梨蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白基因PbSUT2及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域。具體涉及一種從鴨梨（Pyrus bretschneideri) 果實中分離、克隆得到一個編碼蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白的基因 PbSUT2,還涉及一種梨蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白 基因 PbSUT2在調(diào)節(jié)植物生長與果實品質(zhì)方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 梨是世界重要水果之一，也是我國的第三大栽培果樹。糖是果實其他品質(zhì)特征 成分和風(fēng)味物質(zhì)如有機酸、花色素和芳香物質(zhì)等合成的前體，是聯(lián)系植物初級代謝和次級 代謝的關(guān)鍵物質(zhì)；同時，糖也具有多種多樣的生物學(xué)功能，如為果實的細(xì)胞膨大提供滲透 推動力，以及作為信號分子與激素等信號連成網(wǎng)絡(luò)，其通過復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制調(diào)節(jié)果實 生長發(fā)育與基因表達(dá)等（Leon and Sheen，2003;陳俊偉等，2004)。薔薇科植物果實中積 累的糖分主要為蔗糖、果糖、葡萄糖和山梨醇等四種糖（Yamaki et al.，1986)。梨果實中 糖組分和積累特點因不同種類及品種存在顯著差異（Hudina and Stampar，2000 ;Chen et al.，2007 ;姚改芳等，2010)。植物葉片產(chǎn)生的光合運轉(zhuǎn)糖需經(jīng)短距離運輸?shù)巾g皮部并裝 載入韌皮部，經(jīng)篩管長距離運輸后從韌皮部卸出；再由韌皮部后運輸進(jìn)入果實代謝和貯藏。 庫細(xì)胞中韌皮部后運輸效率，糖代謝酶的種類與活力和糖的跨膜運輸能力等因素決定了果 實糖分的積累（Ruan and Patrick，1995)。因此，篩選果實蔗糖運輸過程中的轉(zhuǎn)運蛋白基 因，有助于了解梨蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白參與的糖運輸分子生理機制及糖信號轉(zhuǎn)導(dǎo)耦合激素信號轉(zhuǎn) 導(dǎo)調(diào)控植株生長發(fā)育的過程，為利用基因工程的手段改善果實品質(zhì)的研究提供新的基因資 源。
[0003] 植物的鹿糖轉(zhuǎn)運蛋白（sucrose transporters，SUTs)，又稱鹿糖_H+共轉(zhuǎn)運蛋白 (sucrose/H+co-transporters，SUCs)，是一類具有鹿糖轉(zhuǎn)運活性的鹿糖載體，廣泛存在于 高等植物的組織和細(xì)胞中介導(dǎo)蔗糖的跨膜運輸。因此，蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白被認(rèn)為在蔗糖進(jìn)出韌 皮部、庫組織的蔗糖供給與蔗糖的貯藏，以及蔗糖轉(zhuǎn)運調(diào)控等多種生理過程中發(fā)揮著重要 的作用。Riesmeier等（1992)從菠菜中克隆得到了第一個鹿糖轉(zhuǎn)運蛋白SoSUTl(Riesmeier et al·，1992)。鹿糖轉(zhuǎn)運蛋白屬于 MFS 超家族（Major Facilitator Super family)中的 一員，它們的序列高度保守，是高疏水性蛋白，含有12個跨膜結(jié)構(gòu)域，中間面向細(xì)胞質(zhì) 的部分有1個大的胞質(zhì)環(huán)，將蛋白分為各含6個跨膜結(jié)構(gòu)域的2個半?yún)^(qū)，即前半?yún)^(qū)和后半 區(qū)。至今已經(jīng)從菠菜、馬鈴薯、芹菜、胡蘿卜及擬南芥等植物中克隆得到了 80多種蔗糖轉(zhuǎn)運 蛋白基因（張立軍等，2008)。而后又對這些基因和cDNA序列進(jìn)行同源性和系統(tǒng)發(fā)生分析 得知，編碼鹿糖轉(zhuǎn)運蛋白的基因?qū)儆谝粋€多成員的基因家族（Ward et al.，1998 ;KUhn et al.，1999;Williams et al.，2000)。在大多數(shù)植物體中，都包含不止1個蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白基 因。如擬南芥中包含9種鹿糖轉(zhuǎn)運蛋白基因 （The Arabidopsis genome initiative, 2000)， 水稻基因組中包含5種蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白基因 （Aoki et al.，2003)。甜橙中有3個蔗糖轉(zhuǎn)運 蛋白基因 （Zheng et al.，2014).植物體的蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白共分為5個亞族：SUT1、SUT2、 SUT3、SUT4和SUT5亞族（KUhn et al.，2010)。代謝庫特異性的蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白也從許多 植物中分離得到，如葡萄的 VvSUCll 和 VvSUC12(Davies et al.，1999)，甘蔗 ShSUTl(Rae et al.，2005)，擬南芥花 AtSUC9(Sivitz et al.，2007)，擬南芥胚柄 AtSUC3(Stadler et al·，2005)，擬南芥胚乳 AtSUC5 (Baud et al·，2005)等。
