本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種T4多聚核苷酸激酶重組酶及其制備方法、表達基因、表達載體以及宿主細胞。

背景技術(shù)：

T4多聚核苷酸激酶(T4 Polynucleotide Kinase，T4 PNK)，是一種多聚核苷酸5'羥基激酶，可以催化ATP的γ位磷酸基團向單鏈或雙鏈DNA、RNA、寡核苷酸或帶有3'磷酸基團的單核苷酸的5'羥基轉(zhuǎn)移。其他NTP也可產(chǎn)生相同的反應：5'-OH+NTP→5'-P+NDP。

上述的磷酸化反應是可逆的。當缺失ATP并且存在ADP的情況下，T4多聚核苷酸激酶可以顯示出5'磷酸酯酶的活性，催化單鏈或雙鏈DNA、RNA、寡核苷酸或帶有3'磷酸基團的單核苷酸的5'磷酸基團向ADP的轉(zhuǎn)移形成ATP。其他NTP也可產(chǎn)生相同的反應：5'-P+NDP→5'-OH+NTP(最適pH為6.4左右)。

當ATP和ADP都適量存在時，T4多聚核苷酸激酶可以催化單鏈或雙鏈DNA、RNA、寡核苷酸或帶有3'磷酸基團的單核苷酸的5'磷酸基團和ATP的γ位磷酸基團之間的交換反應。其他NTP也可產(chǎn)生相同的反應：5'-P+NTP+NDP→5'-P+NDP+NTP。

T4 PNK同時具有3'磷酸酯酶活性，可催化3'磷酸化的多聚核苷酸的去磷酸化：3'-P→3'-OH+Pi(最適pH為5.9左右)。

T4 PNK的激酶活性在C-末端附近，而磷酸酯酶活性在N-末端附近。

T4 PNK應用廣泛，如寡核苷酸、DNA或RNA的5'末端標記，用作Southern、Northern、EMSA等的探針，凝膠電泳的marker，DNA測序引物，PCR引物等；使寡核苷酸、DNA或RNA的5'端磷酸化，確保后續(xù)連接反應順利進行；催化3'磷酸化的單核苷酸的5'磷酸化，使該單核苷酸可以和DNA或RNA的3'末端連接；去除3'端磷酸基團。

作為常用的分子生物學試劑，T4 PNK市場需求量巨大，目前基因工程技術(shù)克隆的重組T4多聚核苷酸激酶在pET系統(tǒng)中表達量高，但是存在如下問題：無可溶性標簽時易表達形成包涵體，通過包涵體復性可得到少量的活性蛋白，但是保存過程中蛋白易聚集形成聚體，形成沉淀，穩(wěn)定性較差；增加可溶性標簽可提高可溶性蛋白的比例，但是純化后的蛋白活性較低，若去除標簽成本較高且得到的活性蛋白穩(wěn)定性較差。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

基于此，有必要提供一種穩(wěn)定性較好并且活性較高的T4多聚核苷酸激酶重組酶。

此外還有必要提供上述T4多聚核苷酸激酶重組酶的制備方法、表達基因、表達載體以及宿主細胞。

一種T4多聚核苷酸激酶重組酶，包括：

(a)、由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列組成的多肽；

(b)、和由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列組成的多肽具有至少98％同源性的多肽；或

(c)、由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列組成的多肽，其中一個或多個氨基酸被缺失、替代或增加。

一種表達基因，包括：

(a)、編碼由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列組成的多肽的多核苷酸，或者所述多核苷酸的互補鏈；

(b)、和編碼由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列組成的多肽的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸，或者所述多核苷酸的互補鏈；

(c)、編碼多肽的多核苷酸或所述多核苷酸的互補鏈，所述多肽由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列組成，其中一個或多個氨基酸被缺失、替代或增加，且所述多肽具有β-葡聚糖內(nèi)切酶活性；或

(d)、編碼多肽的多核苷酸或所述多核苷酸的互補鏈，所述多肽與由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列組成的多肽具有至少98％的同源性。

一種表達基因，包括：

(a)、由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列組成的多核苷酸，或者所述多核苷酸的互補鏈；

(b)、和編碼由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列組成的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸，或者所述多核苷酸的互補鏈；或

(c)、編碼多肽的多核苷酸或所述多核苷酸的互補鏈，所述多核苷酸序列由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列組成，其中一個或多個密碼子被缺失、替代或增加。

