構(gòu)建的鯉凋亡基因、載體及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種鯉凋亡基因、載體及其應(yīng)用。所構(gòu)建的鯉凋亡基因，從5’至3’依次由鯉MT?1啟動(dòng)子、鯉Caspase?8小亞基(P10)編碼序列、鯉Caspase?8大亞基(P20)編碼序列、鯉MT?1polyA信號(hào)序列組成。本發(fā)明的所述鯉DNA疫苗載體，包括真核表達(dá)載體及插入在所述真核表達(dá)載體中的上述鯉基因的凋亡基因。本發(fā)明以鯉的MT啟動(dòng)子和Caspase?8為基礎(chǔ)，構(gòu)建誘導(dǎo)型凋亡基因，將其插入pEGFP?N1載體構(gòu)建“自殺性”DNA疫苗載體，該凋亡基因可以響應(yīng)金屬離子(例如Zn2+)等條件的誘導(dǎo)，表達(dá)Caspase?8誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的凋亡，可應(yīng)用于鯉DNA疫苗的制備，以進(jìn)一步提高DNA疫苗的安全性。
【專利說明】
構(gòu)建的繩調(diào)亡基因、載體及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是設(shè)及構(gòu)建的經(jīng)調(diào)亡基因、載體及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] DNA疫苗自問世W來，就W其制備、運(yùn)輸、存膽簡單并且能同時(shí)誘導(dǎo)體液免疫與細(xì) 胞免疫等優(yōu)點(diǎn)成為新型疫苗研究的重要方向。但是DNA疫苗接種后持續(xù)表達(dá)，可能誘導(dǎo)宿主 自身免疫反應(yīng)和免疫耐受，并且增加了疫苗DNA整合到宿主基因組的風(fēng)險(xiǎn)。盡管W甲病毒復(fù) 審巧為基礎(chǔ)的"自殺伴'DNA疫苗極大縮短了疫苗DNA在機(jī)體內(nèi)的存在時(shí)間，但是此類疫苗載 體也存在一些缺點(diǎn)：（1)甲病毒復(fù)制子片段過大(〉化b)，加上質(zhì)粒復(fù)制及篩選、報(bào)告基因等 必要元件，疫苗載體超過1化b，影響了載體容量，并且由于插入外源基因后的DNA疫苗過大， 也增加了疫苗的構(gòu)建難度，并且影響了轉(zhuǎn)染效率。（2)調(diào)亡進(jìn)程無法控制，在接種"自殺性" DNA疫苗后2~5天后，疫苗即被清除，如果能延遲調(diào)亡進(jìn)程，則有可能獲得更好的免疫效果。
[0003] "自殺性"IHNV DNA疫苗的研究為新型疫苗載體構(gòu)建提供了有益的啟示。IHNV是一 種嚴(yán)重危害虹縛(Oncorhynchus mykiss)等魚類的病毒，該病毒編碼6個(gè)蛋白，其中囊膜G蛋 白可W誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，也是目前商品化IHNV DNA疫苗的祀分子（IHNV DNA疫苗已于 2005年7月在加拿大獲準(zhǔn)上市）；基質(zhì)蛋白M(mat;rix protein，M)是IHNV的主要結(jié)構(gòu)蛋白之 一，作為主要毒力因子，可W誘導(dǎo)病毒感染后的細(xì)胞調(diào)亡。Alonso等將M蛋白基因與虹縛金 屬硫蛋白酶基因（metallothionein，MT)的啟動(dòng)子(pMT)結(jié)合，構(gòu)建pMT-M調(diào)亡元件，將其插 入含有IHNV G蛋白基因的DNA疫苗中，構(gòu)建了"自殺性"DNA疫苗。該疫苗可W在金屬離子 (例如化2+)誘導(dǎo)下表達(dá)M蛋白，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡，清除了疫苗DNA。
[0004] 目前，經(jīng)的DNA疫苗載體采用的是普通真核表達(dá)載體，例如pIRES-neo等，運(yùn)些質(zhì)粒 一般包含了在大腸桿菌中的的復(fù)制起點(diǎn)(ori)，抗性篩選標(biāo)記(例如，氨節(jié)霉素抗性基因、新 霉素抗性基因），W及真核細(xì)胞中的啟動(dòng)子(例如，pCMV啟動(dòng)子)等結(jié)構(gòu)。接種后外源基因持 續(xù)表達(dá)，可能誘導(dǎo)宿主自身免疫反應(yīng)和免疫耐受，并且增加了疫苗DNA整合到宿主基因組的 風(fēng)險(xiǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 基于此，本發(fā)明的目的之一是提供一種構(gòu)建的經(jīng)的調(diào)亡基因。
