專利名稱：新型脫氧核苷激酶多底物變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新型多底物脫氧核糖核苷激酶的變體。更具體地，本發(fā)明提供來源于昆蟲或低等脊椎動(dòng)物，特別是來自黑腹果蠅(Drosphila melanogaster)，來自家蠶(Bombyx mori)，或者來自滑爪蟾(Xenopus laevis)的新型脫氧核糖核苷激酶變體，編碼多底物脫氧核糖核苷激酶變體的新型多核苷酸，含有該多核苷酸的載體構(gòu)建體，含有該多核苷酸或載體的宿主細(xì)胞，使細(xì)胞對前體藥物敏感的方法，抑制恒溫動(dòng)物中病原體的方法，以及含有本發(fā)明的脫氧核糖核苷激酶變體的藥物組合物。
來自各種生物的脫氧核糖核苷激酶的不同之處在于其底物特異性，基因表達(dá)的調(diào)控以及細(xì)胞定位。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，具有四種酶，這四種酶的特異性相互重疊，胸腺嘧啶脫氧核苷激酶1(TK1)和2(TK2)，脫氧胞嘧啶核苷激酶(dCK)和脫氧鳥嘌呤核苷激酶(dGK)，磷酸化嘌呤以及嘧啶脫氧核糖核苷。TK1和TK2是嘧啶特異性并且能夠使脫氧尿嘧啶核苷(dUrd)和胸腺嘧啶核苷(dThd)磷酸化，并且TK2還能夠使脫氧胞嘧啶核苷(dCyd)磷酸化。dCK使dCyd，脫氧腺嘌呤核苷(dAdo)以及脫氧鳥嘌呤核苷(dGuo)磷酸化，但不能使dThd磷酸化。dGK使dGuo以及dAdo磷酸化。TK1是細(xì)胞液酶，而TK2和dGK存在于線粒體中，盡管最近有報(bào)道顯示TK2也存在于胞液中。
在原核生物細(xì)胞中，脫氧核糖核苷激酶的模式并不十分清楚。在大腸桿菌(E.coli)中，似乎只存在一種脫氧核糖核苷激酶，其與哺乳動(dòng)物的TK1相似，具有TK的特征。似乎缺乏結(jié)合dCyd，dAdo以及dGuo的能力。在嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)中，其缺乏核糖核苷酸還原酶，這四種脫氧核糖核苷是通過三種酶磷酸化。除了類似于大腸桿菌TK的TK，還存在兩種激酶復(fù)合物，其能夠使dCyd，dAdo以及dGuo磷酸化。復(fù)合物I是dCK/dAK，復(fù)合物II是dGK/dAK。
有幾種病毒攜帶TK基因。皰疹(Herpes)病毒具有TK，其能夠使dCyd以及TMP和dCMP磷酸化。底物特異性相對廣泛的皰疹激酶與哺乳動(dòng)物TK2，dCK和dGK具有許多共同的特征。痘病毒編碼的TK與哺乳動(dòng)物TK1非常相似。
但是，到目前為止，沒有任何已知的病毒，細(xì)菌或真核脫氧核糖核苷激酶顯示出能夠使所有的四種脫氧核糖核苷磷酸化的能力。
最近，從黑腹果蠅(Drosophila melnogaster)中分離出了一種脫氧核糖核苷激酶，并命名為黑腹果蠅脫氧核糖核苷激酶Dm-dNK[Munch-Petersen B，Piskur J，和Sondergaard LFourDeoxynucleoside kinase Activities from Drosophilamelanogaster Are Contained within a Single Monomeric Enzyme，a New Multifunctional Deoxynucleoside Kinase；J.Biol.Chem.(生物學(xué)化學(xué)雜志)1998 273(7)3926-3931]。接下來克隆了相應(yīng)的基因并過表達(dá)[Munch-Pertersen B，Knecht W，Lenz C，Sondergaard L和Piskur J；Functional expression of amulti-substrate deoxyribonuceoside kinase from Drosophilamelanogaster and its C-terminal deletion mutants；J.Biol.Chem.2000 275(9)6673-6679]。
果蠅激酶具有使四種脫氧核糖核苷磷酸化的能力。這與所有已知的具有盡管部分重疊但不相同的底物特異性的脫氧核糖核苷激酶形成鮮明對比。
Dm-dNK催化的脫氧核糖核苷磷酸化的催化率依賴于底物，比報(bào)道的任何一種哺乳動(dòng)物脫氧核糖核苷激酶要高4-20,000倍。胸腺嘧啶脫氧核苷的轉(zhuǎn)化率比單純皰疹病毒1(HSV1)胸腺嘧啶核苷激酶(TK)催化的高70倍。進(jìn)一步地，Dm-dNK還能夠使很大范圍的核苷類似物磷酸化，這些核苷類似物用于癌癥的化學(xué)療法或?qū)共《靖腥?。Dm-dNK獨(dú)特的動(dòng)力學(xué)屬性使得該酶在生物技術(shù)和藥物應(yīng)用中倍受矚目。
例如，測序中所用的ddNTPs以及PCR反應(yīng)所用的dNTPs是利用有毒的化學(xué)物質(zhì)通過化學(xué)合成產(chǎn)生的，導(dǎo)致大量副產(chǎn)品。有效酶促合成(雙)脫氧核糖核苷的單磷酸會(huì)成為酶法生產(chǎn)核苷酸產(chǎn)品中一個(gè)關(guān)鍵的步驟，Dm-dNK廣泛的底物可接受性以及高催化率使其成為該項(xiàng)任務(wù)的明顯備選物質(zhì)。
另外一個(gè)例子是在癌癥的基因治療中或者病毒感染的基因藥物調(diào)整治療中將脫氧核糖核苷激酶作為自殺基因。這里的基本概念就是利用編碼HSV1-TK的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)癌癥或病毒感染的細(xì)胞并繼而將其暴露于核苷類似物。轉(zhuǎn)導(dǎo)的激酶將會(huì)增強(qiáng)核苷類似物對于細(xì)胞毒性的或者抗病毒化合物的活化作用。這個(gè)概念說明了與HSV1-TK，人類脫氧胞嘧啶核苷激酶(dCK)和人類脫氧鳥嘌呤核苷激酶(dGK)相結(jié)合，增強(qiáng)細(xì)胞毒的或抗病毒的核苷類似物的效果。多數(shù)核苷類似物的活化關(guān)鍵步驟是轉(zhuǎn)化為單磷酸形式。
所以，催化這個(gè)步驟的該酶的動(dòng)力學(xué)屬性對于這些藥物的效力和選擇性是十分重要的，為進(jìn)一步完善該治療概念有必要鑒定出更好的酶。具有這個(gè)獨(dú)特動(dòng)力學(xué)屬性的Dm-dNK已經(jīng)被設(shè)想為用作該目的的備選物[Johansson M，Van Rompay A R，Degreves B，Balzarini J和Karlsson ACloning and characterization of the multisubstratedeoxynuceloside kinase of Drosophila melanogaster，J.Biol.Chem.1999 274(34)23814-23819；以及Munch-Petersen等；J.Biol.Chem.2000 275(9)6673-6679]。
最近，在一項(xiàng)尋找更好的用于基因治療的自殺基因-前體藥物組合的研究中，通過引物介導(dǎo)的隨機(jī)誘變或DNA家族改組(shuffling)而對HSV1-TK突變體進(jìn)行了基因操作，其對核苷類似物3’-疊氮-2’，3’-雙脫氧胸腺嘧啶核苷(齊多夫定，Retrovir，AZT)，更昔洛韋(Cytovene，GCV)以及阿昔洛韋(Zivirax，ACV)的特異性有所改進(jìn)[Black M E，Newcomb T G，Wilson H M P以及Loeb L ACreationof drug-spacific herpes simplex Virus type 1 thymidine kinasemutants for gene therapy；Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美國國家科學(xué)院院刊)1996 93 3523529；Christians F C，Scapozza L，Crameri A，F(xiàn)olkers G和Stemmer W P CDirected evolution ofthymidine kinase for AZT phosphorylation using DNA familyshuffling；Nat.Biotechnol.1999 17 259-264；以及Kokoris M S，Sabo P，Adman E T和Black M EEnhancement of tumor ablationby a selected HSV-1 thymidine kinase mutant；Gene Therapy(基因治療)1999 6 1415-1426]。
在2’-脫氧核糖部分有所改變的核苷類似物是醫(yī)學(xué)中很重要的藥物并且是生物技術(shù)中頻繁使用的核苷酸前體。
相應(yīng)地，在其第一個(gè)方面，本發(fā)明提供分離的，突變的多核苷酸，其編碼多底物脫氧核糖核苷激酶，該突變的多核苷酸，當(dāng)其相較于不突變的多核苷酸時(shí)，在轉(zhuǎn)化到細(xì)菌或真核細(xì)胞中之后，使至少一種核苷類似物的致死劑量(LD100)降低了至少4倍。
本發(fā)明另一方面提供分離的脫氧核糖核苷激酶變體，該變體由本發(fā)明的多核苷酸編碼。
本發(fā)明的第三個(gè)方面提供含有本發(fā)明多核苷酸的載體構(gòu)建體。
本發(fā)明的第四個(gè)方面提供能夠產(chǎn)生含有本發(fā)明病毒載體的傳染性毒粒的包裝細(xì)胞系。
本發(fā)明的第五個(gè)方面提供含有本發(fā)明突變多核苷酸或本發(fā)明載體的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的第六個(gè)方面提供使細(xì)胞對藥物敏感的方法，該方法包括用本發(fā)明多核苷酸序列轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞的步驟，該序列編碼一種促進(jìn)所述前體藥物轉(zhuǎn)化為(細(xì)胞毒性)藥物的酶；以及遞送所述前體藥物到所述細(xì)胞的步驟；其中所述細(xì)胞對于所述(細(xì)胞毒性)藥物比所述前體藥物更為敏感。
本發(fā)明的第七個(gè)方面，本發(fā)明提供抑制恒溫動(dòng)物中病原體的方法，該方法包括向所述動(dòng)物施用本發(fā)明的突變多核苷酸，或者本發(fā)明的載體。
本發(fā)明的第八個(gè)方面提供含有本發(fā)明突變多核苷酸或者本發(fā)明載體的藥物組合物。
本發(fā)明的第九個(gè)方面提供含有本發(fā)明酶變體以及藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑的藥物組合物。
通過下述詳細(xì)的說明以及實(shí)施例，本發(fā)明的其他目的對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。發(fā)明詳述突變多核苷酸本發(fā)明首先提供分離的，突變的多核苷酸，其編碼昆蟲或低等脊椎動(dòng)物脫氧核糖核苷激酶。
本發(fā)明突變的多核苷酸包括DNA，cDNA和RNA序列，以及反義序列，包括天然存在的，合成的以及有意操作的多核苷酸。本發(fā)明的突變多核苷酸還包括遺傳密碼簡并性的序列。
此處所定義的，術(shù)語“多核苷酸”指長度上至少有10個(gè)堿基的核苷酸多聚形式，優(yōu)選15個(gè)核苷酸長度。“分離的多核苷酸”是指與兩個(gè)編碼序列未直接相連的多核苷酸，而在其所來自的有機(jī)體的天然基因組中，該多核苷酸與這兩個(gè)編碼序列是直接相連的(一個(gè)在5’端，一個(gè)在3’端)。所以該術(shù)語包括被并入了表達(dá)載體，或自主復(fù)制的質(zhì)粒或病毒，或者原核生物或真核生物基因組DNA中的重組DNA，或者獨(dú)立于其他序列作為分離的分子如cDNA存在的重組DNA。
此處所定義的突變多核苷酸是相較于未突變的(天然，野生型或親本)核苷酸序列在一個(gè)或多個(gè)核苷酸位點(diǎn)有所區(qū)別的核苷酸序列。本發(fā)明的突變多核苷酸還可以特別含有編碼核苷激酶變體的核苷酸序列，該激酶變體相較于天然的，野生型或者親本激酶，具有在一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)有所改變的氨基酸序列。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該突變多核苷酸含有編碼核苷激酶變體的核苷酸序列，該變體具有在非基序區(qū)域，和/或僅在一個(gè)基序區(qū)域的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)改變了的氨基酸序列，如下面表1中所詳細(xì)說明的。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的突變多核苷酸在轉(zhuǎn)化到細(xì)菌或真核生物細(xì)胞中之后，相較于未突變的(野生型)多核苷酸，能夠使至少一種核苷類似物的致死劑量降低至少4倍，更優(yōu)選至少8倍，最優(yōu)選至少10倍。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，該核苷類似物是阿昔洛韋(9-[2-羥基-乙氧基]-甲基-鳥嘌呤核苷)，布昔洛韋，泛昔洛韋，更昔洛韋(9-[2-羥基-1-(羥甲基)乙氧基甲基]-鳥嘌呤核苷)，噴昔洛韋，伐昔洛韋(valciclovir)，三氟胸苷，AZT(3’-疊氮-3’-胸苷)，AIU(5’-碘-5’-氨基-2’，5’-雙脫氧尿苷)，ara-A(腺苷-阿拉伯糖苷(adenosine-arabinoside)；Vivarabine)，ara-C(胞苷-阿拉伯糖苷(cytidine-arabinoside))，ara-G(9-β-D-阿拉伯呋喃糖基鳥嘌呤)，ara-T，1-β-D-阿拉伯呋喃糖基胸腺嘧啶，5-乙基-2’-脫氧尿苷，5-碘-5’-氨基-2，5’-雙脫氧尿苷，1-[2-脫氧-2-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖基]-5-碘尿嘧啶，碘苷(5-碘-2’脫氧尿苷)，氟達(dá)拉濱(2-氟腺嘌呤9-β-D-阿拉伯呋喃糖苷)，吉西他濱(gencitabine)，2’，3’-雙脫氧次黃嘌呤核苷(ddI)，2’，3’-雙脫氧胞苷(ddC)，2’，3’-雙脫氧胸苷(ddT)，2’，3’-雙脫氧腺苷(ddA)，2’，3’-雙脫氧鳥苷(ddG)，2-氯-2’-脫氧腺苷(2CdA)，5-氟脫氧尿苷，BVaraU((E)-5-(2-溴乙烯基)-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基尿嘧啶)，BVDU(5-溴乙烯基-脫氧尿苷)，F(xiàn)IAU(1-(2-脫氧-2-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-碘尿嘧啶)，3TC(2’-脫氧-3’-硫雜胞苷(thiacytidine))，dFdC吉西他濱(2’，2’-雙氟脫氧胞苷)，dFdG(2’，2’-雙氟脫氧鳥苷)或者d4T(2’，3’-雙脫氫-3’-脫氧胸苷)。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的突變多核苷酸在轉(zhuǎn)化到細(xì)菌或真核細(xì)胞中之后，能夠使至少兩種不同的核苷類似物的致死劑量(LD100)降低至少4倍，優(yōu)選至少8倍，最優(yōu)選至少10倍，該類似物是基于兩種不同的糖部分以及兩種不同的堿基部分。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的突變多核苷酸具有SEQ IDNOS9或11所顯示的DNA序列。
酶變體本發(fā)明的另一方面提供基本上純的脫氧核糖核苷激酶變體。
在本發(fā)明中，術(shù)語“酶變體”包括具有在一個(gè)或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)不同于天然，親本或野生型酶的氨基酸序列的多肽(或蛋白)，即，其一級(jí)氨基酸序列是被修飾的。這種酶變體包括下面更加詳細(xì)描述的變體，和保守替換，拼接變體，同I型，來源于其他物種的同系物以及多態(tài)性。
本發(fā)明的新型酶變體特別可使用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)，從本發(fā)明的突變多核苷酸來制備。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的酶變體來自多底物激酶。此處定義，術(shù)語“多底物”指能夠使所有四種天然核苷dC，dA，dG和dT(Thd)磷酸化的脫氧核糖核苷激酶。使所有四種天然核苷磷酸化的能力可以通過對dT的最大酶比活(酶活性/酶量)和對這些核苷的任一種的最大酶比活之比(對dT的最大酶比活/對dC，dG或dA的最大酶比活)進(jìn)行鑒定。該比率范圍優(yōu)選0.01-100。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，與野生型酶相比，本發(fā)明酶變體在下列方面被改變(i) 比率“kcat/Km(底物)/kcat/Km(核苷類似物)”(即兩邊之間的比率，其中一邊是至少一種天然底物的“kcat/Km”，另一邊是至少一種核苷類似物的“kcat/Km”)被降低了至少5倍，更優(yōu)選至少10倍，最優(yōu)選至少20倍；和/或(ii)如使用2或10μM胸苷(dThd)作為底物通過其IC50值所檢測到的，脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)特別是胸苷三磷酸(TTP)的反饋抑制，被降低了至少1.5倍，更優(yōu)選至少2倍。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的酶變體相較于野生型酶，使至少2種不同核苷類似物的的致死劑量(LD100)降低了至少4倍，優(yōu)選至少8倍，最優(yōu)選至少10倍，該類似物類似性基于兩種不同的糖部分和兩種不同的堿基部分。