一種表達載體，包括上述的表達基因。

在一個實施例中，所述表達載體為pET-28a。

一種宿主細胞，包括上述的基因表達載體，所述宿主細胞為原核生物細胞。

在一個實施例中，所述宿主細胞為大腸桿菌。

在一個實施例中，所述宿主細胞為BL21。

一種T4多聚核苷酸激酶重組酶的制備方法，包括如下步驟：

提供上述的宿主細胞，誘導表達后收集表達完成后的宿主細胞；

對所述表達完成后的宿主細胞進行裂解后離心，保留上清液；以及

將所述上清液純化后得到所述T4多聚核苷酸激酶重組酶。

在一個實施例中，所述誘導表達的操作中，表達溫度為16℃～20℃、誘導劑的終濃度為0.2mM～0.5mM，誘導表達的時間為12h～24h。

這種T4多聚核苷酸激酶重組酶通過基因工程技術(shù)重組得到，經(jīng)過表達后檢測發(fā)現(xiàn)，這種T4多聚核苷酸激酶重組酶的穩(wěn)定性較好并且活性較高。

附圖說明

圖1為實施例2中重組T4 PNK蛋白的SDS-PAGE(12％)分析圖，其中，泳道M為蛋白Marker，泳道1和泳道2為誘導前，泳道3和4為誘導后的全菌蛋白表達，蛋白Marker分子量分別為116kDa、66kDa、45kDa、35kDa、25kDa、18.4kDa和14.4kDa；

圖2為實施例2中重組T4 PNK的SDS-PAGE(12％)分析圖，其中，泳道M為蛋白Marker，泳道1為原酶，泳道2為原酶稀釋5倍，泳道3為原酶稀釋10倍，泳道4為原酶稀釋20倍；

圖3為實施例2中重組T4 PNK和NEB-T4 PNK的活力對比SDS-PAGE(12％)分析圖，其中，用到M為Marker，泳道1為100U，泳道2為200U，泳道3為400U，泳道4為600U。

具體實施方式

為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的具體實施方式做詳細的說明。在下面的描述中闡述了很多具體細節(jié)以便于充分理解本發(fā)明。但是本發(fā)明能夠以很多不同于在此描述的其它方式來實施，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的情況下做類似改進，因此本發(fā)明不受下面公開的具體實施的限制。

本發(fā)明公開了一種T4多聚核苷酸激酶重組酶，包括：

(a)、由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列組成的多肽；

(b)、和由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列組成的多肽具有至少98％同源性的多肽；或

(c)、由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列組成的多肽，其中一個或多個氨基酸被缺失、替代或增加。

這種T4多聚核苷酸激酶重組酶通過基因工程技術(shù)重組得到，經(jīng)過表達后檢測發(fā)現(xiàn)，這種T4多聚核苷酸激酶重組酶的穩(wěn)定性較好并且活性較高。

本發(fā)明還公開了一實施方式的上述T4多聚核苷酸激酶重組酶的表達基因，包括如下：

(a)、編碼由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列組成的多肽的多核苷酸，或者所述多核苷酸的互補鏈；

(b)、和編碼由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列組成的多肽的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸，或者所述多核苷酸的互補鏈；

(c)、編碼多肽的多核苷酸或所述多核苷酸的互補鏈，所述多肽由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列組成，其中一個或多個氨基酸被缺失、替代或增加，且所述多肽具有β-葡聚糖內(nèi)切酶活性；或

(d)、編碼多肽的多核苷酸或所述多核苷酸的互補鏈，所述多肽與由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列組成的多肽具有至少98％的同源性。

本發(fā)明還公開了另一實施方式的上述T4多聚核苷酸激酶重組酶的表達基因，包括如下：

(a)、由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列組成的多核苷酸，或者所述多核苷酸的互補鏈；

(b)、和編碼由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列組成的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸，或者所述多核苷酸的互補鏈；或

(c)、編碼多肽的多核苷酸或所述多核苷酸的互補鏈，所述多核苷酸序列由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列組成，其中一個或多個密碼子被缺失、替代或增加。

