Cd28基因過表達載體及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及動物基因工程和基因遺傳修飾領域，具體地說，涉及一種⑶28基因過 表達載體及其應用。
【背景技術】
[0002] 哺乳動物及其它脊椎動物在應對外界各種病原微生物侵襲及排除異物維持自身 平衡的過程中，逐漸形成了強有力的免疫保護屏障。包括體液免疫和細胞免疫。T細胞是 大多數免疫反應的核心。識別特異性抗原后，T細胞被活化、增殖、分化，從而具有效應功能 或輔助作用。初始(Nafv'e)T細胞的活化需要來自抗原遞呈細胞的兩種刺激信號。第一種 是TCR/Q33與抗原遞呈細胞（Antigenpresentingcells,APCs)表面特異的MHC-抗原肽 復合物結合產生的特異性的抗原刺激信號；第二種是由T細胞表面的共刺激受體分子和抗 原遞呈細胞（APCs)表面相應的配體結合產生的非特異性的刺激信號。如果缺失第二種信 號，TCR與抗原肽的識別通常導致T細胞的凋亡或無能狀態(tài)（Anergy)。
[0003] ⑶28/B7是免疫球蛋白受體超家族（IgSF)中發(fā)現最早、最為重要的一種信號通 路。⑶28存在于初始：(Maive)⑶4+和⑶8+T細胞表面，與APCs表面的B7-1、B7-2配體結 合，增加E-2的產生，為T細胞的生長、存活提供了重要的共刺激信號，從而阻止細胞進入 無能狀態(tài)（Anergy)或死亡。研究表明，⑶28/B7共刺激信號通過募集脂筏增強T細胞與 APCs細胞相互作用從而起到減少T細胞分泌細胞因子和增殖所需TCR量的作用，也就是說 可以降低T細胞激活所需第一信號的閾值。
[0004]總體來說，以CD28為代表的免疫球蛋白超家族受體介導的共刺激信號，不僅能夠 增強TCR介導的信號，而且對T細胞早期的激活與增殖發(fā)揮重要作用。其主要效應包括：激 活NF-kB、NFAT、AP1等轉錄因子，上調BCL-XL等抗凋亡因子，促進T細胞的活化與存活；上 調表達IL-2、IL-4、IFN-y等細胞因子的表達，促進T細胞的增殖與效應；上調表達IC0S、 0X-40、4_1BB等其他共刺激受體，為T細胞后期的增殖、存活與記憶性T細胞的形成以及二 次應答做準備等。
[0005] 此外，基于小鼠和豬模型發(fā)現，CD28在體外、體內均能夠刺激T細胞的激活、增殖 和效應功能，是潛在的廣譜抗病基因。
[0006] 我國作為養(yǎng)豬大國，豬病疫情嚴重制約了養(yǎng)豬企業(yè)的擴張與發(fā)展。在我國，豬場常 發(fā)的傳染性疾病，如藍耳病、豬圓環(huán)病毒II型感染、豬流感、豬瘟、豬氣喘病、豬大腸桿菌病 和豬附紅細胞體病等，給養(yǎng)豬業(yè)造成極大的危害。然而，我國豬用疫苗的應用尚存在許多問 題，如副反應較大，免疫效果不理想等。而CD28的生物學功能，提示可以通過轉基因的手段 增強豬群的抗病能力。
[0007] CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/ Cas (CRISPR-associated)系統(tǒng)是一種原核生物特有的針對外源性遺傳物質的免疫系統(tǒng)，通 過序列特異的RNA介導，切割降解外源性DNA，包括噬菌體和外源質粒。CRISPR/Cas系統(tǒng) 可以作為一種具有位點特異性的基因編輯系統(tǒng)，其最大的特點是操作簡單、成本低、作用高 效。2013年，科學家首次報道CRISPR/Cas系統(tǒng)在真核細胞上應用成功，隨后，在斑馬魚、果 蠅、小鼠、大鼠、豬中迅速得到應用。