[0006] 實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。
[0007] -種構(gòu)建的經(jīng)調(diào)亡基因，從5'至3'依次由經(jīng)金屬硫蛋白酶基因 l(MT-l)啟動(dòng)子、經(jīng) Caspase-8小亞基（P10)編碼序列、經(jīng)Caspase-8大亞基（P20)編碼序列、經(jīng)MT-lpolyA信號(hào)序 列組成。
[000引在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述經(jīng)的調(diào)亡基因，其堿基序列為如SEQ ID No. 19所示，或 其堿基序列為為SEQ ID No. 19的同義突變序列。
[0009]本發(fā)明的另一目的是提供一種DNA疫苗載體，該DNA疫苗載體，在經(jīng)體內(nèi)可W響應(yīng) Zn2+的誘導(dǎo)，誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡，進(jìn)而清除疫苗載體。
[0010] 實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。
[0011] -種經(jīng)DNA疫苗載體，包括真核表達(dá)載體及插入在所述真核表達(dá)載體中的上述構(gòu) 建的經(jīng)調(diào)亡基因。
[0012] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述真核表達(dá)載體為祀GFP-N1。
[0013] 本發(fā)明的另一目的是提供一種DNA疫苗載體的構(gòu)建方法。
[0014] 實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。
[0015] -種經(jīng)DNA疫苗載體的構(gòu)建方法，包括W下步驟：
[0016] (1)W經(jīng)的組織DNA為模板，WSEQ ID N0.1和SEQ ID ^.2引物，克隆^-1全基因， 并構(gòu)建MT-1質(zhì)粒；
[0017] (2)^經(jīng)的。0魁為模板，^沈9 10顯.3、569 10^.4引物，克隆化3口日36-8〔05， 并構(gòu)建化spase-8質(zhì)粒；
[001引 （3)^11'-1質(zhì)粒、化39日36-8質(zhì)粒為模板，分別^沈9 10側(cè).1、和沈9 10側(cè).5為引 物，克隆^-1的啟動(dòng)子序列；^569 10^.6和569 10^.7為引物進(jìn)行擴(kuò)增，克隆化39日36- 8小亞基編碼序列；WSEQ ID N0.8、SEQ ID ^.9為引物進(jìn)行擴(kuò)增，克隆化39日3日-8大亞基編 碼序列；WSEQIDN0.10、SEQIDN0.2為引物進(jìn)行擴(kuò)增，克隆MTpolyA信號(hào)序列；上述擴(kuò)增 產(chǎn)物經(jīng)PCR純化后，等量加入PCR反應(yīng)體系中，不加引物進(jìn)行擴(kuò)增，得總的擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0019] (4)采用SEQ ID NO. 1USEQ ID NO. 12為引物，步驟(3)中的總的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板， 擴(kuò)增全長的融合片段；
[0020] (5)通過酶切，將純化的步驟(4)所述的全長的融合片段插入到真核表達(dá)載體中， 構(gòu)建得到經(jīng)DNA疫苗載體。
[0021] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述構(gòu)建的經(jīng)調(diào)亡基因或的經(jīng)DNA疫苗載體應(yīng)用。
[0022] 具體技術(shù)方案如下。
[0023] 上述構(gòu)建的經(jīng)調(diào)亡基因在制備經(jīng)DNA疫苗中的應(yīng)用。
[0024] 上述經(jīng)DNA疫苗載體在制備經(jīng)DNA疫苗中的應(yīng)用。
[0025] 本發(fā)明W經(jīng)的MT啟動(dòng)子和化spase-8(含半脫氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶8)為基 礎(chǔ)，構(gòu)建誘導(dǎo)型調(diào)亡基因，將其插入祀GFP-N1載體構(gòu)建"自殺性"DNA疫苗載體，該調(diào)亡元件 可W響應(yīng)金屬離子(例如化2+)等條件的誘導(dǎo)，表達(dá)化spase-8誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的調(diào)亡，W進(jìn)一 步提高DNA疫苗的安全性。
