專利名稱：利用維生素k環(huán)氧化物還原酶基因單核苷酸多態(tài)性確定血管疾病易感性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用維生素K環(huán)氧化物還原酶(VKOR)基因的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)確定患者對(duì)血管疾病(如缺血性腦卒中、冠心病以及出血性腦卒中、動(dòng)脈夾層)的易感性的方法，用于該方法的物質(zhì)、組合物、試劑盒及其用途。
背景技術(shù)：
血管疾病如腦卒中和冠心病發(fā)病率非常之高，中國(guó)人群中每11秒就有一個(gè)因此而死亡。能夠找到這類疾病的早期預(yù)測(cè)標(biāo)記意義非常明顯。
已知維生素K環(huán)氧化物還原酶(VKOR)的主要功能是參與將維生素K環(huán)氧化物還原成維生素K醌形式的反應(yīng)。而維生素K醌繼續(xù)被維生素K還原酶還原成維生素K氫醌的形式，在凝血酶原前體轉(zhuǎn)化成凝血酶原的反應(yīng)中，維生素K氫醌轉(zhuǎn)化成維生素K環(huán)氧化物。
維生素K依賴的促凝血蛋白和抗凝血蛋白被認(rèn)為與動(dòng)脈硬化和血栓癥有關(guān)系[1-4]。血栓癥和動(dòng)脈硬化直接導(dǎo)致血管疾病如缺血性腦卒中、冠心病以及出血性腦卒中、動(dòng)脈夾層。近期研究發(fā)現(xiàn)VKOR的幾個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNPs)與華法令(warfarin)的劑量相關(guān)。
本發(fā)明通過大型病例對(duì)照研究來調(diào)查VKOR的基因單個(gè)核苷酸多態(tài)性與血管疾病(如腦中風(fēng)、冠心病和動(dòng)脈夾層)是否具有相關(guān)性，從而得到了利用維生素K環(huán)氧化物還原酶(VKOR)基因的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)確定患者對(duì)血管疾病(如缺血性腦卒中、冠心病以及出血性腦卒中、動(dòng)脈夾層)的易感性的方法，用于該方法的物質(zhì)、組合物、試劑盒及其用途。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)方面，涉及一種用于鑒別選自如下的維生素K環(huán)氧化物還原酶基因的多態(tài)性位點(diǎn)-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的工具。具體的，本發(fā)明所述工具是維生素K環(huán)氧化物還原酶基因的多態(tài)性位點(diǎn)-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A分型寡核苷酸，優(yōu)選地，所述多態(tài)性分型寡核苷酸是(1)等位基因特異性核酸引物，它能夠檢測(cè)選自如下的維生素K環(huán)氧化物還原酶基因-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多態(tài)性，或者(2)用于檢測(cè)維生素K環(huán)氧化酶基因多態(tài)性的寡核苷酸探針，其能特異地與具有選自-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的維生素K環(huán)氧化酶基因多態(tài)性位點(diǎn)的核酸雜交，優(yōu)選地，寡核苷酸探針的長(zhǎng)度為17-50個(gè)核苷酸。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述工具是限制性內(nèi)切酶。
本發(fā)明的另一方面涉及一種試劑盒，其包含至少一種上述工具，以及，任選的，用于檢測(cè)反應(yīng)的合適的緩沖體系和顯色體系。
本發(fā)明的再一方面還涉及診斷患者包括缺血性腦卒中、冠心病以及出血性腦卒中、動(dòng)脈夾層的血管疾病易感性的方法，所述方法包括檢測(cè)來自所述患者的樣品中選自如下的維生素K環(huán)氧化物還原酶基因-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多態(tài)性位點(diǎn)的存在。
本發(fā)明的又一方面涉及確定患者包括缺血性腦卒中、冠心病以及出血性腦卒中、動(dòng)脈夾層的血管疾病的易感性方法，所述方法包括檢測(cè)來自所述患者的樣品中選自如下的維生素K環(huán)氧化物還原酶基因-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多態(tài)性位點(diǎn)的存在。
本發(fā)明的另一方面涉及分析從患者分離的離體生物樣品的方法，包括確定所述樣品中選自如下的維生素K環(huán)氧化物還原酶基因-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多態(tài)性位點(diǎn)。