[0004] 不同類型的鹿糖轉(zhuǎn)運蛋白其功能上存在差異。Leggewie et al (2003)研究得出馬 鈴薯的蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白基因 SoSUTl超表達(dá)后，改變了植株葉片和塊莖的蔗糖含量，但對塊莖 的代謝和形態(tài)學(xué)影響很小。StSUT4影響馬鈴薯植株的開花，塊莖的產(chǎn)量以及對光的敏感性 (Chincinska et al.，2008)。馬鈴薯塊莖中StSUTl的表達(dá)量減少后，不影響其地上部分的 器官，但會減少塊莖早期發(fā)育過程中塊莖鮮重的積累（KUhn et al，2003)。Li et al (2014) 從基因型為'TAS-R8'的可可植物中克隆得到6個TcSUT基因（TcSUTl-TcSUT6)，其分屬3 個不同的亞簇，各自具有不同的表達(dá)模式。擬南芥AtSUCl的突變體在外源提供蔗糖和麥芽 糖的條件下，其花青素積累量減少，許多與花青素合成有關(guān)的重要基因表達(dá)量下降（Sivitz et al.，2008);擬南芥蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白AtSUC2突變體增加了蔗糖的韌皮部滲漏和轉(zhuǎn)運的時 間（Gould et al, 2012)。AtSUC9突變體在短日照的條件下表現(xiàn)出早花的表型（Sivitz et al.，2007)。AtSUC5基因與擬南芥種子的早期發(fā)育有關(guān)（Baud et al.，2005)。楊樹的蔗糖 轉(zhuǎn)運蛋白基因 PtaSUT4調(diào)節(jié)整個植株的水分關(guān)系（Christopher et al.，2012)。煙草的蔗 糖轉(zhuǎn)運蛋白NtSUT4影響原生質(zhì)體細(xì)胞的形狀，這種影響是通過細(xì)胞內(nèi)蔗糖的體內(nèi)平衡途 徑實現(xiàn)的（Okubo-Kurihara et al.，2011)。Hackel et al(2006)通過反義抑制番前鹿糖 轉(zhuǎn)運蛋白LeSUTl和LeSUT2的研究得出，LeSUTl和LeSUT2通過不同的途徑影響番茄果實 的發(fā)育。葡萄植物中與成熟相關(guān)的2個蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白VvSUCll和VvSUC12可促進(jìn)蔗糖從質(zhì) 外體到薄壁細(xì)胞的裝載的功能（Manning et al.，2001)。
[0005] 目前有關(guān)植物蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白的功能研究主要集中擬南芥、煙草、番茄等植物，而有 關(guān)梨的蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白的報道較少，雖然目前已克隆得到了梨蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白有PbSUTl (Zhang et al.，2013)和PpSUT2(Tang et al.，2014)，但還未見有對梨蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白或果樹植物蔗 糖轉(zhuǎn)運蛋白的功能研究的相關(guān)報道。梨蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白是如何調(diào)控和影響植物的生長發(fā)育， 對果實的品質(zhì)又有何影響，這些問題都需要進(jìn)行深入的研究和探討。因此，本研究開展了新 的梨蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白基因的克隆和功能的研究，將對了解果實蔗糖轉(zhuǎn)運的分子生理機制及品 質(zhì)育種研究具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供了一種從梨（Pyrus bretschneideri)果實中分離克隆的 蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白基因。
[0007] 本發(fā)明的另一目的是提供該基因在果實品質(zhì)方面的應(yīng)用。
[0008] 為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0009] 申請人從梨（Pyrus bretschneideri)果實中分離克隆得到一個新基因 PbSUT2， 其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 1所示，編碼區(qū)序列（⑶S)長度為1497bp，編碼499個氨 基酸殘基，氨基酸序列如序列表SEQ ID N0. 2所示，預(yù)測編碼蛋白質(zhì)含有12個跨膜結(jié)構(gòu)域， 分子量為53. 42KD，等電點為8. 96。
[0010] 克隆本發(fā)明所述PbSUT2基因 CDNA序列的引物對，正向引物 PbSUT2-Fl:5'-CCATGCCAGCTCCAGAAG-3'（SEQ ID N0.3);反向引物 PbSUT2-Rl: 5'-ACCTCATGTGACAGCTCTGG-3'（SEQ ID N0.4)。
[0011] 含有本發(fā)明所述的蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白基因 PbSUT2的重組表達(dá)載體。