【附圖說明】
[0026] 圖巧"自殺伴' DNA疫苗載體的構(gòu)建示意圖；
[0027] 圖2為調(diào)亡基因構(gòu)成片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果示意圖，其中，M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)； 啟動(dòng)子；2 : Caspase-8小亞基編碼序列；3 : Caspase-8大亞基編碼序列。4 : MT-lpolyA signal。
[002引圖3為調(diào)亡基因的重疊 PCR擴(kuò)增結(jié)果示意圖，M:DNAmarke;r ; 1 iMT-lpromoter、 化spase-8小亞基編碼序列、化spase-8大亞基編碼序列、MT-lpolyA si即al的融合片段。
[0029] 圖4為調(diào)亡基因的核巧酸序列。
[0030] 圖5為"自殺性"載體誘導(dǎo)的NGF-2細(xì)胞調(diào)亡結(jié)果示意圖。
[0031] 圖6為載體免疫后的組織分布結(jié)果示意圖，載體拷貝數(shù)值為106個(gè)宿主細(xì)胞中的檢 測值。
[0032] 圖7為Zn2+誘導(dǎo)20天后的載體拷貝數(shù)檢測結(jié)果示意圖，載體拷貝數(shù)值為lO6個(gè)宿主 細(xì)胞中的檢測值。
[0033] 圖8為化誘導(dǎo)20天后調(diào)亡基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果示意圖，其中M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1~ 5: Zn2+誘導(dǎo)的錦經(jīng);6~10:未誘導(dǎo)的錦經(jīng);+:陽性對照(祀GFP-N1-MTCAS8作為模板）；一:陰 性對照(dd出0作為模板）。
【具體實(shí)施方式】
[0034] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明的實(shí)施方式 不限于此。
[0035] 應(yīng)理解，運(yùn)些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例 中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆：實(shí)驗(yàn)室 手冊（New York:Cold Spring 化rbor Laboratoir Press, 1989)中所述的條件，或按照制 造廠商所建議的條件。實(shí)施例中所用到的各種常用化學(xué)試劑，均為市售產(chǎn)品。
[0036] 本發(fā)明在其中一個(gè)方面，克隆了經(jīng)的金屬硫蛋白酶基因1(MT-1)W及化spase-8的 完整編碼序列（complete CDS),構(gòu)建了誘導(dǎo)型調(diào)亡基因，該基因包含：經(jīng)MT-1啟動(dòng)子、經(jīng) Caspase-8小亞基（P10)編碼序列、經(jīng)Caspase-8大亞基（P20)編碼序列、經(jīng)MT-lpolyA信號(hào)序 列。將該調(diào)亡基因插入祀GFP-N1質(zhì)粒，構(gòu)建了"自殺性"DNA疫苗載體。
[0037] 本發(fā)明在另一個(gè)方面，通過體內(nèi)外試驗(yàn)證實(shí)，該"自殺性"DNA疫苗載體可W響應(yīng) Zn2+的誘導(dǎo)，誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡，進(jìn)而清除疫苗載體。
[003引實(shí)施例1
[0039] 1、材料
[0040] 經(jīng)基因組DNA、cDNA、細(xì)胞株
[0041 ] 經(jīng)基因組DNA提取自經(jīng)腦組織；采用Trizol試劑從監(jiān)419毒株細(xì)胞培養(yǎng)物中提取 RNA，提取的RNA作為模板，參照PrimeScHp愧)lst S化and cDNA合成試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄 第一鏈cDNAdNGF-2細(xì)胞由本研究室保存。錦經(jīng)(20g左右)購自廣州市芳村花鳥魚蟲市場。
