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一種微rna表達(dá)載體及應(yīng)用的制作方法

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一種微rna表達(dá)載體及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種微RNA表達(dá)載體及應(yīng)用。本發(fā)明克隆了miR-596表達(dá)基因片段,并構(gòu)建U6-miR-596表達(dá)載體,實(shí)驗(yàn)證明載體能夠抑制肺癌腫瘤細(xì)胞的增殖,對(duì)肺癌腫瘤細(xì)胞的增殖具有殺傷作用,引起肺癌細(xì)胞系的凋亡,為腫瘤的基因治療提供了新的思路。
【專利說(shuō)明】一種微RNA表達(dá)載體及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和基因治療學(xué)領(lǐng)域,尤其涉及的是一種微RNA表達(dá)載體及其在抑制肺癌腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]microRNAs (miRNAs)通常為21-23個(gè)核苷酸,是一類重要的小分子非編碼RNA。miRNAs表達(dá)具有重要作用,控制著細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和凋亡,與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。miRNAs通常是由RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄生成,最初產(chǎn)物是被稱為pr1-miRNA的大的前體分子。pr1-miRNAs在細(xì)胞核內(nèi)被Drosha (RNase III)和雙鏈RNA結(jié)合蛋白Pasha處理成約70m組成的pre-miRNA,該分子為一個(gè)堿基不完全配對(duì)的莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)。RAN-GTP和Exportin5可將pre-miRNA分子輸送到細(xì)胞質(zhì)中。隨后該莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)被Dicer (另一種RNaseIII)加工成約22個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的成熟miRNA雙鏈。接下來(lái)這種成熟的雙鏈miRNA會(huì)很快整合到miRISC復(fù)合體中(復(fù)合體中含有Argonaute蛋白)。成熟miRNA結(jié)合到與其序列互補(bǔ)的mRNA位點(diǎn),通過(guò)兩種依賴 于序列互補(bǔ)機(jī)制負(fù)性調(diào)控靶基因的表達(dá)。其抑制翻譯還是降解發(fā)揮作用是由miRNA和它的目的mRNA之間的錯(cuò)配程度決定的,匹配程度高的目的mRNA將被降解。
[0003]miRNAs可以起到腫瘤抑制基因作用,miR-15a / miR_16可負(fù)調(diào)控BCL2,因此,這兩個(gè)miRNAs的缺失或下調(diào),導(dǎo)致了 BCL2表達(dá)的升高,能促進(jìn)白血病、淋巴瘤和前列腺癌的發(fā)生。let-7c家族的表達(dá)水平在肺癌、卵巢癌、乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞中顯著下調(diào),而且肺癌和乳腺癌中l(wèi)et-7的表達(dá)水平與患者的生存時(shí)間呈正相關(guān)。miR-99也可以作為抑癌miRNA抑制腫瘤的增殖,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的凋亡。但有關(guān)miR-596研究報(bào)道較少,功能還需要進(jìn)一步研究。miRNA作為一種轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)因子與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān),克隆抑癌miRNA基因在腫瘤的基因治療方面具有重要的價(jià)值。
[0004]現(xiàn)有治療肺癌、胃癌和子宮頸癌等腫瘤的方法主要有藥物化療、放療及手術(shù)治療,但是上述的方法都有缺陷,尤其對(duì)于不能手術(shù)治療的患者,化療達(dá)不到滿意的治療效果。
[0005]因此,現(xiàn)有技術(shù)存在缺陷,需要改進(jìn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)在治療腫瘤中存在的缺陷,提供了一種微RNA表達(dá)載體及其在抑制肺癌腫瘤細(xì)胞中的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0008]一種微RNA表達(dá)載體,其特征是,該微RNA表達(dá)載體具有ATTACGCCAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATTCGGGACTTACAGGGAACAGCACAGCCTGGGGGCCATCGCAGATGCCCTCCAGGAAAGCAGGATGCTCTGCAGATAGGACGGCTGTGGCCGCTGCCCCAGGAAACAGCCCAGGACGCTGCCTGAGCTCAGAGGGTTCCGGACACAGACCGCGCTCCCCGCTTTGCAAACCACACCCAGTCCATTTCCTAGTGTGAGTTTGTCTCTACTCATCGGTTTGTGTCTTTATAAGAGTTCTAAAGTAAAACAAAAACACACAAGGACAGTGACCTAGACAGCACCCAGGGATGGGTCGGGTCGGCCTCCGAAGGGCAGCAGCTGCCATGCGGGAGGCAGGTTCCCGAGGAGCCGGGCAGGCTTCGGAGAGGCCGTGCTCGCTTTCCCGACTGTGGCGACGGATCCACCTGCTATGCGTTCCTCAGAACTCACTGAACCGCCCACGTTAATGACGCGCAGTTCGCCGTGTGCCAATGACGCCTCAATCAAGCTGCTAAATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTAC 基因片段。