具體的，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，可使用包括選自以下的差異核酸分析技術(shù)的試驗(yàn)用質(zhì)譜對(duì)PCR產(chǎn)物直接質(zhì)量分析、對(duì)侵入性切割產(chǎn)物直接分析、直接序列分析、等位基因特異性擴(kuò)增、等位基因特異性雜交、寡核苷酸連接試驗(yàn)、侵入者試驗(yàn)、DNA芯片分析和限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性進(jìn)行上述多態(tài)性位點(diǎn)分析。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知曉，用于上述分析的樣品選自來自患者的外周血細(xì)胞、白細(xì)胞、血清、尿樣、唾液、體液和/或(活檢)組織樣本，任選的，所述樣品可以預(yù)先進(jìn)行純化，例如分離總DNA。
本發(fā)明還涉及一種微陣列，其中包含選自如下的維生素K環(huán)氧化物還原酶基因-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多態(tài)性位點(diǎn)的分型寡核苷酸。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述微陣列是DNA芯片的形式。
本發(fā)明再一方面還涉及檢測(cè)生物學(xué)樣品中選自如下的維生素K環(huán)氧化物還原酶基因-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多態(tài)性位點(diǎn)的存在的物質(zhì)在制備診斷試劑的用途，所述診斷試劑用于診斷患者包括缺血性腦卒中、冠心病以及出血性腦卒中、動(dòng)脈夾層的血管疾病易感性。
具體的，用于上述用途的物質(zhì)選自本發(fā)明前述的工具；能夠特異識(shí)別選自如下的維生素K環(huán)氧化物還原酶基因-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多態(tài)性位點(diǎn)的突變的抗體；和能夠特異識(shí)別選自如下的維生素K環(huán)氧化物還原酶基因-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多態(tài)性位點(diǎn)的引物或者探針或者限制性內(nèi)切酶。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明利用維生素K環(huán)氧化物還原酶基因作為包括缺血性腦卒中、冠心病以及出血性腦卒中、動(dòng)脈夾層的血管疾病易感候選基因的病例的對(duì)照研究，對(duì)該基因選自-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多態(tài)性位點(diǎn)與包括缺血性腦卒中、冠心病以及出血性腦卒中、動(dòng)脈夾層的血管疾病的關(guān)系進(jìn)行了關(guān)聯(lián)研究，根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果得出了所述多態(tài)性位點(diǎn)等位基因與上述血管疾病的相關(guān)性。
“對(duì)應(yīng)”是指本發(fā)明核酸分子或者蛋白質(zhì)的序列在與參考序列的cDNA序列所示序列最佳比對(duì)(alignment)后與該參考序列某位置相對(duì)的位置。因此，本發(fā)明核酸分子或者蛋白質(zhì)“對(duì)應(yīng)位置”或者“對(duì)應(yīng)核苷酸”或者“對(duì)應(yīng)氨基酸”不一定是與參考序列編號(hào)相同的位置、或者核苷酸或者氨基酸。
維生素K環(huán)氧化物還原酶基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)是指位于啟動(dòng)子區(qū)第-1639位多態(tài)性A和G(rs9923231)、位于第一個(gè)內(nèi)含子區(qū)+1173位多態(tài)性T和C(rs9934438)，位于第二個(gè)內(nèi)含子區(qū)+1542位多態(tài)性C和G(rs8050894)以及+2255位T和C(rs2359612)、位于5’非翻譯區(qū)的+3730位G和A(rs7294)。
單核苷酸多態(tài)性及其檢測(cè)術(shù)語“患者”是指動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選靈長(zhǎng)類動(dòng)物，最優(yōu)選人類。
術(shù)語“多態(tài)性”廣義上限定為包括已知發(fā)生在核苷酸序列中的所有變異，包括插入，缺失，置換和重復(fù)序列(包括二重重復(fù))。
人類基因組中的序列變異主要由單核苷酸多態(tài)性(″SNP″)組成，其余序列變異是短串聯(lián)重復(fù)(包括微衛(wèi)星)、長(zhǎng)串聯(lián)重復(fù)(小衛(wèi)星)和其它插入和缺失。SNP是群體中以可測(cè)頻率(即＞1％)出現(xiàn)兩個(gè)可替換堿基的位置。SNP被稱為是″等位的″，因?yàn)橛捎诖硕鄳B(tài)性的存在，一個(gè)物種的一些成員可能具有未突變序列(即，原始“等位基因”)，而其它成員可能具有突變序列(即變體或突變等位基因)。在最簡(jiǎn)單的情況下，可能僅存在一個(gè)突變序列，該多態(tài)性被稱為二對(duì)等位基因多態(tài)性?？商鎿Q突變的發(fā)生可產(chǎn)生三對(duì)等位基因多態(tài)性等。SNP廣泛存在于基因組中，改變基因功能的SNP可能直接有助于表型變異。由于它們的流行和普遍本質(zhì)，SNP有潛力成為定位參與人類疾病情況的基因的重要工具，見如Wang等，Science 2801077-1082(1998)，它公開了一個(gè)探索性研究，其中2,227個(gè)SNP被作圖定位于一個(gè)2.3兆堿基的DNA區(qū)域內(nèi)。