[0042]主要試劑
[004；3] PMD18-T 載體試劑盒、PrimeScript?n 1st Strand cDM 合成試劑盒、 巧TARK|GXL DNA聚合酶、Afl n內(nèi)切酶購自IMaRa公司。hizol試劑購自Invihogen 公司。轉(zhuǎn)染試劑Instant FECT購自廣州好芝生物科技有限公司。無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒 購自天根公司。
[0044] 主要儀器
[0045] 羅氏Li曲t切cler 96巧光定量PCR儀，巧光倒置顯微鏡（ZEISS，Axio Observer Al)。
[0046] 2、實(shí)驗(yàn)方法
[0047] 2.1"自殺性"DM疫苗載體的構(gòu)建思路
[004引按照"誘導(dǎo)啟動(dòng)子+調(diào)亡基因"的調(diào)亡元件構(gòu)建策略，本研究W經(jīng)MT-l、Caspase-8 基因?yàn)榛A(chǔ)構(gòu)建調(diào)亡基因，具體包括：經(jīng)MT-1啟動(dòng)子+經(jīng)Caspase-8小亞基編碼序列+經(jīng) 化spase-8大亞基編碼序列+經(jīng)MT-lpolyA信號(hào)序列。將構(gòu)建的調(diào)亡元件插入祀GFP-N1質(zhì)粒， 獲得"自殺性"DM疫苗載體，構(gòu)建流程見圖1。
[0049] 2.2 經(jīng) MT-1 基因與 Caspase-8CDS 的克隆
[00加]W經(jīng)的組織DNA為模板，根據(jù)MT-1基因序列（AF001983)設(shè)計(jì)了MT-1F(SEQ ID N0.1)、MT-1R(SEQ ID騰.2)引物（表6.1)，克隆^-1全基因。^經(jīng)的。0論為模板，根據(jù) 化3口日36-8〔05序列化〔822471)設(shè)計(jì)了化38。1(569 10^.3)、(：日381?(沈9 10^.4)引物（表 6.1)，克隆 Caspase-8CDS。反應(yīng)體系見表 6.2，反應(yīng)程序：941：5111111(預(yù)變性）；941：3〇3,551： 303,721：2111111(35個(gè)循環(huán)）；721：5111111(總延伸）。？〇?產(chǎn)物純化后與91018-1'載體連接，轉(zhuǎn)化大 腸桿菌ToplO,具體操作參照PMD18-T載體說明書進(jìn)行。PCR篩選陽性克隆送上海生工測序。
[0051]表r自殺性"疫苗載體構(gòu)建中的引物
[0054]注:保護(hù)性堿基用斜體標(biāo)出，酶切位點(diǎn)用下劃線標(biāo)出，[005日]表2 PCR反應(yīng)體系（50化）
[0化2]
[0化3]
[0056:
[0057]注：引物序列見表1。
[0化引 2.3。自殺性"調(diào)亡基因的重疊 PCR擴(kuò)增
[0化9]首先W2.2中構(gòu)建的MT-1質(zhì)粒、Caspase-8質(zhì)粒為模板，分別擴(kuò)增經(jīng)MT-1啟動(dòng)子、經(jīng) Caspase-8小亞基（P10)編碼序列、經(jīng)Caspase-8大亞基（P20)編碼序列、經(jīng)MT-lpolyA信號(hào)序 列:反應(yīng)體系參照表2，引物及反應(yīng)程序：
[0060] MT-1F(沈Q ID N0.1)、MT-lPrR(SEQ ID ^.5)克隆腳'-1的啟動(dòng)子序列；]\0'?巧1(^ (沈Q ID N0.6)、LinkP10R(沈Q ID顯.7)克隆化3口日36-8小亞基。10)編碼序列；1^1證？2(^ (沈Q ID N0.8)、P20R(沈Q ID顯.9)克隆0曰3口曰36-8大亞基。20)編碼序列；？2011'化。（沈9 IDN0.10)、MT-lR(SEQIDN0.2)克隆MTpolyA信號(hào)序列；反應(yīng)程序?yàn)椴捎?4°C2min(預(yù)變 性）；941：3〇3,591：9〇3,721：453(35個(gè)循環(huán)）；721：2111111(總延伸）。
[0061] 上述擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)PCR純化后，等量加入50化的PCR體系中，反應(yīng)體系參照表2,不加 引物及模板進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)程序:94°C5min; 94°C30s，59°C30s，72°C2min(15個(gè)循環(huán)）。上述 擴(kuò)增產(chǎn)物1:100稀釋后取1化作為模板，采用MTAFL2F(SEQ ID N0.11)、MTAFL2R(SEQ ID NO. 12)引物（見表1)擴(kuò)增融合片段全長，反應(yīng)體系參照表2,反應(yīng)程序:94°C2min(預(yù)變性）； 94°C30s，60°C90s，72°C90s(35 個(gè)循環(huán)）；72°C2min(總延伸）。