[0009]所述的微RNA表達(dá)載體在抑制肺癌腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明克隆了 miR-596表達(dá)基因片段,并構(gòu)建U6-miR-596表達(dá)載體,實(shí)驗(yàn)證明載體能夠抑制肺癌腫瘤細(xì)胞的增殖,對(duì)肺癌腫瘤細(xì)胞的增殖具有殺傷作用,引起肺癌細(xì)胞系的凋亡,為腫瘤的基因治療提供了新的思路。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0011]圖1為U6-miR_596表達(dá)載體構(gòu)建不意圖;
[0012]圖2為定量PCR檢測(cè)miR-596表達(dá)。
[0013]圖3為MTT分析對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制情況。
[0014]圖4為A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染載體后細(xì)胞凋亡的檢測(cè)。
[0015]圖5為顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞遷移結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0016]以下結(jié)合具體實(shí)施例,對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0017]本發(fā)明中,所使用的技術(shù),包括基因測(cè)序、PCR擴(kuò)增與檢測(cè)、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、載體構(gòu)建等分子生物學(xué)技術(shù),以及細(xì)胞培養(yǎng)、檢測(cè)技術(shù)等,除非特別說(shuō)明,均為本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù);所使用的儀器設(shè)備、試劑、質(zhì)粒和載體、細(xì)胞系等,除非是本說(shuō)明書(shū)特別注明,均為一般本領(lǐng)域的研究和技術(shù)人員可以通過(guò)公共途徑獲得的。
[0018]實(shí)施例lU6-miR_596表達(dá)載體的構(gòu)建
[0019]設(shè)計(jì)克隆miR-596表達(dá)載體的引物序列,通過(guò)PCR擴(kuò)增miR-596基因,使用儀器為Eppendorf mastercycler gradiemPCR 儀。
[0020]模版為正常人的基因組DNA,提取方法如下:采集Iml外周血,置于1.5ml離心管中(內(nèi)有適量肝素抗凝劑),3000rpm離心5分鐘棄上清。加入800ii I生理鹽水,顛倒混勻,1000rpm離心5分鐘,棄上清,重復(fù)3次。加入相當(dāng)于壓積細(xì)胞5.5倍體積的溶血試劑(裂解紅細(xì)胞用),充分混勻后-20°C靜止lOmin,隨后放入4°C放置30min,此時(shí)溶液變?yōu)橥该鳡罴t棕色。將此溶液1000rpm離心5min,棄上清。加入400 u I STE緩沖液懸浮白細(xì)胞,使之均勻分散。同時(shí)加蛋白酶K(終濃度為IOOiitg / ml)和10% SDS,37°C消化過(guò)夜。加入等體積飽和酹,充分混勻,4°C下13,OOOrpm離心12min ;吸取上清至另管。加入等體積酹/氯仿,充分混勻,4°C下13,OOOrpm離心8min ;吸取上清至另管。加入等體積氯仿/異戍醇(V:V=24:1),充分混勻,4°C下13,OOOrpm離心5min。吸取上清至另管,加I / 10體積的3MNaAc及2倍體積的預(yù)冷無(wú)水乙醇,混勻后-20°C靜置30min,4°C, 13, OOOrpm離心5min,棄上清。加入lml80%乙醇,顛倒混勻,4°C 13,OOOrpm離心5min,棄上清,室溫晾干,加入適量100 u I TE溶解過(guò)夜,分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度和純度,_20°C存放。
[0021]擴(kuò)增條件如下:變性940C 45s,550C 45s、延伸72。。60s,共30個(gè)循環(huán)。上游引物Sence:5' -TAGCAGCTTGATTGAGGCG-3';下游 antisense:5' -CGGGACTTACAGGGAACAG-3'。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝 膠進(jìn)行電泳,分析結(jié)果。然后分別將上述片段連接至pMD-19T(Takara公司)載體上,構(gòu)建miR-596,送至上海博尚生物技術(shù)有限公司測(cè)序,結(jié)果正確(SEQ ID NO:1序列表)。然后,利用BamHI和HindIII兩酶(Takara公司)切位點(diǎn)切T-miR-596及pRNAi_U6.1 / Neo (南京金思特科技有限公司)載體,將miR-596接至pRNA1-U6.1 / neo載體上,得到U6_miR-596載體,用同樣的酶切位點(diǎn),構(gòu)建U6_miR-596載體。載體構(gòu)建流程見(jiàn)圖1。