單核苷酸多態(tài)性和特定表型之間的關(guān)系不表示或需要SNP是該表型的原因。相反，這種關(guān)系可能僅表示SNP位于表型決定因子在基因組上的存在位置的附近，由此更可能被發(fā)現(xiàn)與這些決定因子關(guān)聯(lián)和由此與感興趣的表型關(guān)聯(lián)。因此，SNP可能與“真正”的功能變異存在連鎖不平衡(LD)。當(dāng)基因組兩個(gè)不同位置上的等位基因的相關(guān)性比期望的相關(guān)性更高時(shí)存在LD，又稱作等位基因相關(guān)(allelic association)。因此，SNP可以用作標(biāo)記，由于其接近引起特定表型的突變而具有價(jià)值。
根據(jù)本發(fā)明的上述方法可通過使用用于檢測(cè)單核苷酸變異的任何合適方法而得以施用，比如用質(zhì)譜對(duì)PCR產(chǎn)物的直接質(zhì)量分析，對(duì)侵入性切割產(chǎn)物(invasive cleavage product)的直接分析，直接的序列分析，等位基因特異性擴(kuò)增(即，ARMSTM-等位基因特異性擴(kuò)增，ARMS指擴(kuò)增受阻突變體系(amplification refractory mutationsystem))，ALEXTM(擴(kuò)增受阻突變系統(tǒng)線性延伸(amplificationrefractory mutation system linear extension)和COPS(競(jìng)爭(zhēng)性寡核苷酸引發(fā)系統(tǒng))，等位基因特異性雜交(ASH)，寡核苷酸連接試驗(yàn)(OLA)，侵入者試驗(yàn)，DNA芯片分析和限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)(綜述參見基因組研究(Genome Research)，1998年，8卷，769-776頁(yè)；Pharmacogenomics，2000年，1卷，95-100頁(yè)；人類突變(Human Mutation)，2001年，17卷，475-492頁(yè))。
攜有所述多態(tài)性核酸的獲自患者的樣品可以方便地是從個(gè)體中獲得的，包括但不限于血清、尿樣、唾液、體液、(活檢)組織樣本等。這些樣品可以預(yù)先進(jìn)行純化，例如分離總DNA?？梢悦髁耍瑯悠吠瑯涌梢允菍?duì)應(yīng)于試樣中序列的核酸序列，也就是說，在等位基因變異分析前，核酸樣品中的全部或一部分區(qū)域可先用任何一種方便的技術(shù)如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或連接酶鏈反應(yīng)(LCR)擴(kuò)增。
顯然，對(duì)于對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說有大量的分析方法可被用于檢測(cè)在本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)多態(tài)位置處變異核苷酸存在與否。一般來說，等位基因變異的檢測(cè)需要突變辨別技術(shù)，任選地?cái)U(kuò)增反應(yīng)和任選地信號(hào)生成系統(tǒng)。國(guó)際專利申請(qǐng)WO00/06768列出了許多擴(kuò)增技術(shù)和突變檢測(cè)技術(shù)，其中一些是基于PCR技術(shù)的。這些技術(shù)可和許多信號(hào)生成系統(tǒng)聯(lián)合使用，可選的信號(hào)生成系統(tǒng)也被列于WO00/06768。
用于檢測(cè)等位基因變異的許多現(xiàn)行方法綜述于Nollau等，臨床化學(xué)(Clin.Chem.)，1997年，43期，1114-1120頁(yè)；在標(biāo)準(zhǔn)教科書例如“突變檢測(cè)實(shí)驗(yàn)指南”(Laboratory Protocols for MutationDetection)U.Landegren編輯，牛津大學(xué)出版社，1996年和“PCR”第二版Newton &Graham編輯，BIOS Scientific Publishers Limited，1997年。
本發(fā)明涉及可被用做檢測(cè)維生素K環(huán)氧化物還原酶基因中多態(tài)性的診斷引物的等位基因特異性核酸引物，該診斷引物能夠與在序列內(nèi)于-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多態(tài)性位點(diǎn)包含多態(tài)性(例如維生素K環(huán)氧化物還原酶基因位點(diǎn)2255T/G或者其反向互補(bǔ)序列)的核酸雜交。
等位基因特異性引物通常與恒定引物一起用于諸如PCR反應(yīng)等擴(kuò)增反應(yīng)中，通過對(duì)位于一個(gè)特定序列位置處的一個(gè)等位基因的選擇性擴(kuò)增而使等位基因之間得以區(qū)分開來，例如用在ARMSTM試驗(yàn)中的引物。等位基因特異性引物的長(zhǎng)度優(yōu)選17-50個(gè)核苷酸，更優(yōu)選大約17-35個(gè)核苷酸，最優(yōu)選大約17-30個(gè)核苷酸。