[0012] 本發(fā)明所述的蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白基因 PbSUT2在提早植物開花中的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明所述的蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白基因 PbSUT2在提高植物果實蔗糖含量中的應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明所述的蛋白在提早植物開花中的應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明所述的蛋白在提高植物果實蔗糖含量中的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明所述的重組表達(dá)載體在提早植物開花中的應(yīng)用。
[0017] 本發(fā)明所述的重組表達(dá)載體在提高植物果實蔗糖含量中的應(yīng)用。
[0018] 利用qRT-PCR技術(shù)分析了在鴨梨果實發(fā)育過程中PbSUT2基因的表達(dá)模式，結(jié)果表 明PbSUT2在整個果實發(fā)育過程中都具有表達(dá)量，其相對表達(dá)量的最高峰出現(xiàn)在果實快速 膨大期，其次是果實成熟前期，這與蔗糖的積累規(guī)律相一致。
[0019] 構(gòu)建了 PbSUT2的亞細(xì)胞定位融合表達(dá)載體pCAMBIA1302-PbSUT2-GFP，通過農(nóng)桿 菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞，結(jié)果表明PbSUT2定位于細(xì)胞膜上，屬于膜蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白體。
[0020] 構(gòu)建梨PbSUT2基因的植物超表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法將梨 PbSUT2基因轉(zhuǎn)化番茄，獲得的轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)生物學(xué)功能分析，表明本發(fā)明克隆的PbSUT2基 因具有提早番茄植物開花結(jié)實的功能，在果實的糖積累過程中促進(jìn)蔗糖的顯著積累，提高 成熟果實中蔗糖的比例。
[0021] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：本發(fā)明利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到早花和果實 蔗糖含量提高的植株，突破了傳統(tǒng)育種手段的障礙，為植物果實品質(zhì)基因工程提供了重要 的基因資源。
【附圖說明】
[0022] 圖1為本發(fā)明技術(shù)路線圖。
[0023] 圖2梨PbSUT2編碼蛋白拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)示意圖。
[0024] 圖3為本發(fā)明克隆的梨PbSUT2基因在鴨梨果實發(fā)育過程中的qRT-PCR分析和梨 果實發(fā)育過程中糖分含量變化。a :PbSUT2的相對表達(dá)量；b:鴨梨果實含糖量。
[0025] 圖4為本發(fā)明克隆的梨PbSUT2基因亞細(xì)胞定位載體圖。
[0026] 圖5為本發(fā)明克隆的梨PbSUT2基因的亞細(xì)胞定位。明場（A，D)，暗場（B，E)，疊 加（C，F(xiàn))。（A，B和C)對照空載GFP表達(dá)情況；(D，E和F) PbSUT2-GFP融合表達(dá)載體的定位 圖。
[0027] 圖6為本發(fā)明克隆的梨PbSUT2基因在轉(zhuǎn)基因番茄成熟果實中的表達(dá)量分析圖。 WT :成熟果實；#45、#62、#76 :陽性轉(zhuǎn)PbSUT2基因番茄株系。
[0028] 圖7為本發(fā)明克隆的梨PbSUT2基因的植物超表達(dá)載體構(gòu)建流程圖。
[0029] 圖8為本發(fā)明克隆的梨PbSUT2基因在番茄植株中過量表達(dá)對植株生長的影響。 WT :野生型番茄植株；#45、#62 :陽性轉(zhuǎn)PbSUT2基因番茄株系。a:轉(zhuǎn)基因植株提早開花；b : 轉(zhuǎn)基因植株提早結(jié)果；c :轉(zhuǎn)基因植株果實提前成熟。
[0030] 圖9為本發(fā)明克隆的梨PbSUT2基因在番茄植株過量表達(dá)對葉片凈光合速率的影 響。WT :野生型番茄植株；#45、#62 :陽性轉(zhuǎn)PbSUT2基因番茄株系。不同小寫字母表示轉(zhuǎn) PbSUT2基因株系與野生對照的植株葉片凈光合速率的差異達(dá)到顯著差異（P < 0. 05)。
[0031] 圖10.為本發(fā)明克隆的梨PbSUT2基因在番茄植株過量表達(dá)對果實可溶性糖含 量的影響。WT :野生型番茄植株；#45、#62 :陽性轉(zhuǎn)PbSUT2基因番茄株系。（a):蔗糖含量 (mg · g VW) ; (b):葡萄糖含量（mg · g VW) ; (c):果糖含量（mg · g心）；（d):可溶性總糖含 量（mg · g tW)。不同小寫字母表示轉(zhuǎn)PbSUT2基因株系與野生對照的植株果實含糖量的差 異達(dá)到顯著差異（P < 0. 05)。
【具體實施方式】
[0032] 以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做出詳細(xì)的描述。根據(jù)以下描述和實