絡(luò)合物。
[0094]2.甘氨酸:購自sigma公司。用DDW按照0.75g:25mL進(jìn)行配制,分裝保存,備用。
[0095]3.將β -葡萄糖醛酸酶配置成10000U/mL的保存濃度，然后用pH6.8PBS稀釋至5000U/mL、2500U/mL、1250U/mL、625U/mL、312.5/mL、156.25U/mL、78.125U/mL、39.0625U/mL。
[0096]4.取稀釋好的β -葡萄糖醛酸酶溶液0.0lmL與0.09mL的酚酞葡萄糖醛酸液混合，轉(zhuǎn)移至96孔酶標(biāo)板。
[0097]5.將酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀上，選擇激發(fā)波長546nm，吸收波長620nm進(jìn)行吸光度值的米集。
[0098]6.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:以β -葡萄糖醛酸酶濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)進(jìn)行曲線繪制，所得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。
[0099]三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
[0100]由圖1可知，β -葡萄糖醛酸酶與酚酞葡萄糖醛酸液結(jié)合后，β -葡萄糖醛酸酶與吸光度成正比，線性相關(guān)系數(shù)為0.999。
[0101]四、實(shí)驗(yàn)結(jié)論
[0102]β -葡萄糖醛酸酶濃度與吸光度具有線性關(guān)系，證明酚酞葡萄糖醛酸酶標(biāo)儀法可以對β_葡萄糖醛酸酶進(jìn)行定量。
[0103]實(shí)施例2酶標(biāo)儀法對β -葡萄糖醛酸酶定量的線性范圍及定量限和檢測靈敏度的確定
[0104]一、材料與方法
[0105]1.將β -葡萄糖醛酸酶標(biāo)準(zhǔn)品配置成10000U/mL的保存濃度，然后用75mM PBS稀釋至 5000U/mL、2500U/mL、1250U/mL、625U/mL、312.5U/mL、156.25U/mL、78.125U/mL、39.0625U/mL等濃度進(jìn)行保存。
[0106]2.取稀釋好的β -葡萄糖醛酸酶標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0lmL與0.09mL的稀釋好的酚酞葡萄糖醛酸液混合，轉(zhuǎn)移至96孔酶標(biāo)板。其它操作同實(shí)施實(shí)例I中的5和6。
[0107]二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
[0108]1.酶標(biāo)儀法測定葡萄糖醛酸酶的線性范圍
[0109]為了測定酶標(biāo)儀法測定葡萄糖醛酸酶定量的線性范圍，將葡萄糖醛酸酶進(jìn)行了 9個不同濃度梯度的稀釋，所有β -葡萄糖醛酸酶濃度與吸光度的關(guān)系見圖2，由圖2可知，在實(shí)驗(yàn)的范圍內(nèi)吸光度輕度與β -葡萄糖醛酸酶濃度不完全成正比，當(dāng)濃度超過10000U/mL或低于312.5U/mL時，吸光度與β -葡萄糖醛酸酶濃度已經(jīng)不再是直線關(guān)系了。因此將濃度超過10000U/mL和濃度低于312.5U/mL的點(diǎn)去掉后所得到的即為吸光度對β -葡萄糖醛酸酶的定量線性范圍，即312.5U/mL~10000U/mL，見圖3。
[0110]2.酶標(biāo)儀法測定β-葡萄糖醛酸酶的定量限
[0111]根據(jù)上述的線性范圍，最低定量濃度312.5U/mL，加樣量為0.lmL，因此可計算出酶標(biāo)儀法測定β -葡萄糖醛酸酶的定量限為31.25U。
[0112]3.酶標(biāo)儀法測定葡萄糖醛酸酶的檢測靈敏度
[0113]由于可檢測的最低信號值對應(yīng)的濃度為39.0625U/mL，加樣量為0.1mL,因此可計算出酶標(biāo)儀法法測定β -葡萄糖醛酸酶的檢測限為3.90U。
[0114]實(shí)施例3酶標(biāo)儀法與紫外法測定β -葡萄糖醛酸酶比較
[0115]一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br> [0116]1.同時用本發(fā)明酶標(biāo)儀法和紫外分光光度計對待測β_葡萄糖醛酸酶樣品進(jìn)行測定比較，以證明本專利方法的可行性和準(zhǔn)確性。
[0117]二、材料與方法 [0118]2.待測β -葡萄糖醛酸酶購于sigma公司。
[0119]3.采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法對待側(cè)樣本中的葡萄糖醛酸酶進(jìn)行定量
[0120](I)標(biāo)準(zhǔn)品處理:采用倍比稀釋法，將β_葡萄糖醛酸酶標(biāo)準(zhǔn)品稀釋8個濃度，與酚酞葡萄糖醛酸進(jìn)行反應(yīng)，加入堿性甘氨酸終止反應(yīng)，讀取吸光度值。
[0121](2) β -葡萄糖醛酸酶標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
[0122]將β_葡萄糖醛酸酶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)按照使用說明置于電子天平精確稱量一定質(zhì)量的β -葡萄糖醛酸酶，溶于一定體積的超純水(電阻為18.2 Ω )，配制成濃度為10000U/mL的β-葡萄糖醛酸酶標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液(濃度計算時應(yīng)考慮到標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度)。根據(jù)一般糞便β-葡萄糖醛酸酶樣品完全水解的大致濃度(由紫外分光光度法及酶標(biāo)儀檢測得到)，取一定體積的β -葡萄糖醛酸酶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲備液，稀釋至所需濃度，同時配制工作標(biāo)準(zhǔn)溶液。