本發(fā)明還公開了一實施方式的上述T4多聚核苷酸激酶重組酶的表達載體，包括上述的表達基因。

優(yōu)選的，表達載體為pET-28a。

本發(fā)明還公開了一實施方式的上述T4多聚核苷酸激酶重組酶的宿主細胞，包括上述的基因表達載體，宿主細胞為原核生物細胞。

優(yōu)選的，宿主細胞為大腸桿菌。

更優(yōu)選的，宿主細胞為大腸桿菌為BL21(DE3)(購自美國Invitrogen公司)。

本發(fā)明還公開了一實施方式的上述T4多聚核苷酸激酶重組酶的制備方法，包括如下步驟：

S10、提供上述的宿主細胞，誘導表達后收集表達完成后的宿主細胞。

宿主細胞可以通過如下操作制得：采用基因工程技術(shù)，通過重組T4 PNK原核表達載體構(gòu)建，成功將密碼子優(yōu)化后的T4 PNK基因克隆至帶有His標簽的pET載體中，構(gòu)建了含有上述T4多聚核苷酸激酶重組酶的表達基因的pET載體，測序結(jié)果正確后將上述含有T4多聚核苷酸激酶重組酶的表達基因的pET載體轉(zhuǎn)化到宿主細胞中，并保存在甘油中。

誘導表達的操作中，表達溫度為16℃～20℃(優(yōu)選為18℃)、誘導劑的終濃度為0.2mM～0.5mM(優(yōu)選為0.25mM)，誘導表達的時間為12h～24h(優(yōu)選為16h)。

誘導表達后離心，保留沉淀即為表達完成后的宿主細胞。

S20、對S10得到的表達完成后的宿主細胞進行裂解后離心，保留上清液。

S20具體為：將表達完成后的宿主細胞用冰浴的裂解緩沖液懸浮、混勻后，冰浴超聲裂解細胞，離心并保留上清液。

裂解緩沖液包括50mM Tris、1.5M NaCl、10wt％甘油、0.1wt％Triton X-100、1mM PMSF(苯甲基磺酰氟)和20mM Imidazole(咪唑)，裂解緩沖液的pH為7.5。

S30、將S20得到的上清液純化后得到T4多聚核苷酸激酶重組酶。

S30具體為：上清液通過裂解緩沖液平衡的Ni柱，上樣完成后用裂解緩沖液充分平衡，再用預洗緩沖液充分洗滌；進一步用洗脫緩沖液洗脫蛋白，Ni親和層析已經(jīng)除去了絕大不部分的雜蛋白，離子交換可除去痕量雜蛋白和核酸。

預洗緩沖液包括50mM Tris、0.5M NaCl、10wt％甘油、0.1wt％Triton X-100和100mM Imidazole，預洗緩沖液的pH為7.5。

洗脫緩沖液包括50mM Tris、500mM NaCl、10wt％甘油、0.1wt％Triton X-100和0.5M Imidazole，洗脫緩沖液的pH為7.5。

通過載體構(gòu)建將T4 PNK的基因克隆到pET載體中，在低溫條件下誘導表達，利用低溫、低IPTG濃度提高表達蛋白的可溶比例，利用高鹽裂解緩沖液提高表達蛋白的可溶比例，最終使表達蛋白的可溶性大大增加。另外由于His標簽的加入使T4 PNK的純化更加簡單、方便。

這種T4多聚核苷酸激酶重組酶通過基因工程技術(shù)重組得到，經(jīng)過表達后檢測發(fā)現(xiàn)，這種T4多聚核苷酸激酶重組酶的穩(wěn)定性較好并且活性較高。

以下為具體實施例。

實施例中采用藥物和儀器如非特別說明，均為本領(lǐng)域常規(guī)選擇。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如文獻、書本中所述的條件或者試劑盒生產(chǎn)廠家推薦的方法實現(xiàn)。

實施例1、重組T4 PNK的表達和純化

采用基因工程技術(shù)，通過重組T4 PNK原核表達載體構(gòu)建，成功將密碼子優(yōu)化后的T4 PNK基因克隆至帶有His標簽的pET載體中，構(gòu)建了含有T4多聚核苷酸激酶重組酶的表達基因(序列如SEQ ID No.2所示)的pET載體，測序結(jié)果正確后將上述含有T4多聚核苷酸激酶重組酶的表達基因的pET載體轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)(購自美國Invitrogen公司)中，得到菌種并保存在甘油中。

將100μL上述菌種接種至含50mg/mL卡納青霉素的10mLLB培養(yǎng)基中；培養(yǎng)2-3小時待菌液長至OD600為1.0左右，將菌液分別5mL轉(zhuǎn)接入2瓶含50mg/mL卡納青霉素的500mL LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)3-4小時待菌液長至OD600為0.6左右，加入終濃度為0.25mM的IPTG誘導T4 PNK表達過夜；將表達溫度控制在18℃，誘導16個小時后收集菌體細胞。1L菌液于400mL離心杯中7000rpm，4℃離心3min收集菌體。