dNK編號(hào)系統(tǒng)(Numbering system)在本發(fā)明中，使用已建立的單字母符號(hào)指代氨基酸殘基(還有核酸堿基)。
通過比對已知的脫氧核糖核苷激酶的氨基酸序列，可以利用特定的氨基酸編號(hào)系統(tǒng)，通過該系統(tǒng)可以清楚地給任何已知氨基酸序列的核苷激酶的任意氨基酸殘基分派一個(gè)氨基酸位置號(hào)碼。
這種比對如下面表1所示。該表中，Dm-dNK的最初N-末端氨基酸殘基(即蛋氨酸；M)對應(yīng)號(hào)碼51，而Dm-dNK的最后C-末端氨基酸殘基(即精氨酸；R)對應(yīng)號(hào)碼358。
在本發(fā)明中，該編號(hào)系統(tǒng)被命名為dNK編號(hào)系統(tǒng)。
在對各種本發(fā)明產(chǎn)生的或期望的酶變體描述中，為簡化引用而改編下述命名原始氨基酸/位置/替代的氨基酸根據(jù)這個(gè)命名，在167號(hào)位置由纈氨酸變?yōu)楸彼岬奶鎿Q被標(biāo)明為“V167A”。
在51位置蛋氨酸的缺失被標(biāo)明為“M51*”。
一個(gè)額外氨基酸例如精氨酸插入到，例如鄰接62的位置，可以被標(biāo)明為“T62TR”或者“*63R”(假設(shè)為建立編號(hào)系統(tǒng)所使用的氨基酸序列中并沒有該位點(diǎn)的位置)。
一個(gè)氨基酸殘基例如谷氨酰胺插入到已建立的編號(hào)系統(tǒng)中的一個(gè)位置，但是事實(shí)上該位置不存在氨基酸殘基，可以標(biāo)明為“-116Q”。
通過這種方法“Dm-dNK/I199M/N216S/M217V/D316N”限定了這個(gè)特定的變體，其可以是來自黑腹果蠅脫氧核糖核苷激酶，其中在199位由蛋氨酸替換了異亮氨酸，在216位由絲氨酸替換了天冬酰胺，在217位由纈氨酸替換了蛋氨酸，在316位由天冬酰胺替換了天冬氨酸，這些位置依據(jù)下面的表1來確定。表1多序列比對dNK編號(hào)Dm-dNK---------- ---------- ---------- ---------- ---------- MAEAASCARK 060BmK ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------XenK MSVLLAARTC IRLCCTEHKT GALARFNLGA NTALTVRRIA SALCG-RCNI MRRGILPSGShu-TK2---------- ---------- ---------- ---------- ---------- --MGAFCQRPhu-dGK---------- ---------- ---------- --MAAGRLFL SRLRA-PFSS MAKSPLEGVShu-dCK---------- ---------- ---------- ---------- ---------- MATPPKRSCPHSV1-TK ---------- ---------- ----MASYPG HQHASAFDQA ARSRGHSNRR TALRPRRQQEDm-dNKGT-KYAEGTQ P--FTVLIEG NIGSGKTTYL NHFEKY--KN DICLLTEPVE KWRNV----- 120BmK ---MSANNVK P--FTVFVEG NIGSGKTTFL EHFRQF--E- DITLLTEPVE MWRDL-----XenK TGNGLKSREK S--TVICVEG NIASGKTSCL DYFSNT--P- DLEVFKEPVA KWRNV-----hu-TK2SSDKEQEKEK K--SVICVEG NIAGGKTTCL EFFSNA--T- DVEVLTEPVS KWRNV-----hu-dGKSSRGLHAGRG P--RRLSIEG NIAVGKSTFV KLLTKT--YP EWHVATEPVA TWQNIQAAGNhu-dCKSFSASSEGTR I--KKISIEG NIAAGKSTFV NILKQL--CE DWEVVPEPVA RWCNVQSTQDHSV1-TK ATEVRPEQKM PTLLRVYIDG PHGMGKTTTT QLLVALGSRD DIVYVPEPMT YWRVLGAS--. ..* **.. . **. * .
基序1 基序2Dm-dNK---------- NGVNLLELMY K-DP------ ------KKWA MPFQSYVTLT M--LQSHTAP 180Bm-dNK---------- KGCNLLELMY K-DP------ ------EKWA MTFQSYVSLT M--LDMHRRPXen-dNK ---------- CGHNPLGLMY Q-DP------ ------NKWG LTLQTYVQLT M--LDIHTKPhu-TK2---------- RGHNPLGLMY H-DA------ ------SRWG LTLQTYVQLT M--LDRHTRPhu-dGK---QKACTAQ SLGNLLDMMY R-EP------ ------ARWS YTFQTFSFLS R--LKVQLEPhu-dCKEFEELTMSQK NGGNVLQMMY E-KP------ ------ERWS FTFQTYACLS R--IRAQLASHSV1-TK ---------- ---ETIANIY TTQHRLDQGE ISAGDAAVVM TSAQITMGMP YAVTDAVLAP. . .* *.Dm-dNKTNKKLK---- --------IMERSIFSAR--YCFVENMRRN GSLEQGMYNT LEEWYKFIEE 240Bm-dNKAPTPVK---- --------LMERSLFSAR--YCFVEHIMRN NTLHPAQFAV LDEWFRFIQHXen-dNK SISPVK---- --------MMERSIYSAK--YIFVENLYQS GKMPAVDYAI LTEWFKWIVKhu-TK2QVSSVR---- --------LMERSIHSAR--YIFVENLYRS GKMPEVDYVV LSEWFDWILRhu-dGKFPEKLLQ--- ARKPVQ--IFERSVYSDR--YIFAKNLFEN GSLSDIEWHI YQDWHSFLLWhu-dCKLNGKLKD--- AEKPVL--FFERSVYSDR--YIFASNLYES ECMNETEWTI YQDWHDWMNNHSV1-TK HIGGEAGSSH APPPALTLIFDRHPIAALLCYPAARYLMGS MTPQAVLAFV ALIPPTLPGT.. .* . * .
基序3 基序4Dm-dNKSIHVQADL-- IIYLRTSPEV AY-ERIRQRA RSEESCVPLK YLQELHELHE DWLIHQRR-- 300Bm-dNKNIPIDADL-- IVYLKTSPSI VY-QRIKKRA RSEEQCVPLS YIEELHRLHE DWLINRIH--Xen-dNK NTDTSVDL-- IVYLQTSPEI CY-QRLKKRC REEESVIPLE YLCAIHNLYE DWLVKQTS--hu-TK2NMDVSVDL-- IVYLRTNPET CY-QRLKKRC REEEKVIPLE YLEAIHHLHE EWLIKGSL--hu-dGKEFASRITLHG FIYLQASPQV CL-KRLYQRA REEEKGIELA YLEQLHGQHE AWLIHKTTKLhu-dCKQFGQSLELDG IIYLQATPET CL-HRIYLRG RNEEQGIPLE YLEKLHYKHE SWLLHRTLKTHSV1-TK NIVLGAL--- -------PED RHIDRLAKRQ RPGER-LDLA MLAAIRRVYG --LLANTVRY* *. * * * . * * .. .*.
基序5Dm-dNK----PQSCKV LVLDADLNLE NIGTEYQRSE SSIFDAISSN QQPSPVLVSP SKRQRVAR-- 360Bm-dNK---AECPAPV LVLDADLDLS QITDEYKRSE HQILRKAVNV VMSSPNKHSP KKPISTTPIKXen-dNK ---FSVPAPV LVIDGNKELE ELTQHYEENR TSILSL---- ---------- ----------hu-TK2---FPMAAPV LVIEADHHME RMLELFEQNR DRILTPENRK HCP------- ----------hu-dGKHFEALMNIPV LVLDVNDDFS EE-VTKQEDL MREVNTFVKNL --------- ----------hu-dCKNFDYLQEVPI LTLDVNEDFK D----KYESL VEKVKEFLSTL --------- ----------HSV1-TK LQCGGSWRED WGQLSGTAVP PQGAEPQSNA GPRPHIGDTLF TLFRAPEL LAPNGDLYNV
Dm-dNK-------- 370Bm-dNKITPHMRILXen-dNK --------hu-TK2--------hu-dGK--------hu-dCK--------HSV1-TK FAWALDVL(…延續(xù)的)Dm-dNK 黑腹果蠅脫氧核糖核苷激酶[Munch-Petersen B，KnechtW，Lenz C，Sendergaard L和Piskur J；J.Bio1.Chem.2000 275(9)6673-6679]；GenBank ACCN AF226281；如SEQ ID NO1所示]Bm-dNK 家蠶(Bombyx mori)脫氧核糖核苷激酶[GenBank ACCNAF226281；如SEQ ID NO3所示，其制備如實(shí)施例3所述]Xen-dNK 滑爪蟾(Xenopus laevis)脫氧核糖核苷激酶[GenBankACCN AF250861；如SEQ ID NO5所示，其制備如實(shí)施例3所述]hu-TK2 人類胸苷激酶[GenBank ACCN 000142；Johansson M和Karisson A；J.Biol.Chem.1997 272(13)8454-8458]hu-dGK 人類脫氧鳥苷激酶[GenBank ACCN Q16854；Johansson M和Karisson A；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1996 93(14)7258-7262]hu-dCK 人類脫氧胞苷激酶[GenBank ACCN P27707；Chottiner，E.G.等；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1991 88(4)1531-1535]HSV1-TK 單純性皰疹病毒胸苷激酶[GenBank ACCN CAA23742；McKnight SL；Nucleic Acids Res.(核酸研究)1980 8(24)5949-5964]“基序”標(biāo)明一段保守的氨基酸基序- 表明在這個(gè)位置上缺乏(沒有)氨基酸。
* 表明這個(gè)位置具有單一的完全保守的殘基。
· 表明下列的“保守物”組之一是完全保守的-STA，NEQK，NHQK，NDEQ，QHRK，MILV，MILF，HY或FYW。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的酶變體相較于野生型酶，在下述區(qū)域有突變(i)在非基序和/或非保守區(qū)域；和/或(ii)只在一個(gè)基序和/或保守的區(qū)域；和/或(iii)在任何保守的位置。
在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的酶變體相較于野生型酶，在下述位置有突變(i)在非基序中；和/或(ii)僅在一個(gè)基序區(qū)域；和/或(iii)在任何保守的位置。
此處定義，基序區(qū)域表明位于上面表1所鑒定的5個(gè)基序區(qū)域任何區(qū)域中的任何位置。非基序區(qū)域是含有不屬于上述定義的基序區(qū)域的氨基酸殘基的任何區(qū)域。
此處定義的保守位置是指表1中那些含有用星號(hào)(*)或句號(hào)(.)標(biāo)記的氨基酸殘基的位置和區(qū)域。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，保守的區(qū)域選自那些僅含有用星號(hào)標(biāo)記的氨基酸殘基的區(qū)域，即那些具有單一的、完全保守的殘基的區(qū)域。非保守區(qū)域是含有不屬于如上所定義的保守位置的氨基酸殘基的區(qū)域。
在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的酶變體，相較于野生型酶，在下述位置中的一個(gè)或多個(gè)位置上有突變(包括替換，增加和缺失)51，62，82，91，100，102，107，112，114，134，138，139，140，164，167，168，171，199，202，207，211，213，214，216，217，220，222，228，229，274，277，281，283，284，307，309，316，318，321，334，347，和352(dNK編號(hào))。
在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的酶變體相較于野生型酶，包含相對于G80，N81，I82，G83，S84，G85，K86，T87，T88，E107，P108，V109，E110，K111，W112，Y140，Q164，E201，R202，S203，C210，Y211，C212，P258，R265，I266，R267，Q268，R269，A270，R271，E274，L279，L282，或者L293保守的替換(dNK編號(hào))。
此處所定義術(shù)語“保守替換”指一個(gè)氨基酸殘基被另一個(gè)生物學(xué)類似的殘基所替換。保守替換的例子包括(i)非極性或疏水性殘基如丙氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，脯氨酸，蛋氨酸，苯丙氨酸，或色氨酸的相互替換，特別是丙氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸或者脯氨酸相互之間的替換；或(ii)一個(gè)中性的(不帶電荷的)極性殘基如絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺或半胱氨酸替換另一個(gè)，特別是精氨酸替換賴氨酸，谷氨酸替換天冬氨酸，或者谷氨酰胺替換天冬酰胺；或(iii)帶正電荷的殘基如賴氨酸，精氨酸或組氨酸之間相互替換；或(iv)帶負(fù)電荷的殘基如天冬氨酸或谷氨酸之間相互替換。
如果替代后的多肽所產(chǎn)生的抗體與未取代的多肽也具有免疫反應(yīng)性，術(shù)語保守替換還包括使用替換的氨基酸殘基替代親代氨基酸殘基。
在另一更優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的酶變體相較于野生型酶，包含下述的一個(gè)或多個(gè)變異M51T；T62A；N91D；N100D；I102T；N114D；N134D；N134S；L138S；M139L；M139V；V167A；V167S；V167M；T168A；M171R；I199M；A207D；V214A；N216S；M217V；N220S；S222W；Y228C；N229S；V277A；Y281H；S307P；K309R；D316N；N318D；N321S；F334L；L347P；和K352N(dNK編號(hào))。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中本發(fā)明的酶變體相較于野生型酶包含下述變異M51T/T168A/N220S；T62A/V167A/N321S；N91D/N134D；N100D/N134D；N100D/N134D/N318D/L347P；N100D/N134D/I199M/N216S/M217V/D316N；I102T/N318D；N114D/M217V/Y281H；N134S/L138S/M139L/K352N；M139V/N318D/L347P；V167A/M171R/A207D；V167S/M171R/A207D；V167A/I199M/N216S/M217V/D316N；
V167A/N318D/L347P；T168A/N318D/L347P；T168A/I199M/N216S/M217V/D316N；M171R/A207D；I199M/V214A/N216S/M217V/D316N；I199M/N216S/M217V/N229S/S307P/D316N；I199M/N216S/M217V/D316N；S222W/F334L；Y228C/V277A/K309R；或N318D/L347P(dNK編號(hào)).