CRISPR/Cas系統(tǒng)在靶位點產生雙鏈DNA斷裂（double strandbreak,DSB)，細胞可通過非同源末端連接（non-homologousendjoining,NHEJ)進 行修復，導致基因發(fā)生移碼突變，喪失功能。除此之外，該系統(tǒng)還能與同源重組載體、寡聚核 苷酸共同作用，使靶基因發(fā)生高效的精確修飾。2014年，ScottJG等利用CRISPR/Cas介導 的同源重組在斑馬魚上實現了基因的替換。HuiYang等利用相同的策略一步獲得了帶有報 告基因的小鼠。CRISPR/Cas系統(tǒng)憑借其巨大優(yōu)勢迅速成為基因編輯工具中的佼佼者，在基 因功能研究、疾病模型、基因治療等領域得到廣泛的應用。

【發(fā)明內容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種⑶28基因過表達載體及其應用，即通過基因工程手段 增加宿主CD28基因的拷貝數，從而降低T細胞活化的閾值，增強T細胞的效應功能，達到廣 譜抗病效果。
[0009] 為了實現本發(fā)明目的，本發(fā)明提供的一種⑶28基因過表達載體，其是以目標生物 基因組為模板，PCR擴增R0SA26基因第一內含子的左、右同源臂，⑶28基因表達框，0CT4基 因啟動子，然后將同源左臂，⑶28基因表達框，含LoxP位點的0CT4基因啟動子調控的Cre 表達框和Neo基因表達框，同源右臂以及負篩選標記DTA依次連接，并構建到真核表達載體 上，即得⑶28基因過表達載體。
[0010] 本發(fā)明所述的目標生物包括但不限于豬。
[0011] 優(yōu)選地，本發(fā)明中使用的真核表達載體為pd2EYFP-Nl。
[0012] 其中，PCR擴增得到的R0SA26基因第一內含子的左、右同源臂以及⑶28基因表達 框的核苷酸序列分別如SEQIDNO. 1~3所示；所述含LoxP位點的0CT4基因啟動子調控 的Cre表達框的核苷酸序列如SEQIDN0. 4所示；所述Neo基因表達框的核苷酸序列如SEQ IDN0. 5所示；所述負篩選標記DTA的核苷酸序列如SEQIDN0. 6所示。
[0013] 本發(fā)明還提供所述⑶28基因過表達載體的構建方法，所述方法包括以下步驟：
[0014] (1)以pd2EYFP-Nl為載體骨架，利用酶Ndel和Kpnl插入豬R0SA26基因第一內含 子的同源左臂，同時引入EcoRv酶切位點，得到載體pd2EYFP-5'arm;
[0015] (2)利用酶EcoRV和Kpnl插入CD28基因表達框，得到載體pCD28-5' arm ;
[0016] (3)利用酶EcoRI和NotI將Neo基因表達框與Cre基因連接起來，再利用酶Ndel 和NotI將其連在0CT4基因啟動子下游，組成雙表達框LoxP-0CT4-Cre-3 'UTR-SV40-Ne〇-3 ' UTR-LoxP，利用酶KpnI和No11將上述雙表達框連到載體pCD28-5 ^arm上，同時引入AscI 酶切位點，得到載體pCDOCN-5'arm;
[0017] (4)利用酶AscI和PacI插入豬R0SA26基因第一內含子的同源右臂；
[0018] (5)利用酶PacI和Notl插入DTA基因表達框，構建得到⑶28基因的同源重組載 體p⑶0CNDR，即為⑶28基因過表達載體。
[0019] 其中，用于PCR擴增豬R0SA26基因第一內含子的同源左臂的引物對的核苷酸序列 如SEQIDN0. 7-8所示；用于PCR擴增豬R0SA26基因第一內含子的同源右臂的引物對的核 苷酸序列如SEQIDN0. 9-10所示；用于PCR擴增⑶28基因表達框的引物對的核苷酸序列 如SEQIDN0. 11-12所示；用于PCR擴增0CT4基因啟動子的引物對的核苷酸序列如SEQID NO. 13-14所示；用于PCR擴增Cre表達框的引物對的核苷酸序列如SEQIDNO. 15-16所示。