收集1L的菌體細胞，用100mL冰浴的裂解緩沖液懸浮、混勻，裂解緩沖液含50mM Tris，1.5M NaCl，10％甘油，0.1％Triton X-100，0.2mM PMSF，pH7.5，20mM Imidazole；冰浴超聲裂解細胞(留樣40μL菌體破碎全液)，離心取上清(留樣40μL菌體破碎上清)，沉淀用等體積裂解緩沖液重懸混勻(留樣40μL菌體破碎沉淀)。裂解上清通過裂解緩沖液平衡的Ni柱，收集流穿液(留樣40μL Ni-穿過)；上樣完成后用裂解緩沖液充分平衡，收集流穿液(留樣40μL Ni-平衡)；再用預洗緩沖液充分洗滌，預洗緩沖液含50mM Tris，0.5M NaCl，10％甘油，0.1％Triton X-100，pH7.5，100mM Imidazole，收集流穿液(留樣40μL Ni-預洗)；進一步用洗脫緩沖液洗脫蛋白，洗脫緩沖液含50mM Tris，500mM NaCl，10％甘油，0.1％Triton X-100，0.5M Imidazole，pH7.5，收集流穿液(留樣40μL Ni-洗脫)，得到重組T4 PNK。Ni親和層析已經(jīng)除去了絕大部分的雜蛋白，離子交換可除去痕量雜蛋白和核酸。

實施例2、SDS-PAGE(12％)蛋白電泳驗證T4 PNK蛋白大小和純度

將實施例1得到的重組T4 PNK進行SDS-PAGE蛋白電泳檢測，鑒定重組T4 PNK的大小和純度。

(1)取樣品各40μL加5×Loading Buffer 10μL，沸水浴10min，同蛋白Marker一起上樣各5μL，濃縮膠恒壓100V，分離膠恒壓180V，考馬氏亮藍染色，得到圖1。

(2)將T4 PNK原酶液分別稀釋5倍、10倍、20倍，將稀釋后酶液及原酶液各40μL加5×Loading Buffer 10μL，沸水浴10min，上樣10μL，濃縮膠恒壓100V，分離膠恒壓180V，考馬氏亮藍染色，得到圖2。

(3)以NEB的商品化T4 PNK(NEB-T4 PNK)為對比，將實施例1制得的得到的重組T4 PNK和NEB-T4 PNK分別梯度稀釋，取樣品各40μL加5×Loading Buffer 10μL，沸水浴10min，同蛋白Marker一起上樣各5μL，濃縮膠恒壓100V，分離膠恒壓180V，考馬氏亮藍染色，得到圖3。

SDS-PAGE(12％)分析結(jié)果表明：

(1)請參考圖1，各電泳條帶在濃縮膠中被壓成一條直線；從圖1中條帶位置，結(jié)合測序結(jié)果初步判斷，重組T4 PNK大小正確；18℃、0.25mM IPTG誘導，重組T4 PNK表達量可達到10％以上，可溶性可達到80％以上。

(2)Ni親和層析已經(jīng)除去了絕大部分的雜蛋白，離子交換可除去痕量雜蛋白和核酸。

(3)請參考圖2，比較原酶中雜帶與稀釋后主帶的強度。若原酶中雜帶強度<稀釋后主帶的強度，則重組T4 PNK純度大于95％，膠面背景干凈，樣品條帶清晰，純度合格。由圖2可以看出，純化得到的重組T4 PNK的分子量在35kDa左右，蛋白純度大于95％。

(4)請參考圖3，實施例1得到的重組T4 PNK表現(xiàn)出的酶活力與NEB的商品化酶相近，比活約為10U/μg。

(5)1L的發(fā)酵液可得到約1L的10U/μL T4 PNK工作液。

實施例3、重組T4 PNK酶的活性測定

重組T4 PNK酶的活性測定采用[γ-³²P]ATP摻入法進行定量分析，具體流程參考文獻：Richardson,C.C.(1971)Procedures in Nucleic Acids Res.,2,815-826

活性定義為：以Micrococcal Nuclease處理的小牛胸腺DNA為底物，在37℃，pH7.6的條件下，30分鐘內(nèi)使1nmol的[γ-³²P]ATP摻入酸不溶性沉淀物所需要的酶量定義為1個活性單位(unit)。