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的酶變體來自人胸苷激酶2(hu-TK2)；或者人脫氧鳥苷激酶(hu-dGK)；或人脫氧胞苷激酶(hu-dCK)；或者單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV1-TK)。
在另一優(yōu)選實(shí)施方式中本發(fā)明的酶變體來自昆蟲或低等脊椎動(dòng)物，特別是黑腹果蠅脫氧核糖核苷激酶(Dm-dNK)，或者家蠶脫氧核糖核苷激酶(Bm-dNK)，或者滑爪蟾脫氧核糖核苷激酶(Xen-dNK)，或者岡比亞按蚊(Anopheles gambia)脫氧核糖核苷激酶。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的酶變體是Dm-dNK/M51T；Dm-dNK/M51T/T168A/N220S；Dm-dNK/T62A；Dm-dNK/T62A/V167A/N321S；Dm-dNK/N91D；Dm-dNK/N91D/N134D；Dm-dNK/N100D；Dm-dNK/N100D/N134D；Dm-dNK/N100D/N134D/N318D/L347P；Dm-dNK/N100D/N134D/I199M/N216S/M217V/D316N；Dm-dNK/I102T；Dm-dNK/I102T/N318D；Dm-dNK/N114D；Dm-dNK/N114D/M217V/Y281H；Dm-dNK/N134D；Dm-dNK/N134S；Dm-dNK/N134S/L138S/M139L/K352N；Dm-dNK/L138S；Dm-dNK/M139L；Dm-dNK/M139V；Dm-dNK/M139V/N318D/L347P；Dm-dNK/V167A；Dm-dNK/V167A/I199M/N216S/M217V/D316N；Dm-dNK/V167A/N318D/L347P；Dm-dNK/T168A；Dm-dNK/V167A/M171R/A207D，Dm-dNK/V167S/M171R/A207D，Dm-dNK/T168A/N318D/L347P；Dm-dNK/T168A/I199M/N216S/M217V/D316N；Dm-dNK/M171R/A207D Dm-dNK/I199M；Dm-dNK/I199M/V214A/N216S/M217V/D316N；Dm-dNK/I199M/N216S/M217V/N229S/S307P/D316N；Dm-dNK/I199M/N216S/M217V/D316N；Dm-dNK/V214A；Dm-dNK/N216S；Dm-dNK/M217V；Dm-dNK/N220S；Dm-dNK/S222W；Dm-dNK/S222W/F334L；Dm-dNK/Y228C；Dm-dNK/Y228C/V277A/K309R；Dm-dNK/N229S；Dm-dNK/V277A；Dm-dNK/Y281H；Dm-dNK/S307P；Dm-dNK/K309R；Dm-dNK/D316N；Dm-dNK/N318D；Dm-dNK/N318D/L347P；Dm-dNK/N321S；Dm-dNK/F334L；Dm-dNK/L347P；或Dm-dNK/K352N(dNK編號(hào)).
在另一優(yōu)選實(shí)施方式中本發(fā)明的酶變體是Bm-dNK/E91D；Bm-dNK/E91D/N134D；Bm-dNK/-100D；Bm-dNK/-100D/N134D；Bm-dNK/-100D/N134D/K347P；Bm-dNK/-100D/N134D/L199M/H216S/I217V/D316N；Bm-dNK/I102T；Bm-dNK/N114D；Bm-dNK/N114D/I217V/Y281H；Bm-dNK/N134D；Bm-dNK/N134S；Bm-dNK/N134S/L138S/M139L/K352N；Bm-dNK/L138S；Bm-dNK/M139L；Bm-dNK/M139V；Bm-dNK/M139V/K347P；Bm-dNK/V167A；Bm-dNK/V167A/L199M/H216S/I217V/D316N；Bm-dNK/V167A/Q321S；Bm-dNK/V167A/K347P；Bm-dNK/V167A/M171R/A207D，Bm-dNK/V167S/M171R/A207D，Bm-dNK/S168A；Bm-dNK/S168A/L199M/H216S/I217V/D316N；Bm-dNK/S168A/N220S；Bm-dNK/S168A/K347P；Bm-dNK/M171R/A207D；Bm-dNK/L199M；Bm-dNK/L199M/H216S/I217V/D316N；Bm-dNK/L199M/V214A/H216S/I217V/D316N；Bm-dNK/I199M/H216S/I217V/A229S/D316N；Bm-dNK/V214A；Bm-dNK/H216S；Bm-dNK/I217V；Bm-dNK/N220S；Bm-dNK/T222W；Bm-dNK/F228C；Bm-dNK/F228C/V277A/P309R；Bm-dNK/V277A；Bm-dNK/A229S；Bm-dNK/Y281H；Bm-dNK/P309R；Bm-dNK/D316N；Bm-dNK/Q321S；Bm-dNK/L334L；Bm-dNK/K347P；或Bm-dNK/K352N(dNK編號(hào)).
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的酶變體是Xen-dNK/M51T；Xen-dNK/M51T/Q168A；Xen-dNK/G62A；Xen-dNK/G62A/V167A/E321S；Xen-dNK/100D；Xen-dNK/-100D/N134D；Xen-dNK/-100D/N134D/E318D；Xen-dNK/-100D/N134D/N216S/L217V；Xen-dNK/L102T；Xen-dNK/L102T/E318D；Xen-dNK/N114D；Xen-dNK/N114D/L217V/Y281H；Xen-dNK/N134D；Xen-dNK/N134S；Xen-dNK/N134S/L138S/M139L；Xen-dNK/L138S；Xen-dNK/M139L；Xen-dNK/M139V；Xen-dNK/M139V/E318D/；Xen-dNK/V167A；Xen-dNK/V167A/N216S/L217V；Xen-dNK/V167A/E318D；Xen-dNK/V167A/M171R/A207D，Xen-dNK/V167S/M171R/A207D，Xen-dNK/Q168A；Xen-dNK/Q168A/N216S/L217V；Xen-dNK/Q168A/E318D；Xen-dNK/M171R/A207D；Xen-dNK/V214A；Xen-dNK/V214A/N216S/L217V；Xen-dNK/N216S；Xen-dNK/N216S/L217V；Xen-dNK/N216S/L217V/A229S；Xen-dNK/L217V；Xen-dNK/K222W；Xen-dNK/Y228C；Xen-dNK/Y228C/I277A/P309R；Xen-dNK/A229S；Xen-dNK/I277A；Xen-dNK/Y281H；Xen-dNK/P309R；Xen-dNK/E318D；或Xen-dNK/E321S(dNK編號(hào))雜種酶在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的脫氧核糖核苷激酶變體可以是源自兩個(gè)或更多昆蟲多底物脫氧核糖核苷激酶的雜種脫氧核糖核苷激酶。
本發(fā)明雜種的脫氧核糖核苷激酶將包含至少5個(gè)，優(yōu)選至少10個(gè)，更優(yōu)選至少15個(gè)，更加優(yōu)選至少20個(gè)，最優(yōu)選至少25個(gè)源自每種昆蟲多底物脫氧核糖核苷激酶的連續(xù)氨基酸。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，該雜種激酶源自黑腹果蠅脫氧核糖核苷激酶，和/或家蠶脫氧核糖核苷激酶，和/或滑爪蟾脫氧核糖核苷激酶，和/或?qū)葋啺次妹撗鹾颂呛塑占っ浮?br> 在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的雜種激酶源自黑腹果蠅脫氧核糖核苷激酶和家蠶脫氧核糖核苷激酶，并包括SEQ ID NO10的氨基酸序列，或者SEQ ID NO12的氨基酸序列。
重組載體本發(fā)明另一方面提供包含本發(fā)明的突變多核苷酸的重組載體按此處的定義，重組載體是一種表達(dá)載體或重組表達(dá)構(gòu)建體，用于向目的細(xì)胞中導(dǎo)入多核苷酸。該表達(dá)載體可以是病毒載體或質(zhì)粒載體，本發(fā)明的多核苷酸可以被正向或反向插入其中。該載體還可以是合成的基因。
合適的表達(dá)載體包括，但不限于真核載體，原核載體，如細(xì)菌線狀或環(huán)狀質(zhì)粒，病毒載體，DNA-蛋白復(fù)合物，如DNA-單克隆抗體復(fù)合物，以及受體介導(dǎo)的載體。該載體尤其可以是包含在脂質(zhì)體內(nèi)。
優(yōu)選的細(xì)菌載體包括pQE30，pQE70，pQE60，pQE-9(可獲自Quigen)；pbs，pD10，phagescript，psiX174，pbluescript SK，pbsks，pNH8A，pNH16A，pNH18A，pNH46A(可獲自Stratagene)，pGEX-2T，PKK223-3，pKK233-3，pDR540和pRIT5(可獲自Pharmacia)；和pASK75(可獲自Biometra)。
優(yōu)選的真核載體包括pWLNEO，pSV2CAT，pOG44，pXT1，pSG(可獲自Stratagene)；pSVK3，pBPV，pMSG，pSVL(可獲自Phamacia)；和pTEJ-8[FEBS.Lett.1990 267 289-294]和pcDNA-3(可獲自Invitrogen)。優(yōu)選的酵母載體包括pYES2(可獲自Invitrogen)。
優(yōu)選的病毒載體包括單純皰疹病毒載體，腺病毒載體，腺病毒相關(guān)病毒載體，痘病毒載體，細(xì)小病毒載體，桿狀病毒載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
但是，任何質(zhì)?；蜉d體都可以使用，只要它們在生產(chǎn)宿主中可以復(fù)制和存活。
該表達(dá)載體還可以進(jìn)一步含有與本發(fā)明的多核苷酸序列可操作性連接的調(diào)控序列。按此處的定義，術(shù)語“可操作性連接”是指可操作元件即基因和調(diào)控序列，是操作性地連接以實(shí)現(xiàn)所期望的表達(dá)。這種調(diào)節(jié)序列的一個(gè)實(shí)例是啟動(dòng)子。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的載體包含與多核苷酸操作性連接的啟動(dòng)子。
調(diào)控元件可以選自任何期望的來源以及使用本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)例如Sambrook等所描述的技術(shù)而產(chǎn)生的載體[Sambrook等MolecularCloningA Laboratory Manual(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊)，Cold SpringHarbor Lab.，Cold Spring Harbor，NY 1989]。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，該載體是病毒載體，特別是單純皰疹病毒載體，腺病毒載體，腺病毒相關(guān)病毒載體或者逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。載體及其調(diào)控元件的選擇當(dāng)然依賴于表達(dá)的目的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以視情況決定。
本發(fā)明另一方面提供能夠產(chǎn)生含有本發(fā)明病毒載體的感染性毒粒的包裝細(xì)胞系。
宿主/生產(chǎn)細(xì)胞本發(fā)明的另一個(gè)方面提供一種經(jīng)基因操作以使其含有本發(fā)明多核苷酸序列，和/或本發(fā)明的重組表達(dá)載體的生產(chǎn)細(xì)胞。本發(fā)明的細(xì)胞特別可以是被基因操作使本發(fā)明的多肽瞬時(shí)或穩(wěn)定表達(dá)，過表達(dá)或者共表達(dá)。本領(lǐng)域公知產(chǎn)生瞬時(shí)以及穩(wěn)定表達(dá)的方法。
本發(fā)明的多核苷酸可以被插入到表達(dá)載體中，例如質(zhì)粒，病毒或其他表達(dá)載體，并且通過某種方式的連接與表達(dá)調(diào)控序列操作性連接，該連接方式使編碼序列在表達(dá)調(diào)控序列相匹配的條件下可實(shí)現(xiàn)表達(dá)。合適的表達(dá)控制序列包括啟動(dòng)子，增強(qiáng)子，轉(zhuǎn)錄終止子，起始密碼子，內(nèi)含子的剪接信號(hào)以及終止密碼子，都包含在本發(fā)明多核苷酸的正確閱讀框架中，使得mRNA正確翻譯。表達(dá)調(diào)控序列還可以包括額外的組份例如前導(dǎo)序列和融合伙伴序列。
啟動(dòng)子尤其可以是組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。當(dāng)在細(xì)菌系統(tǒng)中克隆時(shí)，可使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子如λ噬菌體pL，plac，ptrp，ptac(ptrp-lac雜合啟動(dòng)子)。當(dāng)在哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中克隆時(shí)，可使用來自哺乳動(dòng)物細(xì)胞的啟動(dòng)子如泛素啟動(dòng)子，TK啟動(dòng)子，或金屬硫蛋白啟動(dòng)子，或來自哺乳動(dòng)物病毒的啟動(dòng)子，如逆轉(zhuǎn)錄病毒的長末端重復(fù)區(qū)，腺病毒晚期啟動(dòng)子或痘苗病毒7.5K啟動(dòng)子。還可以使用通過重組DNA或合成技術(shù)得到的啟動(dòng)子來轉(zhuǎn)錄本發(fā)明多核苷酸。
合適的表達(dá)載體典型地包含表達(dá)起點(diǎn)，啟動(dòng)子以及允許對轉(zhuǎn)化細(xì)胞表型選擇的特定基因，包括象T7-based表達(dá)載體的載體用來在細(xì)菌中表達(dá)[Rosenberg等，Gene(基因)1987 56 125]，pTEJ-8，pUbilZ，pcDNA-3和pMSXND表達(dá)載體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)[Lee和Nathans，J.Biol.Chem.1988 263 3521]，來自桿狀病毒載體在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)，以及卵母細(xì)胞表達(dá)載體PTLN[Lorenz D，Pusch M & Jentsch T JHeteromultimeric CLC chloride channels with novel properties；Proc.Natl.Acad.Sci.USA1996 93 13362-13366]。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的細(xì)胞是真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如人細(xì)胞，狗細(xì)胞，猴細(xì)胞，大鼠細(xì)胞或小鼠細(xì)胞，卵母細(xì)胞，或酵母細(xì)胞。本發(fā)明細(xì)胞可以不限制地是人胚胎腎(HEK)細(xì)胞，如HEK293細(xì)胞，BHK21細(xì)胞，中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，滑爪蟾卵母(XLO)細(xì)胞。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的細(xì)胞是真菌細(xì)胞，如絲狀真菌細(xì)胞。在另一優(yōu)選實(shí)施方式中該細(xì)胞是昆蟲細(xì)胞，最優(yōu)選Sf9細(xì)胞。額外優(yōu)選的本發(fā)明哺乳動(dòng)物細(xì)胞是PC12，HiB5，RN33b細(xì)胞系和人神經(jīng)祖細(xì)胞。最優(yōu)選人細(xì)胞。