[0022]實(shí)施例2U6-miR_596載體對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響
[0023]1、細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染
[0024]A549肺癌細(xì)胞用含10%胎牛血清的F12 (GIBICO)培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞購(gòu)自上海中科院細(xì)胞所,于37°C 5% C02培養(yǎng)。[0025]細(xì)胞轉(zhuǎn)染:U6_miR-596質(zhì)粒提取方法按 EndoFree plasmid Maxi kitprotocol (Qigen公司產(chǎn)品)操作。采用六孔培養(yǎng)板培養(yǎng),每孔5X IO5個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染I μ g的質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染方法用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法,質(zhì)粒與脂質(zhì)體的比例為1:3 (I μ g:3 μ I),轉(zhuǎn)染72小時(shí)后,進(jìn)行指標(biāo)的檢測(cè)。
[0026]2、miR-596表達(dá)的檢測(cè)
[0027]miRNA檢測(cè)如下:收集細(xì)胞,應(yīng)用miRNA提取試劑盒(Ambion)提取小RNA,用Polymerase A(Ambion)加尾后進(jìn)行 RT 反應(yīng)(RT 引物:5’-AACATGTACAGTCCATGGATGd (T) 30-3’),分別使用miR-596引物擴(kuò)增相應(yīng)的miRNA,并且用human5S rRNA引物擴(kuò)增作為參照基因(上游引物見(jiàn)表1,下游引物為5’ -AACATGTACAGTCCATGGATG-3’)。擴(kuò)增條件為:94°C 30s ;54°C退火30s;72°C30s,29個(gè)循環(huán)。產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染U6-miR-596載體后,miR-596的表達(dá)量明顯升高。
[0028]定量PCR檢測(cè)miRNA的表達(dá):用ambion公司檢測(cè)試劑盒qRT-PCR miRNA DetectionKit檢測(cè)miRNA表達(dá),步驟參考說(shuō)明書(shū),5srRNA作為參照物。用RG3000系統(tǒng)分析。反應(yīng)體系為20μ I體系,包含上、下游引物、IOX緩沖液、dNTP、高保真DNA聚合酶、SYBR GreenI染料等。定量反應(yīng)條件為94°C 20s,54°C退火20s,72°C 20s,各擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。在每個(gè)循環(huán)的72°C時(shí)測(cè)定熒光量。結(jié)果發(fā)現(xiàn),腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染U6-miR-596載體后,miR-596的表達(dá)量明顯升高。*P〈0.05:與control相比,統(tǒng)計(jì)有顯著差異。(參見(jiàn)圖2)。
[0029]3、細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法
[0030]3.1凋亡細(xì)胞的形態(tài)觀察
[0031]轉(zhuǎn)染U6-miR-596載體48h后。用倒置顯微鏡檢測(cè)A549細(xì)胞的凋亡改變。
[0032]3.2MTT(3_(4,5)-dimethylthiahiazo(_z_yl)_3,5-d1-phenytetrazoIiumromide, SIGMA 公司)
[0033]轉(zhuǎn)染U6-miR_596載體48h后,每孔細(xì)胞中加入MTT溶液10 μ 1,繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí),收集細(xì)胞,4000rpm離心5分鐘,棄去上清液,每孔加DMS0100 μ 1,搖勻后,使用酶標(biāo)儀測(cè)定光密度值(570nm),檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。
[0034]3.3凋亡試劑盒Annexin V-FITC (寶靈曼公司產(chǎn)品)檢測(cè)
[0035]貼壁細(xì)胞用不含EDTA的胰酶消化收集(注:胰酶消化時(shí)間不易過(guò)長(zhǎng),否則容易引起假陽(yáng)性);用PBS洗滌細(xì)胞二次(2000rpm離心5min)收集I~5X IO5細(xì)胞;加入400 μ L的 Binding Buffer 懸浮細(xì)胞;加入 5 μ L Propidium 1dide (PI, SIGMA 公司),混勻;室溫、避光、反應(yīng)5-15min ;在Ihour內(nèi),進(jìn)行下述突光顯微鏡或流式細(xì)胞儀的觀察和檢測(cè)。[0036]3.4流式細(xì)胞檢測(cè)(PI染色)
[0037]用流式細(xì)胞儀檢測(cè),激發(fā)波長(zhǎng)Ex=488nn ;發(fā)射波長(zhǎng)Em=530nm。PI紅色熒光通過(guò)PI通道(FL2或FL3)檢測(cè),使用FL3。熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié):使用未經(jīng)凋亡誘導(dǎo)處理的正常細(xì)胞,作為對(duì)照進(jìn)行熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)去除光譜重疊和設(shè)定十字門(mén)的位置。