以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應以所附權(quán)利要求為準。

SEQUENCE LISTING

<110> 菲鵬生物股份有限公司

<120> T4多聚核苷酸激酶重組酶及其制備方法、表達基因、表達載體以及宿主細胞

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 301

<212> PRT

<213> T4多聚核苷酸激酶重組酶

<400> 1

Met Lys Lys Ile Ile Leu Thr Ile Gly Cys Pro Gly Ser Gly Lys Ser

1 5 10 15

Thr Trp Ala Arg Glu Phe Ile Ala Lys Asn Pro Gly Phe Tyr Asn Ile

20 25 30

Asn Arg Asp Asp Tyr Arg Gln Ser Ile Met Ala His Glu Glu Arg Asp

35 40 45

Glu Tyr Lys Tyr Thr Lys Lys Lys Glu Gly Ile Val Thr Gly Met Gln

50 55 60

Phe Asp Thr Ala Lys Ser Ile Leu Tyr Gly Gly Asp Ser Val Lys Gly

65 70 75 80

Val Ile Ile Ser Asp Thr Asn Leu Asn Pro Glu Arg Arg Leu Ala Trp

85 90 95

Glu Thr Phe Ala Lys Glu Tyr Gly Trp Lys Val Glu His Lys Val Phe

100 105 110

Asp Val Pro Trp Thr Glu Leu Val Lys Arg Asn Ser Lys Arg Gly Thr

115 120 125

Lys Ala Val Pro Ile Asp Val Leu Arg Ser Met Tyr Lys Ser Met Arg

130 135 140

Glu Tyr Leu Gly Leu Pro Val Tyr Asn Gly Thr Pro Gly Lys Pro Lys

145 150 155 160

Ala Val Ile Phe Asp Val Asp Gly Thr Leu Ala Lys Met Asn Gly Arg

165 170 175

Gly Pro Tyr Asp Leu Glu Lys Cys Asp Thr Asp Val Ile Asn Pro Met

180 185 190

Val Val Glu Leu Ser Lys Met Tyr Ala Leu Met Gly Tyr Gln Ile Val

195 200 205

Val Val Ser Gly Arg Glu Ser Gly Thr Lys Glu Asp Pro Thr Lys Tyr

210 215 220

Tyr Arg Met Thr Arg Lys Trp Val Glu Asp Ile Ala Gly Val Pro Leu

225 230 235 240

Val Met Gln Cys Gln Arg Glu Gln Gly Asp Thr Arg Lys Asp Asp Val

245 250 255

Val Lys Glu Glu Ile Phe Trp Lys His Ile Ala Pro His Phe Asp Val

260 265 270

Lys Leu Ala Ile Asp Asp Arg Thr Gln Val Val Glu Met Trp Arg Arg

275 280 285

Ile Gly Val Glu Cys Trp Gln Val Ala Ser Gly Asp Phe

290 295 300

<210> 2

<211> 906

<212> DNA

<213> T4多聚核苷酸激酶重組酶的表達序列

<400> 2

atgaaaaaga ttattttgac tattggctgt cctggttctg gtaagagtac ttgggctcgt 60

gaatttattg ctaagaatcc cgggttttat aatatcaatc gtgatgacta tcgccaatct 120

attatggcgc atgaagaacg cgatgagtac aagtatacca aaaagaaaga aggtatcgta 180

actggtatgc agtttgatac agctaaaagt attctgtacg gtggcgattc tgttaaggga 240

gtaatcattt cagatactaa cctgaatcct gaacgtcgcc tagcatggga aacttttgcc 300

aaagaatacg gctggaaagt tgaacataaa gtgtttgatg ttccttggac tgaattggtt 360

aaacgtaact caaaacgcgg aactaaagca gtaccaattg atgttttacg ttcaatgtat 420

aaaagcatgc gagagtatct cggtcttcca gtatataatg ggactcctgg taaaccaaaa 480

gcagttattt ttgatgttga tggtacacta gctaaaatga atggtcgtgg tccttatgac 540

cttgaaaaat gcgataccga tgttatcaat cctatggttg ttgaactgtc taagatgtat 600

gctcttatgg gttatcaaat cgtagtcgtt tcaggtcgtg aaagtggaac taaagaagac 660

ccaacgaaat attatcgtat gacccgtaaa tgggttgagg acattgctgg cgttccatta 720

gttatgcaat gtcagcgcga acaaggcgat acccgtaaag acgatgtagt taaagaagaa 780

attttctgga aacacattgc accgcatttt gacgtgaaat tagctattga tgaccgaact 840

caagtagttg aaatgtggcg tcgtatcggt gttgaatgct ggcaagtcgc ttcgggagat 900

ttttaa 906