當(dāng)本發(fā)明的細(xì)胞是真核細(xì)胞，引入本發(fā)明的異源多核苷酸尤其可通過感染(利用病毒載體)，轉(zhuǎn)染(利用質(zhì)粒載體)，使用磷酸鈣沉淀，顯微注射，電穿孔，脂質(zhì)轉(zhuǎn)染或者其他本領(lǐng)域公知的物理-化學(xué)方法來實(shí)施。
在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的分離多核苷酸序列，和/或本發(fā)明的重組表達(dá)載體被轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，神經(jīng)祖細(xì)胞，星形膠質(zhì)細(xì)胞，T細(xì)胞，造血干細(xì)胞，未分化的細(xì)胞或者腦內(nèi)皮細(xì)胞，其含有至少一個(gè)能夠介導(dǎo)細(xì)胞無限增殖化和/或轉(zhuǎn)化的DNA分子。
激活宿主細(xì)胞中內(nèi)源基因可通過導(dǎo)入調(diào)控元件來實(shí)現(xiàn)，特別是通過導(dǎo)入能夠有效轉(zhuǎn)錄編碼本發(fā)明的酶變體的內(nèi)源基因的啟動(dòng)子。
生產(chǎn)多肽的方法本發(fā)明另一方面提供生產(chǎn)本發(fā)明分離的酶變體的方法。在本發(fā)明的方法中，合適的生產(chǎn)細(xì)胞通過導(dǎo)入外源的多核苷酸進(jìn)行基因改造以使酶變體能夠表達(dá)，該細(xì)胞在允許產(chǎn)生該多肽的條件下培養(yǎng)，然后收集目的多肽。
本發(fā)明的多核苷酸可通過本領(lǐng)域公知的方法被引入到期望的生產(chǎn)或宿主細(xì)胞中，這些方法如Sambrook等人描述的[Sambrook等MolecularCloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Lab.，ColdSpring Harbor，NY 1989]。任何能夠促進(jìn)外源多核苷酸導(dǎo)入期望細(xì)胞的技術(shù)都可以使用，包括例如轉(zhuǎn)導(dǎo)，轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)化，感染等等。
本發(fā)明的多核苷酸還可以特別通過定點(diǎn)誘變，或者甚至隨機(jī)誘變而得到。
本發(fā)明的多核苷酸可來自任何合適的來源。本發(fā)明的多核苷酸優(yōu)選來自昆蟲或低等脊椎動(dòng)物。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的多核苷酸來自或產(chǎn)生于任何公眾可獲得的cDNA文庫。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的多核苷酸可使用PCR引物制備，該引物在實(shí)施例中描述并如SEQ ID NOS7-8和13-20所列。
本發(fā)明的分離多核苷酸可以通過本發(fā)明公知的技術(shù)制備，如在下列實(shí)施例中所描述的。
生物活性與多數(shù)已知的具有盡管部分重疊但不相同的底物特異性和效力的脫氧核糖核苷激酶相反，本發(fā)明的脫氧核糖核苷激酶變體相較于野生型酶顯示對于不同的底物具有增強(qiáng)的相對效力。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，“kcat/Km(底物)/kcat/Km(核苷類似物)”比率(即兩邊之間的比率，其中一邊是至少一種天然底物的“kcat/Km”，另一邊是至少一種核苷類似物的“kcat/Km”)至少被降低5倍，更優(yōu)選10倍，最優(yōu)選20倍。
按此處的定義，如果激酶變體對一種或多種底物的磷酸化活性比野生型(親代)酶增長了不止1倍，則認(rèn)為其提高了靈敏度。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，不同的底物是核苷類似物。優(yōu)選的核苷類似物包括阿昔洛韋(9-[2-羥基-乙氧基]-甲基-鳥嘌呤核苷)，布昔洛韋，泛昔洛韋，更昔洛韋(9-[2-羥基-1-(羥甲基)乙氧基甲基]-鳥嘌呤核苷)，噴昔洛韋，伐昔洛韋，三氟胸苷，AZT(3’-疊氮-3’-胸苷)，AIU(5’-碘-5’-氨基-2’，5’-雙脫氧尿苷)，ara-A(腺苷-阿拉伯糖苷；Vivarabine)，ara-C(胞苷-阿拉伯糖苷)，ara-G(9-β-D-阿拉伯呋喃糖基鳥嘌呤)，ara-T，1-β-D-阿拉伯呋喃糖基胸腺嘧啶，5-乙基-2’-脫氧尿苷，5-碘-5’-氨基-2，5’-雙脫氧尿苷，1-[2-脫氧-2-氟代-β-D-阿拉伯呋喃糖基]-5-碘尿嘧啶，碘苷(5-碘-2’脫氧尿苷)，氟達(dá)拉濱(2-氟代腺嘌呤9-β-D-阿拉伯呋喃糖苷)，吉西他濱(gencitabine)，2’，3’-雙脫氧次黃嘌呤核苷(ddI)，2’，3’-雙脫氧胞苷(ddC)，2’，3’-雙脫氧胸苷(ddT)，2’，3’-雙脫氧腺苷(ddA)，2’，3’-雙脫氧鳥苷(ddG)，2-氯-2’-脫氧腺苷(2CdA)，5-氟代脫氧尿苷，BVaraU((E)-5-(2-溴乙烯基)-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基尿嘧啶)，BVDU(5-溴乙烯基-脫氧尿苷)，F(xiàn)IAU(1-(2-脫氧-2-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-碘尿嘧啶)，3TC(2’-脫氧-3’-硫雜胞苷(thiacytidine))，dFdC吉西他濱(2’，2’-雙氟脫氧胞苷)，dFdG吉西他濱(2’，2’-雙氟脫氧鳥苷)或者d4T(2’，3’雙脫氫-3’-脫氧胸苷)。
近來出現(xiàn)了基因治療，作為一種新的治療手段來治療各種癌癥。另外，該方法可用于治療病毒感染，還可以應(yīng)用于移植技術(shù)。該項(xiàng)治療的基礎(chǔ)是激酶基因被導(dǎo)入靶細(xì)胞，在該細(xì)胞中該基因?qū)⒈槐磉_(dá)。被導(dǎo)入的激酶可以特異性激活本身無害的前體藥物，該前體藥物的激活形式是有毒的，將導(dǎo)致細(xì)胞死亡或者抑制病毒復(fù)制。
脫氧核苷類似物如AZT(齊多夫定，Retrovir)，ddC(扎西他濱，Hivid)或AraC(阿糖胞苷)被廣泛用于治療癌癥以及病毒感染的患者。在靶細(xì)胞中，這些前體藥物必須是可以代謝合成其三磷酸形式從而帶有毒性并導(dǎo)致細(xì)胞死亡或抑制病毒復(fù)制。這個(gè)激活反應(yīng)過程中的限速步驟是磷酸化為單磷酸核苷。但是，許多核苷類似物的磷酸化在靶細(xì)胞中通常是無效的，或者在非靶細(xì)胞中也非特異地發(fā)生。
這些藥物的效力和選擇性可使用編碼本發(fā)明脫氧核糖核苷激酶變體的前體藥物激活基因來大大提高。
這樣，從一個(gè)方面來看，本發(fā)明提供使細(xì)胞對前體藥物敏感的方法，該方法包括以下步驟(i)用本發(fā)明的編碼促進(jìn)所述前體藥物轉(zhuǎn)化為(細(xì)胞毒性)藥物的酶的多核苷酸序列轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞；以及(ii)將所述前體藥物遞送至所述細(xì)胞；其中所述細(xì)胞對于所述(細(xì)胞毒性)藥物比對于所述前體藥物更加敏感。
在這個(gè)方面，一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，該前體藥物是核苷類似物。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，該核苷類似物是阿昔洛韋(9-[2-羥基-乙氧基]-甲基-鳥嘌呤核苷)，布昔洛韋，泛昔洛韋，更昔洛韋(9-[2-羥基-1-(羥甲基)乙氧基甲基]-鳥嘌呤核苷)，噴昔洛韋，伐昔洛韋，三氟胸苷，AZT(3’-疊氮-3’-胸苷)，AIU(5’-碘-5’-氨基-2’，5’-雙脫氧尿苷)，ara-A(腺苷-阿拉伯糖苷；Vivarabine)，ara-C(胞苷-阿拉伯糖苷)，ara-G(9-β-D-阿拉伯呋喃糖基鳥嘌呤)，ara-T，1-β-D-阿拉伯呋喃糖基胸腺嘧啶，5-乙基-2’-脫氧尿苷，5-碘-5’-氨基-2，5’-雙脫氧尿苷，1-[2-脫氧-2-氟代-β-D-阿拉伯呋喃糖基]-5-碘尿嘧啶，碘苷(5-碘-2’脫氧尿苷)，氟達(dá)拉濱(2-氟代腺嘌呤9-β-D-阿拉伯呋喃糖苷)，吉西他濱(gencitabine)，2’，3’-雙脫氧次黃嘌呤核苷(ddI)，2’，3’-雙脫氧胞苷(ddC)，2’，3’-雙脫氧胸苷(ddT)，2’，3’-雙脫氧腺苷(ddA)，2’，3’-雙脫氧鳥苷(ddG)，2-氯-2’-脫氧腺苷(2CdA)，5-氟代脫氧尿苷，BVaraU((E)-5-(2-溴乙烯基)-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基尿嘧啶)，BVDU(5-溴乙烯基-脫氧尿苷)，F(xiàn)IAU(1-(2-脫氧-2-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-碘尿嘧啶)，3TC(2’-脫氧-3’-硫雜胞苷(thiacytidine))，dFdC吉西他濱(2’，2’-雙氟脫氧胞苷)，dFdG(2’，2’-雙氟脫氧鳥苷)或者d4T(2’，3’雙脫氫-3’-脫氧胸苷)。
從另一個(gè)方面來看，本發(fā)明提供對抗患者體內(nèi)病原體的手段和方法，該患者可能特別是包括人類在內(nèi)的恒溫動(dòng)物。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種抑制恒溫動(dòng)物中病原體的方法，該方法包括對所述動(dòng)物施用本發(fā)明的多核苷酸序列或者本發(fā)明的載體。
在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，該多核苷酸序列或所述載體是體內(nèi)給藥。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，該病原體是病毒，細(xì)菌或寄生蟲。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，該病原體是腫瘤細(xì)胞或自身反應(yīng)的免疫細(xì)胞。
本發(fā)明已知恒溫動(dòng)物中病原體的方法還進(jìn)一步包括向所述恒溫動(dòng)物施用核苷類似物的步驟。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，該核苷類似物是阿昔洛韋(9-[2-羥基-乙氧基]-甲基-鳥嘌呤核苷)，布昔洛韋，泛昔洛韋，更昔洛韋(9-[2-羥基-1-(羥甲基)乙氧基甲基]-鳥嘌呤核苷)，噴昔洛韋，伐昔洛韋，三氟胸苷，AZT(3’-疊氮-3’-胸苷)，AIU(5’-碘-5’-氨基-2’，5’-雙脫氧尿苷)，ara-A(腺苷-阿拉伯糖苷；Vivarabine)，ara-C(胞苷-阿拉伯糖苷)，ara-G(9-β-D-阿拉伯呋喃糖基鳥嘌呤)，ara-T，1-β-D-阿拉伯呋喃糖基胸腺嘧啶，5-乙基-2’-脫氧尿苷，5-碘-5’-氨基-2，5’-雙脫氧尿苷，1-[2-脫氧-2-氟代-β-D-阿拉伯呋喃糖基]-5-碘尿嘧啶，碘苷(5-碘-2’脫氧尿苷)，氟達(dá)拉濱(2-氟代腺嘌呤9-β-D-阿拉伯呋喃糖苷)，吉西他濱(gencitabine)，2’，3’-雙脫氧次黃嘌呤核苷(ddI)，2’，3’-雙脫氧胞苷(ddC)，2’，3’-雙脫氧胸苷(ddT)，2’，3’-雙脫氧腺苷(ddA)，2’，3’-雙脫氧鳥苷(ddG)，2-氯-2’-脫氧腺苷(2CdA)，5-氟代脫氧尿苷，BVaraU((E)-5-(2-溴乙烯基)-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基尿嘧啶)，BVDU(5-溴乙烯基-脫氧尿苷)，F(xiàn)IAU(1-(2-脫氧-2-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-碘尿嘧啶)，3TC(2’-脫氧-3’-硫雜胞苷(thiacytidine))，dFdC吉西他濱(2’，2’-雙氟脫氧胞苷)，dFdG(2’，2’-雙氟脫氧鳥苷)或者d4T(2’，3’-雙脫氫-3’-脫氧胸苷)。
藥物組合物本發(fā)明另一方面提供新的藥物組合物，該藥物組合物包含有效治療量的本發(fā)明酶變體。
為用于治療，本發(fā)明的酶變體可以通過任何方便形式給藥。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的酶變體與一種或多種輔劑，賦形劑，載體和/或稀釋劑一起被并入藥物組合物中，并且該藥物組合物是通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的傳統(tǒng)方法制備的。
這種藥物組合物可以包含本發(fā)明的酶變體，或其抗體。該組合物可以單獨(dú)給藥或者與一種或幾種其他物質(zhì)，藥物或激素結(jié)合給藥。
本發(fā)明的藥物組合物可通過任何合適的途徑給藥，包括但不限于口服，靜脈內(nèi)，肌肉內(nèi)，動(dòng)脈內(nèi)，骨髓內(nèi)，鞘內(nèi)，心室內(nèi)，經(jīng)皮，皮下，腹膜內(nèi)，鼻內(nèi)，anteral，局部，舌下或直腸給藥，頰，陰道，眼眶內(nèi)，大腦內(nèi)，顱內(nèi)，脊柱內(nèi)，心室內(nèi)，腦池內(nèi)，囊內(nèi)，肺內(nèi)的，粘膜內(nèi)或者通過吸入。
進(jìn)一步的制劑和給藥方法細(xì)節(jié)可參考最新版的Remington’sPharmaceutical Sciences(Maack Publishing Co.，Eston，PA)。
活性成份可以每天一劑或幾劑給藥。目前預(yù)期的合適劑量是每次給藥介于0.5ng酶變體/kg體重到約50μg/kg之間，每天劑量約1.0ng/kg到約100μg/kg。
當(dāng)然給藥劑量必須謹(jǐn)慎調(diào)節(jié)，視被治療個(gè)體的年齡，體重和癥狀，以及給藥途徑，劑量形式和方式，所期望的結(jié)果而定，精確的劑量當(dāng)然需要專業(yè)人員來測定。
在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明的酶變體可通過使用在“治療方法”中描述的細(xì)胞系和載體進(jìn)行基因傳遞給藥。為產(chǎn)生這樣的治療細(xì)胞系，本發(fā)明的多核苷酸可被插入到表達(dá)載體中如質(zhì)粒，病毒或其他表達(dá)載體，并以某種方式操作性連接到表達(dá)調(diào)控序列，該方式使編碼序列的表達(dá)在與表達(dá)調(diào)控序列相匹配的條件下得以實(shí)現(xiàn)。合適的表達(dá)調(diào)控序列包括啟動(dòng)子，增強(qiáng)子，轉(zhuǎn)錄終止子，起始密碼子，內(nèi)含子拼接信號(hào)，終止密碼子，它們都包括在本發(fā)明的多核苷酸的正確閱讀框中，以使mRNA能夠正確翻譯。表達(dá)調(diào)控序列還可以包括其它的組份如前導(dǎo)序列和融合伙伴序列。