[0020] 本發(fā)明還提供所述載體在制備抗病轉基因豬中的應用。所述應用具體如下：
[0021] 將所述載體（pCDOCNDR)與特異性靶向豬R0SA26基因第一內含子的CRISPR/Cas9 打靶載體共同轉入豬胎兒成纖維細胞中，獲得定點整合CD28基因的陽性細胞克??；以陽性 克隆為核移植供體細胞，豬卵母細胞為核移植受體細胞，通過體細胞核移植技術獲得克隆 胚胎；將克隆胚胎移入豬子宮內妊娠，即獲得在R0SA26基因第一個內含子定點整合有CD28 基因且自動敲除標記基因的轉基因豬。
[0022] 其中，所述打靶載體中含有特異性靶向豬R0SA26基因第一內含子的sgRNA的編碼 基因序列，編碼所述sgRNA的DNA序列如SEQIDN0. 21和22所示，二者為互補配對的寡聚 核苷酸序列。
[0023] 所述特異性靶向豬R0SA26基因第一內含子的CRISPR/Cas9打靶載體的制備方法 如下：將SEQIDN0. 21和22所示的寡聚核苷酸，在94°C變性5min，然后在37°C退火lOmin， 最后在4°C放置5min;得到的退火產物與經Bbsl酶切過的pX330骨架連接，即得打靶載體。
[0024] 前述的應用，用于鑒定定點整合⑶28基因的陽性細胞克隆的特異性PCR引物組合 如下：
[0025]短臂引物SF:5'-CGCACCCTTACCTTGTCCCA-3'（SEQIDN0.23)，該引物位于同源臂 上游；短臂引物SR:5' -GAAGGTGGGATGGAGGGTGA-3'（SEQIDN0.24)，該引物位于CD28 啟動 子上，PCR擴增產物大小為2500bp。
[0026]長臂引物LF:5' -ACCGCTTCCTCGTGCTTTAC-3'（SEQIDNO. 25)，該引物位于Neo基 因上；長臂引物LR:5' -AGCTGCCTCCTGTGATTACC-3'（SEQIDNO. 26)，該引物位于同源臂下 游，PCR擴增產物大小為8000bp。
[0027] 本發(fā)明首次利用CRISPR/Cas9技術介導⑶28基因同源重組，增加宿主⑶28基因 的拷貝數，從而降低宿主T細胞活化的閾值，增強T細胞的效應功能。該方法成本低，大幅 縮短獲得純合子豬的時間，并保證豬共刺激受體CD28的表達不受基因編輯的影響，為利用 CRISPR/Cas9技術介導⑶28同源重組進行基因功能研究及動物疾病模型建立奠定了基礎。
【附圖說明】
[0028] 圖1為本發(fā)明實施例2CRISPR/Cas9打靶載體的構建過程示意圖。
[0029] 圖2為本發(fā)明實施例3中CD28轉基因豬胎兒成纖維細胞的篩選過程示意圖。
[0030] 圖3為本發(fā)明實施例3中陽性細胞單克隆PCR鑒定引物設計策略示意圖。
[0031] 圖4為本發(fā)明實施例3中陽性細胞單克隆短臂PCR鑒定結果。
[0032] 圖5為本發(fā)明實施例3中陽性細胞單克隆長臂PCR鑒定結果。
[0033] 圖4和圖5中，泳道M為DNA分子量標準（D2000PlusDNALadder)，泳道P為擴 增產物，泳道N為陰性對照。
【具體實施方式】
[0034] 以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明， 實施例均按照常規(guī)實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊（SambrookJ&