[0123](3)酶結(jié)合溶液的配制
[0124]將經(jīng)過離心及工作液處理的β -葡萄糖醛酸酶的糞便樣品，稱取10 μ L樣品，向樣品中添加與標(biāo)準(zhǔn)溶液中加入的7-9倍量的酚酞葡萄糖醛酸液(Α液)，并加入等倍量的甘氨酸堿性緩沖液(試劑B)，形成顯紫色絡(luò)合物，即是終止反應(yīng)。
[0125](4)酶標(biāo)儀法測定糞便樣品的β -葡萄糖醛酸酶濃度
[0126]a.β -葡萄糖醛酸酶標(biāo)準(zhǔn)品的體積濃度計算
[0127]將經(jīng)前處理的待測質(zhì)粒樣品分為3組，每組3個平行待測樣，進(jìn)行酶標(biāo)儀測定，求得平均值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1
[0128]b.對待測糞便樣本中β_葡萄糖醛酸酶含量采用以下公式進(jìn)行計算
[0129]
【權(quán)利要求】
1.一種酶標(biāo)儀法定量檢測β-葡萄糖醛酸酶酶的試劑盒，試劑盒中包括β-葡萄糖醛酸酶標(biāo)準(zhǔn)品、工作液、酹酞葡萄糖醒酸反應(yīng)液、pH計、終止反應(yīng)試劑,且所述終止反應(yīng)試劑是酸或堿；所述工作液用于配制β-葡萄糖醛酸酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液和處理待檢標(biāo)本； 其特征是: 1)試劑盒中具有酶標(biāo)板； 2)所述工作液中含有小牛血清。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，所述工作液是含0.3%?1%小牛血清的磷酸鹽緩沖液，其 pH 為 6.8-7.0。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，所述小牛血清的含量是0.5%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，所述終止反應(yīng)試劑是甘氨酸與堿的水溶液；所述酶標(biāo)板是96孔酶標(biāo)板。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，配制所述終止反應(yīng)試劑的配方是0.75g甘氨酸、25mL去離子水、IN氫氧化鈉。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，所述酚酞葡萄糖醛酸反應(yīng)液成份是:每10mg3.0mM酚酞葡萄糖醛酸加入2_4mL去離子水和l_3mL的磷酸鹽緩沖液。
7.一種多樣本同時定量檢測β_葡萄糖醛酸苷酶的方法，其特征為:用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測，且操作方法是: 1)繪制“吸光度值一葡萄糖醛酸苷酶濃度”標(biāo)準(zhǔn)曲線； 2)將待測標(biāo)本與酚酞葡萄糖醛酸反應(yīng)液混合進(jìn)行反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測定生成的反應(yīng)產(chǎn)物醌類化合物的吸光度值； 3)根據(jù)所繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計算待測樣品的β_葡萄糖醛酸酶濃度； 所述吸光度值是用酶標(biāo)儀讀取的吸光度值，設(shè)置酶標(biāo)儀波長為540-550nm。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，所述酚酞葡萄糖醛酸反應(yīng)液是酚酞葡萄糖醛酸、去離子水和磷酸鹽緩沖液混合得到的液體； 所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法是將不同濃度的β-葡萄糖醛酸苷酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別與酚酞葡萄糖醛酸混合后，分別用酶標(biāo)儀測定吸光度值；然后以每種葡萄糖醛酸苷酶標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制“吸光度值一 β -葡萄糖醛酸苷酶濃度”標(biāo)準(zhǔn)曲線； 所述葡萄糖醛酸苷酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液是將葡萄糖醛酸苷酶標(biāo)準(zhǔn)品溶于工作液中，所述工作液是含0.3%?I %小牛血清的磷酸鹽緩沖液，其pH為6.8-7.0。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，所述步驟2)中，加入控制反應(yīng)進(jìn)程的終止反應(yīng)試齊U，所述終止反應(yīng)試劑是無機(jī)或有機(jī)酸或堿。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，當(dāng)需要檢測糞便樣本中的β-葡萄糖醛酸苷酶時，待測便標(biāo)本需進(jìn)行前處理，按如下方式進(jìn)行:將樣本從樣本保存液中取出，用離心機(jī)離心，計算樣本的濕重濃度后，再渦旋混勻；然后置于所述工作液中，再離心，取上清。
【文檔編號】G01N33/573GK104034891SQ201410262183
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月13日
【發(fā)明者】侯艷艷 申請人:北京洛奇臨床檢驗(yàn)所有限公司