治療方法涉及多核苷酸和蛋白，多肽，多肽片段或其產(chǎn)生的衍生物，以及這種蛋白，多肽或衍生物的抗體的本發(fā)明，可以用于治療或緩解活動(dòng)物體包括人類的紊亂或疾病，其中該紊亂或疾病對細(xì)胞毒性物質(zhì)的活性起反應(yīng)。
紊亂，疾病或病癥尤其可以是癌癥或病毒感染。
本發(fā)明的酶變體可通過例如注射，植入或攝取的藥物組合物直接使用來治療對該酶變體起反應(yīng)的病理過程。
本發(fā)明的多核苷酸，包括其互補(bǔ)的序列，可用于本發(fā)明酶變體的表達(dá)。這可通過表達(dá)這種蛋白，多肽或衍生物的本發(fā)明的細(xì)胞系來實(shí)現(xiàn)，或者通過編碼這種蛋白，多肽或衍生物的本發(fā)明病毒載體來實(shí)現(xiàn)，或者通過表達(dá)這種蛋白，多肽或衍生物的宿主細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)?？墒┯眠@些細(xì)胞，載體和組合物處理靶區(qū)域來影響跟細(xì)胞毒性物質(zhì)起反應(yīng)的疾病過程。
合適的表達(dá)載體可以來自慢病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒，皰疹或痘苗病毒，或者來自各種細(xì)菌產(chǎn)生的質(zhì)粒，并可用于體內(nèi)遞送核苷酸序列到整個(gè)有機(jī)體或靶器官，組織或細(xì)胞群。其他方法包括但不限于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，電穿孔，用含有核酸或其他定位信號(hào)的載體多肽轉(zhuǎn)染，以及通過緩釋系統(tǒng)的基因遞送。本發(fā)明的另一方面，互補(bǔ)于本發(fā)明的核苷酸或其部分的“反義”核苷酸序列可用于抑制或提高酶變體表達(dá)。
本發(fā)明的另一方面涉及治療或緩解活動(dòng)物體包括人類紊亂，疾病或病癥的方法，該紊亂或疾病對細(xì)胞毒性物質(zhì)的活性起反應(yīng)。
實(shí)施例1PCR誘導(dǎo)的Dm-dNK變體采用基于誘變PCR的定向進(jìn)化方法，來產(chǎn)生突變激酶形式。Dm-dNK的開放閱讀框架(ORF)通過不同的核苷酸類似物濃度誘變處理并研究不同核苷酸類似物濃度的作用。誘變的PCR片段被連接到表達(dá)質(zhì)粒中，然后被轉(zhuǎn)化到TK缺陷的大腸桿菌KY895菌株中。
隨機(jī)突變和突變文庫的構(gòu)建表達(dá)載體pGEX-2T-rDm-dNK[Munch-Petersen等，J.Biol. Chem.2000 275(9)6673-6679]被用作PCR誘變的模板。
Dm-dNK的開放閱讀框(ORF)使用下述引物擴(kuò)增Dm-TK35’-CGCGGATCCATGGCGGAGGCAGCATCCT-3’(SEQ ID NO7)；和Dm-TK45’-CGGAATTCTTATCTGGCGACCCTCTGGCGT-3’(SEQ IDNO8)。
PCR分兩步進(jìn)行。首先PCR在20μl反應(yīng)物中于提供的緩沖液內(nèi)與0.15單位的來自Amersham Corp.的Taq聚合酶反應(yīng)。使用10fmol模板DNA，20pmol每種引物，0.2mM每種dNTP。核苷酸類似物6-(2-脫氧-β-赤型戊呋喃糖基)-3，4-二氫-8H-嘧啶并-[4，5C][1，2]噁嗪-7-酮-5’-三磷酸(dPTP)和2’-脫氧-8-羥基鳥苷-5’-三磷酸(8-oxo-dGTP)(均可獲自Amersham Corp)以如

圖1中所示濃度存在。
PCR條件是在94℃變性5分鐘，然后94℃ 45秒，50℃ 45秒，72℃ 2分鐘，如此循環(huán)25次，最后在72℃延長10分鐘。
PCR產(chǎn)物用獲自Boehringer Mannhein的PCR純化試劑盒進(jìn)行純化，并在80μl pH7.5的5mM Tris/HCl中稀釋。將40μl該稀釋液用于沒有核苷酸類似物的第二次PCR，該P(yáng)CR與0.5單位Taq聚合酶，65pmol每種引物，0.2mM每種dNTP一起，在65μl的體積內(nèi)進(jìn)行。PCR條件與第一次的PCR相同，但只循環(huán)15次。
誘變的PCR片段用獲自Boehringer Mannhein的PCR純化試劑盒進(jìn)行純化，用BamHI和EcoRI切割，并亞克隆到pGEX-2T質(zhì)粒載體的多克隆位點(diǎn)。TK缺陷的大腸桿菌KY895菌株[F-tdk-1 ilv][Igarashi K，Hiraga S和Yura TA deoxythymidine kinase deficient mutant ofEschericha coli.II.Mapping and transduction studies with phageΦ80；Genetics(遺傳學(xué))1967 57 643-654]，與連接混合物一起，使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行電轉(zhuǎn)染，并在LB-氨芐青霉素(100μg/ml)平板上涂平板。
通過隨機(jī)選取菌落的菌落PCR來測定攜帶有再成環(huán)載體的相對菌落數(shù)。
誘變的程度研究不同核苷酸類似物濃度在誘變PCR中的作用。通過TK活性的減少來評(píng)價(jià)誘變的程度。這可通過將至少500個(gè)LB-氨芐青霉素平板上的菌落復(fù)制涂布到TK選擇平板上[Black ME，Newcomb T G，WilsonHMP和Loeb L ACreation of drug-specific herpes simplex virustype 1 thymidine kinase mutants for gene therapy；Proc.Natl.Acad.Sci.USA1996 93 3525-3529]并計(jì)數(shù)在TK選擇平板上存活的菌落數(shù)來實(shí)現(xiàn)。結(jié)果以再成環(huán)載體校正。
突變體的選擇首先，通過在TK選擇平板上復(fù)制涂布那些菌落而選擇出恢復(fù)了TK活性的菌落[Black M E，Newcomb T G，Wilson H M P和Loeb LACreation of drug-specific herpes simplex virus type 1thymidine kinase mutants for gene therapy；Proc.Natl.Acad.Sci.USA1996 93 3525-3529]。只有與TK陰性大腸桿菌KY895菌株互補(bǔ)的突變株才能在該選擇培養(yǎng)基上產(chǎn)生菌落。
這些菌落的過夜培養(yǎng)物用10％甘油稀釋200倍，并將2μl的稀釋液涂布在M9基本培養(yǎng)基平板上[Ausubel F，Brent R，Kingston R E，Moore D D，Seidman J G，Smith J A和Struchl K(編著)Shortprotocols in molecular biology；Wiley，USA，第3版，1995，1-2頁]，該平板中補(bǔ)充有0.2％葡萄糖，40μg/ml異亮氨酸，40μg/ml纈氨酸，100μg/ml氨芐青霉素并且存在或不存在核苷類似物。
為最初的篩選，將200μl 2.5mM AraC，500μM AZT，500μM ddA或25mM ddC均勻地涂布在10ml固化的培養(yǎng)基表面，該培養(yǎng)基裝在8.5cm直徑的平板內(nèi)。37℃ 24小時(shí)后可以肉眼觀察到菌落的生長。從在含有核苷類似物平板上不生長而在不含有核苷類似物的平板上正常生長的菌落中，分離出質(zhì)粒并再轉(zhuǎn)化到KY895中。這些菌落經(jīng)過再測試來核實(shí)質(zhì)粒引起的表型。
實(shí)施例2酶變體的表征測序使用Thermo Sequenase radio-labelled terminator循環(huán)測序試劑盒和P33標(biāo)記的ddNTPs(Amersham Corp.)通過Sanger雙脫氧法人工操作對純化的質(zhì)粒進(jìn)行測序。
測定LD100(體內(nèi)表征)為測定核苷類似物致死劑量(LD100)(在該致死劑量，細(xì)菌沒有生長)，對數(shù)稀釋核苷類似物，在M9平板上測定所有對至少一種核苷類似物提高了靈敏度的克隆。濃度范圍為10-1000μM AraA，3.16-1000μM AraC；0.01-100μM AZT；0.316-31.6μM ddA；0.0316-100μM 2CdA或10-3500μM ddC的平板用于測定假定的突變體的LD100(能夠?qū)е?00％死亡的濃度)。
在倒平板之前在可能的最低溫度混合培養(yǎng)基和類似物來制備平板。
這些測定的結(jié)果如下面表2所示。
表2LD100


蛋白表達(dá)和純化(體外表征)在大腸桿菌BL21菌株(Pharmecia Biotech，瑞典)中得到的表達(dá)高于KY895細(xì)胞。如Munch-Petersen等人所描述，表達(dá)和純化凝血酶切割的重組野生型Dm-dNK或突變MuD[J.Biol.Chem.2000 275(9)6673-6679]。純化的蛋白命名為rDm-dNK或rMuD。
酶分析使用氚標(biāo)記的底物進(jìn)行DE-81濾紙分析，通過基于4個(gè)時(shí)間樣品的起始速率的測量來測定核苷激酶活性?？晒┻x擇地，ADP的產(chǎn)量可通過分光光度法進(jìn)行測定。這兩種方法可如Munch-Petersen等人所描述實(shí)施[J.Biol.Chem.2000 275(9)6673-6679]。
動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)的分析按Knecht等人的描述，使用Michaelis-Menten等式v＝Vmax×[S]/(Km+[S])，通過非線性回歸分析，評(píng)價(jià)動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)[KnechtW，Bergjohann U，Gonski S，Kirschbaum B，Loffler MFunctionalexpression of a fragment of human dihydroototate dehydrogenaseby means of the baculovirus expression vector system，andkinetic investigation of the purified recombinant enzyme；Eur.J.Biolchem.1996 240(1)292-301]。
將在各種抑制劑濃度[I]存在下的反應(yīng)速率代入等式v1＝V0/(1+[I]/IC50)，從而測定出對酶活性達(dá)到50％抑制的濃度(IC50)。v1和v0分別是在抑制劑存在或不存在下的速率。
為鑒定抑制的類型，在3種不同的抑制劑濃度下測定Vmax和Km值。相較于非抑制性酶反應(yīng)的常數(shù)，Vmax和Km值的偏差被認(rèn)為用來測定抑制是競爭性，反競爭性還是非競爭性的。
一旦建立了一種抑制模式，以非競爭性抑制的不變等式v＝Vmax×[S]/{Km×(1+[I]/Kic)+(1+[I]/Kiu)×[S]}擬合整個(gè)數(shù)據(jù)組。Kic是競爭性抑制常數(shù)，Kiu是反競爭性抑制常數(shù)[Liebecg CIUBMB Biochemicalmonenclature and related documents；Portland Press，London，1992]。
實(shí)施例3
序列測定在National Institute for Biotechnology information的GenBank數(shù)據(jù)庫中，用the basic local alignment search tool(BLAST)搜索公眾可利用的表達(dá)序列標(biāo)記(EST)文庫，鑒定編碼類似于Dm-dNK的酶(GenBanK ACCN AF226281)的ESTs。通過這種方法，鑒定出了來自家蠶的ESTs ACCN AU004911和來自滑爪蟾的ACCN AW159435。
ESTs獲自基因組研究組(Genome Research Group)，NationalInstitute of Radiological Sciences，Anagawa 4-9-1，Inage，Chiba 263-8555，日本(ACCN AU004911)和Lita Annenberg HazenGenome Sequencing Center，Cold Spring Harbor Laboratory，PO Box100，Cold Spring Harbor，NY 11724，USA(AW159435)。通過DNA序列測定測定這兩個(gè)ESTs編碼的脫氧核糖核苷激酶的完整開放閱讀框(見實(shí)施例2)。
然后將完整開放閱讀框提交到GenBank并被分配編號(hào)ACCNAF226281(家蠶脫氧核糖核苷激酶，如SEQ ID NO3所示)和ACCNAF250861(滑爪蟾脫氧核糖核苷激酶，如SEQ ID NO5所示)。
實(shí)施例4雜種酶本實(shí)施例說明了在表達(dá)載體pGEX-2T中構(gòu)建雜種酶(分別是pGEX-2T-rdmk/bmk和pGEX-2T-rbmk/dmk)。
表達(dá)質(zhì)粒pGEX-2T-rBm-dNK基本上Munch-Petersen等人構(gòu)建pGEX-2T-rDm-dNK的描述[J.Biol.Chem.2000 275(9)6673-6679]，使用引物Bmfor1和Bmrev1，以家蠶激酶的cDNA(如實(shí)施例3所述制備)作為模板來構(gòu)建。
進(jìn)行下述第一次PCR

PCR條件94℃變性5分鐘；然后94℃ 1分鐘，50℃ 1分鐘，72℃ 1分鐘，如此進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72℃延長10分鐘。
從所有4個(gè)PCR中得到的片段通過獲自Boenringer Mannheim的PCR Purification Kit進(jìn)行純化。
然后進(jìn)行下面的第二次PCR

PCR條件94℃變性5分鐘；然后94℃ 1分鐘，45℃ 5分鐘，72℃ 1分鐘，如此進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72℃延長10分鐘。
所獲的片段被切割，純化并亞克隆到按實(shí)施例1所述制備的表達(dá)載體中。
引物Dm-TK3(SEQ ID NO7)；Dm-TK4(SEQ ID NO8)；pGEX-2Tfor5’-acg ttt ggt ggt ggc gac ca-3’(SEQ ID NO13)；pGEX-2Trev5’-ctc cgg gag ctg cat gtg tc-3’(SEQ ID NO14)；bmk-Nterm5’-cta aaa atg gag cgc tcc att agc ttt act gga gtt gg-3’(SEQ ID NO15)；dmk-Cterm5’-cca gta aag cta atg gag cgc tcc att ttt agc gc-3’(SEQ ID NO16)；dmk-Nterm5’-gaa taa tga tcg ctc cat tat ttt tag ctt ctt gt-3’(SEQ ID NO17)；bmk-Cterm5’-aag cta aaa ata atg gag cga tca tta ttc agt gc-3’(SEQ ID NO18)；Bmfor15’-tat cgc gga tcc atg agt gcc aac aat gtt aaa cca ttc acc-3’(SEQ ID NO19)；和Bmrev15’-ccg gaa ttc gtc gac tta taa gat cct cat gtg agg tgt gat ctt g-3’(SEQ ID NO20).