[0062] 2.4"自殺性"DNA疫苗載體的構(gòu)建
[0063] 將Clontech公司的pEGFP-Nl與上述調(diào)亡基因采用Afin內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn) 物純化后進(jìn)行連接反應(yīng)，將調(diào)亡基因插入祀GFP-N1構(gòu)建"自殺性"DNA疫苗載體。該載體命名 為PEGFP-N1-MTCAS8,將載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌ToplO,通過PCR篩選陽性克隆送上海生工測 序。酶切、連接、轉(zhuǎn)化等操作按照常規(guī)方法。
[0064] 2.5 "自殺伴' DNA疫苗載體體外誘導(dǎo)清除試驗(yàn)
[0(?日]采用無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒制備pEGFP-Nl-MTCASS質(zhì)粒，將質(zhì)粒與Instant 陽CT混合后轉(zhuǎn)染NGF-2細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立祀GFP-N1對照組，具體轉(zhuǎn)染步驟參照Instant陽CT轉(zhuǎn) 染試劑說明書。轉(zhuǎn)染后觀察EGFP的表達(dá)情況，轉(zhuǎn)染1周后采用150iiM ZnCb誘導(dǎo)處理，誘導(dǎo)后 巧光顯微鏡觀察統(tǒng)計(jì)細(xì)胞調(diào)亡情況。
[0066] 2.6 "自殺伴' DM疫苗載體體內(nèi)誘導(dǎo)清除試驗(yàn)
[0067] 采用常規(guī)堿裂解法(Sambrook，2005)制備祀GFP-N1-MTCAS8質(zhì)粒，免疫20g左右的 錦經(jīng)，免疫方式為臀罐后緣基部肌肉注射免疫，免疫劑量為化g/尾，免疫2周后采集5尾錦經(jīng) 的觸、腦、屯、、肝、腎、腸、脾、肌肉通過文獻(xiàn)報(bào)道的Taqman PCR方法，W葡萄糖激酶基因 (glucokinase gene)作為內(nèi)參(Gilad et al，2004)，根據(jù)載體中的EGFP基因的拷貝數(shù)，分 析載體的組織分布(Rakus et al，2012);剩余錦經(jīng)分為2組，一組采用50咖ZnS化誘導(dǎo)，另 一組作為對照組，在誘導(dǎo)后20天采集肌肉，提取組織DNA，通過上述real time PCR分析誘導(dǎo) 組與對照組錦經(jīng)的祀GFP-N1-MTCAS8質(zhì)?？截悢?shù)變化，同時(shí)采用MT-1 PrP 1 OF、MT-1R作為上 下游引物(見表1)，擴(kuò)增"自殺性"載體調(diào)亡基因中的重構(gòu)型化spase-8W及MT polyA信號(hào)序 列。
[006引表3化qman PCR引物及探針
[0069]
[0070] 注：引物及探針序列引自文獻(xiàn)報(bào)道(Gilad et al，2004;Rakus et al，2012)。
[0071] 3結(jié)果與分析
[0072] 3.1調(diào)亡基因的構(gòu)建
[0073] 測序證實(shí)，本研究成功克隆了 MT-1全基因與化spase-8CDS。并進(jìn)一步克隆了 MT-1 的啟動(dòng)子、polyAf目號(hào)序列W及化spase-8的小亞基編碼序列、大亞基編碼序列（圖2)。經(jīng)中 存在兩種MT基因:MT-UMT-2,其中MT-1在多種組織中對金屬離子、低溫等的誘導(dǎo)更加敏感。 例如水體中l(wèi)Omg/L的Cu2+或As2+誘導(dǎo)48小時(shí)后，經(jīng)屯、臟MT-lmRNA水平提高了 11~12倍，MT-2 貝1J只提高了 3倍;低溫(5°C )誘導(dǎo)后，經(jīng)肝臟MT-lmRNA水平可W提高4~6倍，MT-2則只提高了 2~3倍;高溫誘導(dǎo)（26°C或29°C)幾乎不會(huì)影響兩者的mRNA水平，低溫誘導(dǎo)MT-lmRNA水平提 高的現(xiàn)象在經(jīng)腦組織中也存在。