[0038]4、腫瘤細(xì)胞凋亡的檢測(cè)結(jié)果
[0039]4.1miRNA對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)及增值的影響
[0040]轉(zhuǎn)染U6-miR-596載體48h后,U6_miR-596表達(dá)組,與對(duì)照相比,細(xì)胞增殖受到明顯的抑制。用MTT檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況,結(jié)果表明:轉(zhuǎn)染U6-miR-596載體組,細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯抑制(圖3)。
[0041]4.2凋亡細(xì)胞PI染色及流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果
[0042]轉(zhuǎn)染U6-miR-596載體48h后,用Annexin V-FITC凋亡試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的凋亡改變,PI染色用來(lái)分析細(xì)胞內(nèi)DNA的斷裂改變。用熒光纖維鏡檢測(cè)細(xì)胞凋亡的改變,在U6-miR-596處理組,細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡。而對(duì)照組細(xì)胞并未出現(xiàn)明顯的凋亡。流式細(xì)胞技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)U6-miR-596處理組,細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡(圖4)。
[0043]4.3Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移結(jié)果
[0044]細(xì)胞轉(zhuǎn)染U6-miR_596載體后,于Transwell板中培養(yǎng)24h,顯微鏡下觀察下觀察遷移的細(xì)胞數(shù)目。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染U6-miR-596組遷到下室的細(xì)胞數(shù)目明顯少于空白對(duì)照組和陰性載體對(duì)照組的細(xì)胞數(shù)目(圖5)。將遷移到下室的細(xì)胞消化,用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)目(均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差)表示,取3次計(jì)數(shù)結(jié)果平均數(shù):空白對(duì)照組568±42.8 ;陰性載體對(duì)照組361±32.1 ;轉(zhuǎn)染U6-miR-596組99±11.5,同樣可見(jiàn)轉(zhuǎn)染U6-miR-596組遷移細(xì)胞數(shù)明顯少于空白對(duì)照組和陰性載體對(duì)照組。`
[0045]表1:檢測(cè)miRNAs所需要的上游引物
PrimersSequence of forward Primers and Tm value
[0046]miR-5965’ -CCTCTCCGAAGCCTGCC-3 ’ TM (53。C)
5sRNA5’ -GCCATACCACCCTGAACG-3 ’ TM(53° C)
[0047]SEQ ID NO: lmiR-596 序列表
[0048]
【權(quán)利要求】
1.一種微RNA表達(dá)載體,其特征是,該微RNA表達(dá)載體具有ATTACGCCAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATTCGGGACTTACAGGGAACAGCACAGCCTGGGGGCCATCGCAGATGCCCTCCAGGAAAGCAGGATGCTCTGCAGATAGGACGGCTGTGGCCGCTGCCCCAGGAAACAGCCCAGGACGCTGCCTGAGCTCAGAGGGTTCCGGACACAGACCGCGCTCCCCGCTTTGCAAACCACACCCAGTCCATTTCCTAGTGTGAGTTTGTCTCTACTCATCGGTTTGTGTCTTTATAAGAGTTCTAAAGTAAAACAAAAACACACAAGGACAGTGACCTAGACAGCACCCAGGGATGGGTCGGGTCGGCCTCCGAAGGGCAGCAGCTGCCATGCGGGAGGCAGGTTCCCGAGGAGCCGGGCAGGCTTCGGAGAGGCCGTGCTCGCTTTCCCGACTGTGGCGACGGATCCACCTGCTATGCGTTCCTCAGAACTCACTGAACCGCCCACGTTAATGACGCGCAGTTCGCCGTGTGCCAATGACGCCTCAATCAAGCTGCTAAATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTAC 基因片段。
2.根據(jù)權(quán)利要 求1所述的微RNA表達(dá)載體在抑制肺癌腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K48/00GK103695464SQ201310533965
【公開(kāi)日】2014年4月2日 申請(qǐng)日期:2013年11月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月4日
【發(fā)明者】王萍玉, 李有杰, 謝書(shū)陽(yáng), 張菡菡, 龐敏, 張超 申請(qǐng)人:濱州醫(yī)學(xué)院
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