序列表<160>20<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>750<212>DNA<213>黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)<220><221>CDS<222>(1)..(750)<400>1atg gcg gag gca gca tcc tgt gcc cga aag ggg acc aag tac gcc gag48Met Ala Glu Ala Ala Ser Cys Ala Arg Lys Gly Thr Lys Tyr Ala Glu1 5 10 15ggc acc cag ccc ttc acc gtc ctc atc gag ggc aac atc ggc agc ggg96Gly Thr Gln Pro Phe Thr Val Leu Ile Glu Gly Asn Ile Gly Ser Gly20 25 30aag acc acg tat ttg aac cac ttc gag aag tac aag aac gac att tgc144Lys Thr Thr Tyr Leu Asn His Phe Glu Lys Tyr Lys Asn Asp Ile Cys35 40 45ctg ctg acc gag ccc gtc gag aag tgg cgc aac gtc aac ggg gta aat192Leu Leu Thr Glu Pro Val Glu Lys Trp Arg Asn Val Asn Gly Val Asn50 55 60ctg ctg gag ctg atg tac aaa gat ccc aag aag tgg gcc atg ccc ttt240Leu Leu Glu Leu Met Tyr Lys Asp Pro Lys Lys Trp Ala Met Pro Phe65 70 75 80cag agt tat gtc acg ctg acc atg ctg cag tcg cac acc gcc cca acc288Gln Ser Tyr Val Thr Leu Thr Met Leu Gln Ser His Thr Ala Pro Thr85 90 95aac aag aag cta aaa ata atg gag cgc tcc att ttt agc gct cgc tat336Asn Lys Lys Leu Lys Ile Met Glu Arg Ser Ile Phe Ser Ala Arg Tyr100 105 110tgc ttc gtg gag aac atg cga cga aac ggc tcg ctg gag cag ggc atg384Cys Phe Val Glu Asn Met Arg Arg Asn Gly Ser Leu Glu Gln Gly Met115 120 125tac aat acg ctg gag gag tgg tac aag ttc atc gaa gag tcc att cac432Tyr Asn Thr Leu Glu Glu Trp Tyr Lys Phe Ile Glu Glu Ser Ile His130 135 140gtg cag gcg gac ctc atc ata tat ctg cgc acc tcg ccg gag gtg gcg480Val Gln Ala Asp Leu Ile Ile Tyr Leu Arg Thr Ser Pro Glu Val Ala145 150 155 160tac gaa cgc atc cgg cag cgg gct cgt tct gag gag agc tgc gtg ccg528Tyr Glu Arg Ile Arg Gln Arg Ala Arg Ser Glu Glu Ser Cys Val Pro165 170 175ctt aag tac ctt cag gag ctg cat gag ttg cac gag gac tgg ttg ata576Leu Lys Tyr Leu Gln Glu Leu His Glu Leu His Glu Asp Trp Leu Ile180 185 190cac cag aga cga ccg cag tcg tgc aag gtc cta gtc ctc gat gcc gat624His Gln Arg Arg Pro Gln Ser Cys Lys Val Leu Val Leu Asp Ala Asp195 200 205ctg aac ctg gaa aac att ggc acc gag tac cag cgc tcg gag agc agc672Leu Agn Leu Glu Asn Ile Gly Thr Glu Tyr Gln Arg Ser Glu Ser Ser210 215 220ata ttc gac gcc atc tca agt aac caa cag ccc tcg ccg gtt ctg gtg720Ile Phe Asp Ala Ile Ser Ser Asn Gln Gln Pro Ser Pro Val Leu Val225 230 235 240tcg ccc agc aag cgc cag agg gtc gcc aga750Ser Pro Ser Lys Arg Gln Arg Val Ala Arg245 250<210>2<211>250<212>PRT<213>黑腹果蠅<400>2Met Ala Glu Ala Ala Ser Cys Ala Arg Lys Gly Thr Lys Tyr Ala Glu1 5 10 15Gly Thr Gln Pro Phe Thr Val Leu Ile Glu Gly Asn Ile Gly Ser Gly20 25 30Lys Thr Thr Tyr Leu Asn His Phe Glu Lys Tyr Lys Asn Asp Ile Cys35 40 45Leu Leu Thr Glu Pro Val Glu Lys Trp Arg Asn Val Asn Gly Val Asn50 55 60Leu Leu Glu Leu Met Tyr Lys Asp Pro Lys Lys Trp Ala Met Pro Phe65 70 75 80Gln Ser Tyr Val Thr Leu Thr Met Leu Gln Ser His Thr Ala Pro Thr85 90 95Asn Lys Lys Leu Lys Ile Met Glu Arg Ser Ile Phe Ser Ala Arg Tyr100 105 110Cys Phe Val Glu Asn Met Arg Arg Asn Gly Ser Leu Glu Gln Gly Met115 120 125Tyr Asn Thr Leu Glu Glu Trp Tyr Lys Phe Ile Glu Glu Ser Ile His130 135 140Val Gln Ala Asp Leu Ile Ile Tyr Leu Arg Thr Ser Pro Glu Val Ala145 150 155 160Tyr Glu Arg Ile Arg Gln Arg Ala Arg Ser Glu Glu Ser Cys Val Pro165 170 175Leu Lys Tyr Leu Gln Glu Leu His Glu Leu His Glu Asp Trp Leu Ile180 185 190His Gln Arg Arg Pro Gln Ser Cys Lys Val Leu Val Leu Asp Ala Asp195 200 205Leu Asn Leu Glu Asn Ile Gly Thr Glu Tyr Gln Arg Ser Glu Ser Ser210 215220Ile Phe Asp Ala Ile Ser Ser Asn Gln Gln Pro Ser Pro Val Leu Val225 230 235 240Ser Pro Ser Lys Arg Gln Arg Val Ala Arg245 250<210>3<211>747<212>DNA<213>家蠶(Bombyx mori)<220><221>CDS<222>(1)..(747)<400>3atg agt gcc aac aat gtt aaa cca ttc acc gtg ttc gtg gaa ggt aac48Met Ser Ala Asn Asn Val Lys Pro Phe Thr Val Phe Val Glu Gly Asn1 5 10 15ata ggt agc ggt aaa aca aca ttt ctg gaa cat ttt cgt cag ttt gag96Ile Gly Ser Gly Lys Thr Thr Phe Leu Glu His Phe Arg Gln Phe Glu20 25 30gat atc act ttg ttg acg gag ccc gtt gaa atg tgg cga gat ctt aaa144Asp Ile Thr Leu Leu Thr Glu Pro Val Glu Met Trp Arg Asp Leu Lys35 40 45ggt tgc aat ctt ttg gaa ctc atg tac aaa gat cca gaa aaa tgg gcg192Gly Cys Asn Leu Leu Glu Leu Met Tyr Lys Asp Pro Glu Lys Trp Ala50 55 60atg aca ttc cag tca tac gtt tcc ttg acg atg ttg gac atg cac cgg240Met Thr Phe Gln Ser Tyr Val Ser Leu Thr Met Leu Asp Met His Arg65 70 75 80aga cct gct cca act cca gta aag cta atg gag cga tca tta ttc agt288Arg Pro Ala Pro Thr Pro Val Lys Leu Met Glu Arg Ser Leu Phe Ser85 90 95gcg aga tac tgc ttc gtt gaa cac att atg aga aat aat aca ctc cat336Ala Arg Tyr Cys Phe Val Glu His Ile Met Arg Asn Asn Thr Leu His100 105 110cca gca cag ttt gca gta ctt gat gag tgg ttc cga ttc atc caa cac384Pro Ala Gln Phe Ala Val Leu Asp Glu Trp Phe Arg Phe Ile Gln His115 120 125aac att cct att gat gct gat ttg ata gta tat cta aag aca tca cct432Asn Ile Pro Ile Asp Ala Asp Leu Ile Val Tyr Leu Lys Thr Ser Pro130 135 140tca ata gtg tac caa agg ata aaa aag aga gct cgt tca gaa gag cag480Ser Ile Val Tyr Gln Arg Ile Lys Lys Arg Ala Arg Ser Glu Glu Gln145 150 155 160tgt gtg ccc ctg tca tac att gag gaa ctg cat 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Glu Leu Met Tyr Lys Asp Pro Glu Lys Trp Ala50 55 60Met Thr Phe Gln Ser Tyr Val Ser Leu Thr Met Leu Asp Met His Arg65 70 75 80Arg Pro Ala Pro Thr Pro Val Lys Leu Met Glu Arg Ser Leu Phe Ser85 90 95Ala Arg Tyr Cys Phe Val Glu His Ile Met Arg Asn Asn Thr Leu His100 105 110Pro Ala Gln Phe Ala Val Leu Asp Glu Trp Phe Arg Phe Ile Gln His115 120 125Asn Ile Pro Ile Asp Ala Asp Leu Ile Val Tyr Leu Lys Thr Ser Pro130 135 140Ser Ile Val Tyr Gln Arg Ile Lys Lys Arg Ala Arg Ser Glu Glu Gln145 150 155 160Cys Val Pro Leu Ser Tyr Ile Glu Glu Leu His Arg Leu His Glu Asp165 170 175Trp Leu Ile Asn Arg Ile His Ala Glu Cys Pro Ala Pro Val Leu Val180 185 190Leu Asp Ala Asp Leu Asp Leu Ser Gln Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Arg195 200 205Ser Glu His Gln Ile Leu Arg Lys Ala Val Asn Val Val Met Ser Ser210 215 220Pro Asn Lys His Ser Pro Lys Lys Pro Ile Ser Thr Thr Pro Ile Lys225 230 235 240Ile Thr Pro His Met Arg Ile Leu245<210>5<211>837<212>DNA<213>滑爪蟾(Xenopus laevis)<220><221>CDS<222>(1)..(837)<400>5atg tca gta cta cta gct gcc cgg aca tgt ata cgg ctc tgt tgt act48Met Ser Val Leu Leu Ala Ala Arg Thr Cys Ile Arg Leu Cys Cyg Thr1 5 10 15gaa cat aaa aca ggc gct ctg gcg agg ttt aac ctc ggc gca aat act96Glu His Lys Thr Gly Ala Leu Ala Arg Phe Asn Leu Gly Ala Asn Thr20 25 30gcc ctg act gtt aga aga ata gcg agc gct ttg tgc ggc aga tgc aac144Ala Leu Thr Val Arg Arg Ile Ala Ser Ala Leu Cys Gly Arg Cys Asn35 40 45atc atg cgg aga gga ata ttg ccc tcg ggg agc aca ggt aat ggt cta192Ile Met Arg Arg Gly Ile Leu Pro Ser Gly Ser Thr Gly Asn Gly Leu50 55 60aaa agc cga gag aag agc aca gta att tgt gtg gag ggg aat att gca240Lys Ser Arg Glu Lys Ser Thr Val Ile Cys Val Glu Gly Asn Ile Ala65 70 75 80agt gga aaa aca agc tgc ttg gat tat ttt tct aat act cca gat ctt288Ser Gly Lys Thr Ser Cys Leu Asp Tyr Phe Ser Asn Thr Pro Asp Leu85 90 95gag gta ttc aag gag cct gta gct aaa tgg aga aat gtc tgt ggc cat336Glu Val Phe Lys Glu Pro Val Ala Lys Trp Arg Asn Val Cys Gly His100 105 110aac cca ctt ggt tta atg tat caa gat cct aac aag tgg 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cta720Pro Leu Glu Tyr Leu Cys Ala Ile His Asn Leu Tyr Glu Asp Trp Leu225 230 235 240gtt aaa cag acg tcc ttc tca gtg ccg gca ccc gtg ctt gta ata gat768Val Lys Gln Thr Ser Phe Ser Val Pro Ala Pro Val Leu Val Ile Asp245 250 255ggt aat aaa gaa cta gag gaa ttg act caa cac tat gaa gag aat cgc816Gly Asn Lys Glu Leu Glu Glu Leu Thr Gln His Tyr Glu Glu Asn Arg260 265 270acc agc atc ttg tca ctg taa837Thr Ser Ile Leu Ser Leu275<210>6<211>278<212>PRT<213>滑爪蟾<400>6Met Ser Val Leu Leu Ala Ala Arg Thr Cys Ile Arg Leu Cys Cys Thr1 5 10 15Glu His Lys Thr Gly Ala Leu Ala Arg Phe Asn Leu Gly Ala Asn Thr20 25 30Ala Leu Thr Val Arg Arg Ile Ala Ser Ala Leu Cys Gly Arg Cys Asn35 40 45Ile Met Arg Arg Gly Ile Leu Pro Ser Gly Ser Thr Gly Asn Gly Leu50 55 60Lys Ser Arg Glu Lys Ser Thr Val Ile Cys Val Glu Gly Asn Ile Ala65 70 75 80Ser Gly Lys Thr Ser Cys Leu Asp Tyr Phe Ser Asn Thr Pro Asp Leu85 90 95Glu Val Phe Lys Glu Pro Val Ala Lys Trp Arg Asn Val Cys Gly His100 105 110Asn Pro Leu Gly Leu Met Tyr Gln Asp Pro Asn Lys Trp Gly Leu Thr115 120 125Leu Gln Thr Tyr Val Gln Leu Thr Met Leu Asp Ile His Thr Lys Pro130 135 140Ser Ile Ser Pro Val Lys Met Met Glu Arg Ser Ile Tyr Ser Ala Lys145 150 155 160Tyr Ile Phe Val Glu Asn Leu Tyr Gln Ser Gly Lys Met Pro Ala Val165 170 175Asp Tyr Ala Ile Leu Thr Glu Trp Phe Lys Trp Ile Val Lys Asn Thr180 185 190Asp Thr Ser Val Asp Leu Ile Val Tyr Leu Gln Thr Ser Pro Glu Ile195 200 205Cys Tyr Gln Arg Leu Lys Lys Arg Cys Arg Glu Glu Glu Ser Val Ile210 215 220Pro Leu Glu Tyr Leu Cys Ala Ile His Asn Leu Tyr Glu Asp Trp Leu225 230 235 240Val Lys Gln Thr Ser Phe Ser Val Pro Ala Pro Val Leu Val Ile Asp245 250 255Gly Asn Lys Glu Leu Glu Glu Leu Thr Gln His Tyr Glu Glu Asn Arg260 265 270Thr Ser Ile Leu Ser Leu275<210>7<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明PCR引物序列<400>7cgcggatcca tggcggaggc agcatcct 28<210>8<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明PCR引物序列<400>8cggaattctt atctggcgac cctctggcgt30<210>9<211>711<212>DNA<213>雜種<220><221>CDS<222>(1)..