經(jīng)MT-1啟動(dòng)子全長620bp包含4個(gè)金屬調(diào)節(jié)元件(metal regulato巧element，MRE) W及APl、Spl等轉(zhuǎn)錄因子位點(diǎn)，對MT-1啟動(dòng)子功能進(jìn)行體外研究 證實(shí):2112+細(xì)2\加2\化2+刑2+、化 2+、(：〇2+等均可^誘導(dǎo)該啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄下游的增強(qiáng)型綠色巧 光蛋白巧GFP)報(bào)告基因，例如1.45mM Zn2+誘導(dǎo)48小時(shí)后，EGFP表達(dá)水平提高了20倍W上;除 金屬離子外，該啟動(dòng)子還可W響應(yīng)出化的誘導(dǎo)，1〇〇測的此〇2誘導(dǎo)48小時(shí)后，EGFP表達(dá)水平提 高7.9倍。
[0074] 3.2 "自殺性"DNA疫苗載體的構(gòu)建
[0075] 將經(jīng)MT-1啟動(dòng)子、經(jīng)Caspase-8小亞基（P10)編碼序列、經(jīng)Caspase-8大亞基（P20) 編碼序列、經(jīng)MT-lpolyA信號(hào)序列通過重疊 PCR融合為一條1593bp的片段（圖3)。測序證實(shí)， 該調(diào)亡基因通過Afl n位點(diǎn)成功插入祀GFP-N1載體（圖4)。圖中，引物結(jié)合位點(diǎn)用箭頭標(biāo)出， 引物重疊序列用陰影顯示。起始密碼子(ATG)，終止密碼子(TAA)用粗體標(biāo)出。
[0076] 3.3 "自殺伴' DNA疫苗載體的體外清除
[0077] 。自殺伴'DNA疫苗載體(祀GFP-N1-MTCAS8)轉(zhuǎn)染NGF-2細(xì)胞3天后開始觀察至化GFP 蛋白表達(dá)，經(jīng)化誘導(dǎo)后，轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)入編程性死亡(調(diào)亡）。誘導(dǎo)14天后，誘導(dǎo)組細(xì)胞極少觀 察到巧光信號(hào)，統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)組與對照組的綠色巧光細(xì)胞數(shù)量發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)組細(xì)胞調(diào)亡率（（1-誘 導(dǎo)組綠色巧光細(xì)胞數(shù)量/對照組綠色巧光細(xì)胞數(shù)量）X 100% )為78.6%。
[007引3.4 "自殺伴' DNA疫苗載體的體內(nèi)清除
[00巧]。自殺性"DNA疫苗載體(PEGFP-N1-MTCAS8)免疫錦經(jīng)后主要分布于肌肉、屯、臟、脾 臟等組織（圖6)。免疫1周后，免疫部位(尾柄)肌肉中的載體拷貝數(shù)(每106個(gè)宿主細(xì)胞)在 5.6 X105左右，其他組織器官中的拷貝數(shù)則低于5 X103,載體主要分布于免疫部位的肌肉 中，并且主要集中在免疫部位，預(yù)實(shí)驗(yàn)表明，其他部位肌肉，如背罐前端基部肌肉中的載體 濃度也較低。為確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，本發(fā)明在采集尾柄肌肉時(shí)，選取了臀罐后緣基部與 尾罐基部之間，測線之上的錦經(jīng)體側(cè)(一側(cè)）的全部肌肉，勻漿后選取1 OOmg提取DNA，Taqman PCR顯示，經(jīng)Zn2+誘導(dǎo)后肌肉中的載體拷貝數(shù)顯著降低(P<0.05)(圖7)。由于legman PCR中擴(kuò) 增的載體目的片段長度為177bp，載體降解的碎片中也可能擴(kuò)增到該片段，因此本研究采用 MT-1P巧10F、MT-1R擴(kuò)增祀GFP-N1-MTCAS8中一段較長的片段（996bp)，該片段是Caspase-8 和MT基因的融合片段，避免了PCR中經(jīng)基因組DNA上述兩個(gè)基因的干擾。擴(kuò)增結(jié)果表明，誘導(dǎo) 20天后，載體明顯降解(圖8)。
[0080] W上所述實(shí)施例的各技術(shù)特征可W進(jìn)行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實(shí) 施例中的各個(gè)技術(shù)特征所有可能的組合都進(jìn)行描述，然而，只要運(yùn)些技術(shù)特征的組合不存 在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說明書記載的范圍。