(711)<223>1-270家蠶；271-711黑腹果蠅<400>9atg agt gcc aac aat gtt aaa cca ttc acc gtg ttc gtg gaa ggt aac48Met Ser Ala Asn Asn Val Lys Pro Phe Thr Val Phe Val Glu Gly Asn1 5 10 15ata ggt agc ggt aaa aca aca ttt ctg gaa cat ttt cgt cag ttt gag96Ile Gly Ser Gly Lys Thr Thr Phe Leu Glu His Phe Arg Gln Phe Glu20 25 30gat atc act ttg ttg acg gag ccc gtt gaa atg tgg cga gat ctt aaa144Asp Ile Thr Leu Leu Thr Glu Pro Val Glu Met Trp Arg Asp Leu Lys35 40 45ggt tgc aat ctt ttg gaa ctc atg tac aaa gat cca gaa aaa tgg gcg192Gly Cys Asn Leu Leu Glu Leu Met Tyr Lys Asp Pro Glu Lys Trp Ala50 55 60atg aca ttc cag tca tac gtt tcc ttg acg atg ttg gac atg cac cgg240Met Thr Phe Gln Ser Tyr Val Ser Leu Thr Met Leu Asp Met His Arg65 70 75 80aga cct gct cca act cca gta aag cta atg gag cgc tcc att ttt agc288Arg Pro Ala Pro Thr Pro Val Lys Leu Met Glu Arg Ser Ile Phe Ser85 90 95gct cgc tat tgc ttc gtg gag aac atg cga cga aac ggc tcg ctg gag336Ala Arg Tyr Cys Phe Val Glu Asn Met Arg Arg Asn Gly Ser Leu Glu100 105 110cag ggc atg tac aat acg ctg gag gag tgg tac aag ttc atc gaa gag384Gln Gly Met Tyr Asn Thr Leu Glu Glu Trp Tyr Lys Phe Ile Glu Glu115 120 125tcc att cac gtg cag gcg gac ctc atc ata tat ctg cgc acc tcg ccg432Ser Ile His Val Gln Ala Asp Leu Ile Ile Tyr Leu Arg Thr Ser Pro130 135 140gag gtg gcg tac gaa cgc atc cgg cag cgg gct cgt tct gag gag agc480Glu Val Ala Tyr Glu Arg Ile Arg Gln Arg Ala Arg Ser Glu Glu Ser145 150 155 160tgc gtg ccg ctt aag tac ctt cag gag ctg cat gag ttg cac gag gac528Cys Val Pro Leu Lys Tyr Leu Gln Glu Leu His Glu Leu His Glu Asp165 170 175tgg ttg ata cac cag aga cga ccg cag tcg tgc aag gtc cta gtc ctc576Trp Leu Ile His Gln Arg Arg Pro Gln Ser Cys Lys Val Leu Val Leu180 185 190gat gcc gat ctg aac ctg gaa aac att ggc acc gag tac cag cgc tcg624Asp Ala Asp Leu Asn Leu Glu Asn Ile Gly Thr Glu Tyr Gln Arg Ser195 200 205gag agc agc ata ttc gac gcc atc tca agt aac caa cag ccc tcg ccg672Glu Ser Ser Ile Phe Asp Ala Ile Ser Ser Asn Gln Gln Pro Ser Pro210 215 220gtt ctg gtg tcg ccc agc aag cgc cag agg gtc gcc aga711Val Leu Val Ser Pro Ser Lys Arg Gln Arg Val Ala Arg225 230 235<210>10<211>237<212>PRT<213>雜種<400>10Met Ser Ala Asn Asn Val Lys Pro Phe Thr Val Phe Val Glu Gly Asn1 5 10 15Ile Gly Ser Gly Lys Thr Thr Phe Leu Glu His Phe Arg Gln Phe Glu20 25 30Asp Ile Thr Leu Leu Thr Glu Pro Val Glu Met Trp Arg Asp Leu Lys35 40 45Gly Cys Asn Leu Leu Glu Leu Met Tyr Lys Asp Pro Glu Lys Trp Ala50 55 60Met Thr Phe Gln Ser Tyr Val Ser Leu Thr Met Leu Asp Met His Arg65 70 75 80Arg Pro Ala Pro Thr Pro Val Lys Leu Met Glu Arg Ser Ile Phe Ser85 90 95Ala Arg Tyr Cys Phe Val Glu Asn Met Arg Arg Asn Gly Ser Leu Glu100 105 110Gln Gly Met Tyr Asn Thr Leu Glu Glu Trp Tyr Lys Phe Ile Glu Glu115 120 125Ser Ile His Val Gln Ala Asp Leu Ile Ile Tyr Leu Arg Thr Ser Pro130 135 140Glu Val Ala Tyr Glu Arg Ile Arg Gln Arg Ala Arg Ser Glu Glu Ser145 150 155 160Cys Val Pro Leu Lys Tyr Leu Gln Glu Leu His Glu Leu His Glu Asp165 170 175Trp Leu Ile His Gln Arg Arg Pro Gln Ser Cys Lys Val Leu Val Leu180 185 190Asp Ala Asp Leu Asn Leu Glu Asn Ile Gly Thr Glu Tyr Gln Arg Ser195 200 205Glu Ser Ser Ile Phe Asp Ala Ile Ser Ser Asn Gln Gln Pro Ser Pro210 215 220Val Leu Val Ser Pro Ser Lys Arg Gln Arg Val Ala Arg225 230 235<210>11<211>786<212>DNA<213>雜種<220><221>CDS<222>(1)..(786)<223>1-309黑腹果蠅；310-786家蠶<400>11atg gcg gag gca gca tcc tgt gcc cga aag ggg acc aag tac gcc gag48Met Ala Glu Ala Ala Ser Cys Ala Arg Lys Gly Thr Lys Tyr Ala Glu1 5 10 15ggc acc cag ccc ttc acc gtc ctc atc gag ggc aac atc ggc agc ggg96Gly Thr Gln Pro Phe Thr Val Leu Ile Glu Gly Asn Ile Gly Ser Gly20 25 30aag acc acg tat ttg aac cac ttc gag aag tac aag aac gac att tgc144Lys Thr Thr Tyr Leu Asn His Phe Glu Lys Tyr Lys Asn Asp Ile Cys35 40 45ctg ctg acc gag ccc gtc gag aag tgg cgc aac gtc aac ggg gta aat192Leu Leu Thr Glu Pro Val Glu Lys Trp Arg Asn Val Asn Gly Val Asn50 55 60ctg ctg gag ctg atg tac aaa gat ccc aag aag tgg gcc atg ccc ttt240Leu Leu Glu Leu Met Tyr Lys Asp Pro Lys Lys Trp Ala Met Pro Phe65 70 75 80cag agt tat gtc acg ctg acc atg ctg cag tcg cac acc gcc cca acc288Gln Ser Tyr Val Thr Leu Thr Met Leu Gln Ser His Thr Ala Pro Thr85 90 95aac aag aag cta aaa ata atg gag cga tca tta ttc agt gcg aga tac336Asn Lys Lys Leu Lys Ile Met Glu Arg Ser Leu Phe Ser Ala Arg Tyr100 105 110tgc ttc gtt gaa cac att atg aga aat aat aca ctc cat cca gca cag384Cys Phe Val Glu His Ile Met Arg Asn Asn Thr Leu His Pro Ala Gln115 120 125ttt gca gta ctt gat gag tgg ttc cga ttc atc caa cac aac att cct432Phe Ala Val Leu Asp Glu Trp Phe Arg Phe Ile Gln His Asn Ile Pro130 135 140att gat gct gat ttg ata gta tat cta aag aca tca cct tca ata gtg480Ile Asp Ala Asp Leu Ile Val Tyr Leu Lys Thr Ser Pro Ser Ile Val145 150 155 160tac caa agg ata aaa aag aga gct cgt tca gaa gag cag tgt gtg ccc528Tyr Gln Arg Ile Lys Lys Arg Ala Arg Ser Glu Glu Gln Cys Val Pro165 170 175ctg tca tac att gag gaa ctg cat agg ttg cat gag gac tgg cta atc576Leu Ser Tyr Ile Glu Glu Leu His Arg Leu His Glu Asp Trp Leu Ile180 185 190aac agg ata cat gct gaa tgt ccc gca cca gta tta gtg tta gat gct624Asn Arg Ile His Ala Glu Cys Pro Ala Pro Val Leu Val Leu Asp Ala195 200 205gat tta gac ctc tct cag ata acc gat gaa tac aag aga agt gag cat672Asp Leu Asp Leu Ser Gln Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Arg Ser Glu His210 215 220caa att tta aga aag gct gtt aat gta gtt atg agt tca cca aac aag720Gln Ile Leu Arg Lys Ala Val Asn Val Val Met Ser Ser Pro Asn Lys225 230 235 240cat agc cca aag aaa cca ata tca aca aca cca atc aag atc aca cct768His Ser Pro Lys Lys Pro Ile Ser Thr Thr Pro Ile Lys Ile Thr Pro245 250 255cac atg agg atc tta taa 786His Met Arg Ile Leu260<210>12<211>261<212>PRT<213>雜種<400>12Met Ala Glu Ala Ala Ser Cys Ala Arg Lys Gly Thr Lys Tyr Ala Glu1 5 10 15Gly Thr Gln Pro Phe Thr Val Leu Ile Glu Gly Asn Ile Gly Ser Gly20 25 30Lys Thr Thr Tyr Leu Asn His Phe Glu Lys Tyr Lys Asn Asp Ile Cys35 40 45Leu Leu Thr Glu Pro Val Glu Lys Trp Arg Asn Val Asn Gly Val Asn50 55 60Leu Leu Glu Leu Met Tyr Lys Asp Pro Lys Lys Trp Ala Met Pro Phe65 70 75 80Gln Ser Tyr Val Thr Leu Thr Met Leu Gln Ser His Thr Ala Pro Thr85 90 95Asn Lys Lys Leu Lys Ile Met Glu Arg Ser Leu Phe Ser Ala Arg Tyr100 105 110Cys Phe Val Glu His Ile Met Arg Asn Asn Thr Leu His Pro Ala Gln115 120 125Phe Ala Val Leu Asp Glu Trp Phe Arg Phe Ile Gln His Asn Ile Pro130 135 140Ile Asp Ala Asp Leu Ile Val Tyr Leu Lys Thr Ser Pro Ser Ile Val145 150 155 160Tyr Gln Arg Ile Lys Lys Arg Ala Arg Ser Glu Glu Gln Cys Val Pro165 170 175Leu Ser Tyr Ile Glu Glu Leu His Arg Leu His Glu Asp Trp Leu Ile180 185 190Asn Arg Ile His Ala Glu Cys Pro Ala Pro Val Leu Val Leu Asp Ala195 200 205Asp Leu Asp Leu Ser Gln Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Arg Ser Glu His210 215 220Gln Ile Leu Arg Lys Ala Val Asn Val Val Met Ser Ser Pro Asn Lys225 230 235 240His Ser Pro Lys Lys Pro Ile Ser Thr Thr Pro Ile Lys Ile Thr Pro245 250 255His Met Arg Ile Leu260<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明PCR引物序列<400>13acgtttggtg gtggcgacca20<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明PCR引物序列<400>14ctccgggagc tgcatgtgtc20<210>15<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明PCR引物序列<400>15ctaaaaatgg agcgctccat tagctttact ggagttgg 38<210>16<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明PCR引物序列<400>16ccagtaaagc taatggagcg ctccattttt agcgc 35<210>17<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明PCR引物序列<400>17gaataatgat cgctccatta tttttagctt cttgt35<210>18<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明PCR引物序列<400>18aagctaaaaa taatggagcg atcattattc agtgc35<210>19<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明PCR引物序列<400>19tatcgcggat ccatgagtgc caacaatgtt aaaccattca cc42<210>20<211>46<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明PCR引物序列<400>20ccggaattcg tcgacttata agatcctcat gtgaggtgtg atcttg4權(quán)利要求
1.分離的編碼多底物脫氧核糖核苷激酶的突變多核苷酸，該突變多核苷酸與未突變的多核苷酸相比，在轉(zhuǎn)化到細(xì)菌或真核細(xì)胞中之后，使至少一種核苷類似物的致死劑量(LD100)降低至少4倍。
2.權(quán)利要求1的突變多核苷酸，其中所述的核苷類似物是阿昔洛韋(9-[2-羥基-乙氧基]-甲基-鳥嘌呤核苷)，布昔洛韋，泛昔洛韋，更昔洛韋(9-[2-羥基-1-(羥甲基)乙氧基甲基]-鳥嘌呤核苷)，噴昔洛韋，伐昔洛韋，三氟胸苷，AZT(3’-疊氮-3’-胸苷)，AIU(5’-碘-5’-氨基-2’，5’-雙脫氧尿苷)，ara-A(腺苷-阿拉伯糖苷；Vivarabine)，ara-C(胞苷-阿拉伯糖苷)，ara-G(9-β-D-阿拉伯呋喃糖基鳥嘌呤)，ara-T，1-β-D-阿拉伯呋喃糖基胸腺嘧啶，5-乙基-2’-脫氧尿苷，5-碘-5’-氨基-2，5’-雙脫氧尿苷，1-[2-脫氧-2-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖基]-5-碘尿嘧啶，碘苷(5-碘-2’脫氧尿苷)，氟達(dá)拉濱(2-氟腺嘌呤9-β-D-阿拉伯呋喃糖苷)，吉西他濱(gencitabine)，2’，3’-雙脫氧次黃嘌呤核苷(ddI)，2’，3’-雙脫氧胞苷(ddC)，2’，3’-雙脫氧胸苷(ddT)，2’，3’-雙脫氧腺苷(ddA)，2’，3’-雙脫氧鳥苷(ddG)，2-氯-2’-脫氧腺苷(2CdA)，5-氟脫氧尿苷，BVaraU((E)-5-(2-溴乙烯基)-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基尿嘧啶)，BVDU(5-溴乙烯基-脫氧尿苷)，F(xiàn)IAU(1-(2-脫氧-2-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-碘尿嘧啶)，3TC(2’-脫氧-3’-硫雜胞苷)，dFdC吉西他濱(2’，2’-雙氟脫氧胞苷)，dFdG(2’，2’-雙氟脫氧鳥苷)或者d4T(2’，3’雙脫氫-3’-脫氧胸苷)。
3.權(quán)利要求1的突變多核苷酸，其中該突變多核苷酸使至少兩種不同的核苷類似物的致死劑量(LD100)降低了至少4倍，該核苷類似物類似性基于兩種不同的糖部分和兩種不同的堿基部分。
4.權(quán)利要求1-3的多核苷酸所編碼的分離的脫氧核糖核苷激酶變體。
5.權(quán)利要求4的酶變體，其中該變體與野生型酶相比在下列方面被改變(i)“kcat/Km(底物)/kcat/Km(核苷類似物)”比率至少被降低5倍；和/或(ii)如使用2或10μM胸苷(dThd)作為底物測定的，NTP和dNTPs，尤其是TTP的反饋抑制被降低了至少1.5倍。
6.權(quán)利要求4的酶變體，其使至少兩種不同的核苷類似物的致死劑量(LD100)降低至少4倍，該核苷類似物的類似性基于兩種不同的糖部分和兩種不同的堿基部分。
7.權(quán)利要求4的酶變體，該變體與野生型酶相比，在下述位置是突變的(i)在非基序和/或非保守區(qū)域；和/或(ii)僅在一個(gè)基序和/或保守區(qū)域；和/或(iii)在任何保守的位置；該區(qū)域和位置在表1中定義。
8.權(quán)利要求4的酶變體，該變體在下述的一個(gè)或多個(gè)位置上包含突變(包括替換，增加和缺失)位置51，62，82，91，100，102，107，112，114，134，138，139，140，164，167，168，171，199，202，207，211，213，214，216，217，220，222，228，229，274，277，281，283，284，307，309，316，318，321，334，347，和352(dNK編號(hào))。
9.權(quán)利要求6的酶變體，該變體包含相對于G80，N81，I82，G83，S84，G85，K86，T87，T88，E107，P108，V109，E110，K111，W112，Y140，Q164，E201，R202，S203，C210，Y211，C212，P258，R265，I266，R267，Q268，R269，A270，R271，E274，L279，L282，或者L293保守的替換(dNK編號(hào))。
10.權(quán)利要求6的酶變體，該變體包含一個(gè)或多個(gè)下述的突變M51T；T62A；N91D；N100D；I102T；N114D；N134D；N134S；L138S；M139L；M139V；V167A；V167S；V167M；T168A；M171R；I199M；A207D；V214A；N216S；M217V；N220S；S222W；Y228C；N229S；V277A；Y281H；S307P；K309R；D316N；N318D；N321S；F334L；L347P；和K352N(dNK編號(hào))。
11.權(quán)利要求8的酶變體，該變體包含M51T/T168A/N220S；T62A/V167A/N321S；N91D/N134D；N100D/N134D；N100D/N134D/N318D/L347P；N100D/N134D/I199M/N216S/M217V/D316N；I102T/N318D；N114D/M217V/Y281H；N134S/L138S/M139L/K352N；M139V/N318D/L347P；V167A/M171R/A207D；V167S/M171R/A207D；V167A/I199M/N216S/M217V/D316N；V167A/N318D/L347P；T168A/N318D/L347P；T168A/I199M/N216S/M217V/D316N；M171R/A207D；I199M/V214A/N216S/M217V/D316N；I199M/N216S/M217V/N229S/S307P/D316N；I199M/N216S/M217V/D316N；S222W/F334L；Y228C/V277A/K309R；或N318D/L347P(dNK編號(hào))。
12.權(quán)利要求3-9任一項(xiàng)的酶變體，該變體來自多底物脫氧核糖核苷激酶。
13.權(quán)利要求3-9任一項(xiàng)的酶變體，該變體是來自人胸苷激酶2(hu-TK2)、或人脫氧鳥苷激酶(hu-dGK)、或人脫氧胞苷激酶(hu-dCK)、或單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV1-TK)的脫氧核糖核苷激酶。
14.權(quán)利要求3-9任一項(xiàng)的酶變體，該變體來自昆蟲多底物脫氧核糖核苷激酶。
15.權(quán)利要求14的酶變體，其為來自兩種或更多種昆蟲多底物脫氧核糖核苷激酶的雜種脫氧核糖核苷激酶。
16.權(quán)利要求15的酶變體，該雜種脫氧核糖核苷激酶含有至少5個(gè)來自每種昆蟲多底物脫氧核糖核苷激酶的連續(xù)氨基酸。
17.權(quán)利要求14的酶變體，該變體是來自黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)脫氧核糖核苷激酶(Dm-dNK)，或家蠶(Bombyx mori)脫氧核糖核苷激酶(Bm-dNK)，或滑爪蟾(Xenopus laevis)脫氧核糖核苷激酶(Xen-dNK)或?qū)葋啺次?Anopheles gambia)脫氧核糖核苷激酶的脫氧核糖核苷激酶。
18.權(quán)利要求17的酶變體，其為Dm-dNK/M51T；Dm-dNK/M51T/T168A/N220S；Dm-dNK/T62A；Dm-dNK/T62A/V167A/N321S；Dm-dNK/N91D；Dm-dNK/N91D/N134D；Dm-dNK/N100D；Dm-dNK/N100D/N134D；Dm-dNK/N100D/N134D/N318D/L347P；Dm-dNK/N100D/N134D/I199M/N216S/M217V/D316N；Dm-dNK/I102T；Dm-dNK/I102T/N318D；Dm-dNK/N114D；Dm-dNK/N114D/M217V/Y281H；Dm-dNK/N134D；Dm-dNK/N134S；Dm-dNK/N134S/L138S/M139L/K352N；Dm-dNK/L138S；Dm-dNK/M139L；Dm-dNK/M139V；Dm-dNK/M139V/N318D/L347P；Dm-dNK/V167A；Dm-dNK/V167A/I199M/N216S/M217V/D316N；Dm-dNK/V167A/N318D/L347P；Dm-dNK/V167A/M171R/A207D；Dm-dNK/V167S/M171R/A207D；Dm-dNK/T168A；Dm-dNK/T168A/N318D/L347P；Dm-dNK/T168A/I199M/N216S/M217V/D316N；Dm-dNK/M171R/A207D；Dm-dNK/I199M；Dm-dNK/I199M/V214A/N216S/M217V/D316N；Dm-dNK/I199M/N216S/M217V/D316N；Dm-dNK/I199M/N216S/M217V/N229S/S307P/D316N；Dm-dNK/V214A；Dm-dNK/N216S；Dm-dNK/M217V；Dm-dNK/N220S；Dm-dNK/S222W；Dm-dNK/S222W/F334L；Dm-dNK/Y228C；Dm-dNK/Y228C/V277A/K309R；Dm-dNK/N229S；Dm-dNK/V277A；Dm-dNK/Y281H；Dm-dNK/S307P；Dm-dNK/K309R；Dm-dNK/D316N；Dm-dNK/N318D；Dm-dNK/N318D/L347P；Dm-dNK/N321S；Dm-dNK/F334L；Dm-dNK/L347P；或Dm-dNK/K352N(dNK編號(hào))。
19.權(quán)利要求17的酶變體，其為Bm-dNK/E91D；Bm-dNK/E91D/N134D；Bm-dNK/-100D；Bm-dNK/-100D/N134D；Bm-dNK/-100D/N134D/K347P；Bm-dNK/-100D/N134D/L199M/H216S/I217V/D316N；Bm-dNK/I102T；Bm-dNK/N114D；Bm-dNK/N114D/I217V/Y281H；Bm-dNK/N134D；Bm-dNK/N134S；Bm-dNK/N134S/L138S/M139L/K352N；Bm-dNK/L138S；Bm-dNK/M139L；Bm-dNK/M139V；Bm-dNK/M139V/K347P；Bm-dNK/V167A；Bm-dNK/V167A/M171R/A207D；Bm-dNK/V167S/M171R/A207D；Bm-dNK/V167A/L199M/H216S/I217V/D316N；Bm-dNK/V167A/Q321S；Bm-dNK/V167A/K347P；Bm-dNK/S168A；Bm-dNK/S168A/L199M/H216S/I217V/D316N；Bm-dNK/S168A/N220S；Bm-dNK/S168A/K347P；Bm-dNK/L199M；Bm-dNK/L199M/H216S/I217V/D316N；Bm-dNK/L199M/V214A/H216S/I217V/D316N；Bm-dNK/I199M/H216S/I217V/A229S/D316N；Bm-dNK/M171R/A207D；Bm-dNK/V214A；Bm-dNK/H216S；Bm-dNK/I217V；Bm-dNK/N220S；Bm-dNK/T222W；Bm-dNK/F228C；Bm-dNK/F228C/V277A/P309R；Bm-dNK/V277A；Bm-dNK/A229S；Bm-dNK/Y281H；Bm-dNK/P309R；Bm-dNK/D316N；Bm-dNK/Q321S；Bm-dNK/L334L；Bm-dNK/K347P；或Bm-dNK/K352N(dNK編號(hào))。
20.權(quán)利要求17的酶變體，其為Xen-dNK/M51T；Xen-dNK/M51T/Q168A；Xen-dNK/G62A；Xen-dNK/G62A/V167A/E321S；Xen-dNK/-100D；Xen-dNK/-100D/N134D；Xen-dNK/-100D/N134D/E318D；Xen-dNK/-100D/N134D/N216S/L217V；Xen-dNK/L102T；Xen-dNK/L102T/E318D；Xen-dNK/N114D；Xen-dNK/N114D/L217V/Y281H；Xen-dNK/N134D；Xen-dNK/N134S；Xen-dNK/N134S/L138S/M139L；Xen-dNK/L138S；Xen-dNK/M139L；Xen-dNK/M139V；Xen-dNK/M139V/E318D/；Xen-dNK/V167A；Xen-dNK/V167A/M171R/A207D；Xen-dNK/V167S/M171R/A207D；Xen-dNK/V167A/N216S/L217V；Xen-dNK/V167A/E318D；Xen-dNK/Q168A；Xen-dNK/Q168A/N216S/L217V；Xen-dNK/Q168A/E318D；Xen-dNK/M171R/A207D；Xen-dNK/V214A；Xen-dNK/V214A/N216S/L217V；Xen-dNK/N216S；Xen-dNK/N216S/L217V；Xen-dNK/N216S/L217V/A229S；Xen-dNK/L217V；Xen-dNK/K222W；Xen-dNK/Y228C；Xen-dNK/Y228C/I277A/P309R；Xen-dNK/A229S；Xen-dNK/I277A；Xen-dNK/Y281H；Xen-dNK/P309R；Xen-dNK/E318D；或Xen-dNK/E321S(dNK編號(hào))。
21.權(quán)利要求16的酶變體，其是來自黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)脫氧核糖核苷激酶，和/或家蠶(Bombyx mori)脫氧核糖核苷激酶，和/或滑爪蟾(Xenopus laevis)脫氧核糖核苷激酶，和/或?qū)葋啺次?Anopheles gambia)脫氧核糖核苷激酶的雜種酶。
22.權(quán)利要求21的酶變體，其來自黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)脫氧核糖核苷激酶和家蠶(Bombyx mori)脫氧核糖核苷激酶，并含有SEQ ID NO10所示的氨基酸序列。
23.權(quán)利要求21的酶變體，其來自黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)脫氧核糖核苷激酶和家蠶(Bombyx mori)脫氧核糖核苷激酶，并含有SEQ ID NO12所示的氨基酸序列。
24.含有權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的多核苷酸的載體構(gòu)建體。
25.權(quán)利要求24的載體，其為病毒載體，特別是單純皰疹病毒載體，腺病毒載體，腺病毒相關(guān)病毒載體，或者逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
26.能夠產(chǎn)生含有權(quán)利要求25的載體的感染性毒粒的包裝細(xì)胞系。
27.攜帶權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的突變多核苷酸，或者權(quán)利要求24-25任一項(xiàng)的載體的宿主細(xì)胞。
28.權(quán)利要求27的細(xì)胞，其為人細(xì)胞，狗細(xì)胞，猴細(xì)胞，大鼠細(xì)胞或小鼠細(xì)胞。
29.使細(xì)胞對前體藥物敏感的方法，該方法包括下述步驟(i)用編碼能夠促進(jìn)所述前體藥物轉(zhuǎn)化為(細(xì)胞毒性的)藥物的酶的權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的多核苷酸序列轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞；以及(ii)將所述前體藥物遞送到所述細(xì)胞；其中所述細(xì)胞對所述(細(xì)胞毒性的)藥物比對所述前體藥物更敏感。
30.權(quán)利要求29的方法，其中前體藥物是核苷類似物。
31.權(quán)利要求30的方法，其中核苷類似物為阿昔洛韋(9-[2-羥基-乙氧基]-甲基-鳥嘌呤核苷)，布昔洛韋，泛昔洛韋，更昔洛韋(9-[2-羥基-1-(羥甲基)乙氧基甲基]-鳥嘌呤核苷)，噴昔洛韋，伐昔洛韋，三氟胸苷，AZT(3’-疊氮-3’-胸苷)，AIU(5’-碘-5’-氨基-2’，5’-雙脫氧尿苷)，ara-A(腺苷-阿拉伯糖苷；Vivarabine)，ara-C(胞苷-阿拉伯糖苷)，ara-G(9-β-D-阿拉伯呋喃糖基鳥嘌呤)，ara-T，1-β-D-阿拉伯呋喃糖基胸腺嘧啶，5-乙基-2’-脫氧尿苷，5-碘-5’-氨基-2，5’-雙脫氧尿苷，1-[2-脫氧-2-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖基]-5-碘尿嘧啶，碘苷(5-碘-2’脫氧尿苷)，氟達(dá)拉濱(2-氟腺嘌呤9-β-D-阿拉伯呋喃糖苷)，吉西他濱(gencitabine)，2’，3’-雙脫氧次黃嘌呤核苷(ddI)，2’，3’-雙脫氧胞苷(ddC)，2’，3’-雙脫氧胸苷(ddT)，2’，3’-雙脫氧腺苷(ddA)，2’，3’-雙脫氧鳥苷(ddG)，2-氯-2’-脫氧腺苷(2CdA)，5-氟脫氧尿苷，BVaraU((E)-5-(2-溴乙烯基)-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基尿嘧啶)，BVDU(5-溴乙烯基-脫氧尿苷)，F(xiàn)IAU(1-(2-脫氧-2-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-碘尿嘧啶)，3TC(2’-脫氧-3’-硫雜胞苷)，dFdC吉西他濱(2’，2’-雙氟脫氧胞苷)，dFdG(2’，2’-雙氟脫氧鳥苷)或者d4T(2’，3’雙脫氫-3’-脫氧胸苷)。
32.抑制恒溫動(dòng)物中病原體的方法，該方法包括對所述動(dòng)物施用權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的突變多核苷酸，或者權(quán)利要求24-25任一項(xiàng)的載體。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述多核苷酸序列或所述載體體內(nèi)給藥。
34.權(quán)利要求32-33任一項(xiàng)的方法，其中所述病原體是病毒，細(xì)菌或寄生蟲。
35.權(quán)利要求32-33任一項(xiàng)的方法，其中所述病原體是腫瘤細(xì)胞。
36.權(quán)利要求32-33任一項(xiàng)的方法，其中所述病原體是自身反應(yīng)的免疫細(xì)胞。
37.權(quán)利要求31-35任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括對所述恒溫動(dòng)物施用核苷類似物的步驟。
38.權(quán)利要求37的方法，其中所述核苷類似物是阿昔洛韋(9-[2-羥基-乙氧基]-甲基-鳥嘌呤核苷)，布昔洛韋，泛昔洛韋，更昔洛韋(9-[2-羥基-1-(羥甲基)乙氧基甲基]-鳥嘌呤核苷)，噴昔洛韋，伐昔洛韋，三氟胸苷，AZT(3’-疊氮-3’-胸苷)，AIU(5’-碘-5’-氨基-2’，5’-雙脫氧尿苷)，ara-A(腺苷-阿拉伯糖苷；Vivarabine)，ara-C(胞苷-阿拉伯糖苷)，ara-G(9-β-D-阿拉伯呋喃糖基鳥嘌呤)，ara-T，1-β-D-阿拉伯呋喃糖基胸腺嘧啶，5-乙基-2’-脫氧尿苷，5-碘-5’-氨基-2，5’-雙脫氧尿苷，1-[2-脫氧-2-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖基]-5-碘尿嘧啶，碘苷(5-碘-2’脫氧尿苷)，氟達(dá)拉濱(2-氟腺嘌呤9-β-D-阿拉伯呋喃糖苷)，吉西他濱(gencitabine)，2’，3’-雙脫氧次黃嘌呤核苷(ddI)，2’，3’-雙脫氧胞苷(ddC)，2’，3’-雙脫氧胸苷(ddT)，2’，3’-雙脫氧腺苷(ddA)，2’，3’-雙脫氧鳥苷(ddG)，2-氯-2’-脫氧腺苷(2CdA)，5-氟脫氧尿苷，BVaraU((E)-5-(2-溴乙烯基)-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基尿嘧啶)，BVDU(5-溴乙烯基-脫氧尿苷)，F(xiàn)IAU(1-(2-脫氧-2-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-碘尿嘧啶)，3TC(2’-脫氧-3’-硫雜胞苷)，dFdC吉西他濱(2’，2’-雙氟脫氧胞苷)，dFdG(2’，2’-雙氟脫氧鳥苷)或者d4T(2’，3’雙脫氫-3’-脫氧胸苷)。
39.含有權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的突變多核苷酸，或權(quán)利要求24-25任一項(xiàng)的載體的藥物組合物。
40.含有權(quán)利要求4-23任一項(xiàng)的酶變體和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及新型多底物脫氧核糖核苷激酶變體。更具體地，本發(fā)明提供來自昆蟲或低等脊椎動(dòng)物特別是來自黑腹果蠅，家蠶，或滑爪蟾的新型脫氧核糖核苷激酶變體，編碼多底物核苷激酶變體的新型多核苷酸，含有該多核苷酸的載體構(gòu)建體，帶有該多核苷酸或載體的宿主細(xì)胞，使細(xì)胞對前體藥物敏感的方法，抑制恒溫動(dòng)物中病原體的方法，以及含有本發(fā)明脫氧核糖核苷激酶變體的藥物組合物。
文檔編號(hào)A61P33/00GK1429268SQ01809319
公開日2003年7月9日 申請日期2001年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2000年5月12日
發(fā)明者沃爾夫?qū)た咸? 比吉特·芒克－彼得森, 尤雷·皮斯克 申請人:沃爾夫?qū)た咸? 比吉特·芒克－彼得森, 尤雷·皮斯克