[0081] W上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并 不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來 說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可W做出若干變形和改進(jìn)，運(yùn)些都屬于本發(fā)明的保護(hù) 范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)W所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種構(gòu)建的鯉凋亡基因，其特征在于，從5'至3'依次由鯉金屬硫蛋白酶基因1啟動(dòng) 子、鯉Caspase-8小亞基編碼序列、鯉Caspase-8大亞基編碼序列、鯉MT-1 polyA信號(hào)序列組 成。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述鯉凋亡基因，其特征在于，其堿基序列為如SEQ ID No. 19所示， 或其堿基序列為為SEQ ID No. 19的同義突變序列。3. -種鯉DNA疫苗載體，其特征在于，包括真核表達(dá)載體及插入在所述真核表達(dá)載體中 的權(quán)利要求1或2所述的鯉凋亡基因。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的鯉DNA疫苗載體，其特征在于，所述真核表達(dá)載體為pEGFP-Nl。5. 鯉DNA疫苗載體的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 以鯉的組織DNA為模板，以SEQ ID N0.1和SEQ ID如.2引物，克隆階-1全基因，并構(gòu) 建MT-1質(zhì)粒； (2) 以鯉的cDNA為模板，以SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4引物，克隆Caspase-8 CDS，并構(gòu) 建 Caspase-8 質(zhì)粒； (3) 以MT-1質(zhì)粒、Caspase-8質(zhì)粒為模板，分別以SEQ ID NO. 1、和SEQ ID NO.5為引物， 克隆MT-1的啟動(dòng)子序列；以SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7為引物進(jìn)行擴(kuò)增，克隆Caspase-8小 亞基編碼序列；以SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9為引物進(jìn)行擴(kuò)增，克隆Caspase-8大亞基編碼 序列；以SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO.2為引物進(jìn)行擴(kuò)增，克隆MT polyA信號(hào)序列；上述擴(kuò)增產(chǎn) 物經(jīng)PCR純化后，等量加入PCR反應(yīng)體系中，不加引物進(jìn)行擴(kuò)增，得總的擴(kuò)增產(chǎn)物； (4) 采用SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12為引物，步驟(3)中的總的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，擴(kuò)增 全長的融合片段； (5) 通過酶切，將純化的步驟(4)所述的全長的融合片段插入到真核表達(dá)載體中，構(gòu)建 得到鯉DNA疫苗載體。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述真核表達(dá)載體為pEGFP-Nl。7. 權(quán)利要求1或2所述的鯉凋亡基因在制備鯉DNA疫苗中的應(yīng)用。8. 權(quán)利要求3或4所述鯉的DNA疫苗載體在制備鯉DNA疫苗中的應(yīng)用。9. 一種鯉DNA疫苗，其特征在于，其活性成分包括有權(quán)利要求1或2所述的鯉凋亡基因， 或其活性成分包括有權(quán)利要求3或4所述鯉的DNA疫苗載體。
【文檔編號(hào)】C12N15/63GK106047911SQ201610370499
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年5月27日
【發(fā)明人】劉振興, 柯浩, 郝樂, 馬江耀, 馬艷平, 梁志凌
【申請人】廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所