優(yōu)選地，等位基因特異性引物與待檢測(cè)的等位基因完全地相對(duì)應(yīng)，但是也可以考慮其衍生物，其中3’端大約有6到8個(gè)核苷酸與待檢測(cè)的等位基因?qū)?yīng)而不超過10個(gè)，比如不超過8，6，4，2或者1個(gè)剩余核苷酸在不顯著影響引物特性的情況下可以發(fā)生變化。常常在第2和/或第3位(相對(duì)于3’端)的核苷酸被錯(cuò)配以優(yōu)化差異引物結(jié)合和優(yōu)先僅從正確的等位基因辨別引物延伸。
本發(fā)明還涉及用于檢測(cè)維生素K環(huán)氧化物還原酶基因中多態(tài)性的的寡核苷酸探針，該探針能夠與在序列內(nèi)于-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多態(tài)性位點(diǎn)包含多態(tài)性(例如維生素K環(huán)氧化物還原酶基因位點(diǎn)2255T/G或者其反向互補(bǔ)序列)的核酸雜交。
術(shù)語“寡核苷酸探針”指長(zhǎng)度至少有17個(gè)核苷酸的一種核苷酸序列，此序列與部分或全部的人類促血管生成素-1基因，特別是表達(dá)多態(tài)性的人類促血管生成素-l基因部分對(duì)應(yīng)。優(yōu)選長(zhǎng)度17到50個(gè)核苷酸。一般來說這樣的探針包含與基因中相應(yīng)的野生型或變體座位完全互補(bǔ)的堿基序列。
然而，如果需要，可以引入一個(gè)或多個(gè)錯(cuò)配，前提是寡核苷酸探針的辨別能力不被過度影響。本發(fā)明的探針可以攜有一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記以便于檢測(cè)，比如在Moleaular Beacons中。
本發(fā)明還涉及一種用于檢測(cè)維生素K環(huán)氧化物還原酶基因中選自-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多態(tài)性位點(diǎn)的試劑盒，其包含至少一種維生素K環(huán)氧化物還原酶基因選自-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多態(tài)性分型寡核苷酸，或是限制性內(nèi)切酶。本發(fā)明中所述多態(tài)性分型寡核苷酸是(1)等位基因特異性核酸引物，它能夠檢測(cè)維生素K環(huán)氧化物還原酶基因中選自-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多態(tài)性位點(diǎn)的多態(tài)性，或者(2)用于檢測(cè)維生素K環(huán)氧化物還原酶基因中選自-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多態(tài)性位點(diǎn)多態(tài)性的寡核苷酸探針，其能特異地與具有維生素K環(huán)氧化物還原酶基因中選自-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多態(tài)性位點(diǎn)的核酸雜交，優(yōu)選地，寡核苷酸探針的長(zhǎng)度為17-50個(gè)核苷酸。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒中任選的含有適于所述檢測(cè)反應(yīng)的緩沖體系和顯色體系。
在一些實(shí)施方案中，一種組合物含有用于同時(shí)探測(cè)兩個(gè)或更多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的寡核苷酸身份的兩個(gè)或更多個(gè)不同標(biāo)記的基因分型寡核苷酸。也可考慮含有兩套或更多套等位基因特異性引物對(duì)以允許同時(shí)靶向和擴(kuò)增含多態(tài)性位點(diǎn)的兩個(gè)或更多個(gè)區(qū)域的引物組合物。
本發(fā)明的維生素K環(huán)氧化物還原酶基因多態(tài)性位點(diǎn)分型寡核苷酸也可以固定在固體表面或在固體表面合成，如芯片、珠或玻片(如見WO 98/20020和WO 98/20019)。這種固定的基因分型寡核苷酸可以用于各種多態(tài)性檢測(cè)試驗(yàn)，包括但不限于探針雜交和聚合酶延伸試驗(yàn)。本發(fā)明的固定的維生素K環(huán)氧化物還原酶基因分型寡核苷酸可以包括為同時(shí)快速篩選DNA樣品在多個(gè)基因中的多態(tài)性而設(shè)計(jì)的有序寡核苷酸陣列。
本發(fā)明等位基因特異性寡核苷酸引物優(yōu)選具有與特定SNP的僅一種核苷酸互補(bǔ)的3’末端核苷酸，或優(yōu)選地3’倒數(shù)第二個(gè)核苷酸，由此只有存在含該核苷酸的等位基因時(shí)其才可以用作聚合酶介導(dǎo)的延伸反應(yīng)的引物。與編碼鏈或非編碼鏈雜交的等位基因特異性寡核苷酸引物包括在本發(fā)明中。
本發(fā)明其它基因分型寡核苷酸與位于這里所述的多態(tài)性位點(diǎn)之一下游一個(gè)至幾個(gè)核苷酸處的靶區(qū)域雜交。這種寡核苷酸可用于聚合酶介導(dǎo)的引物延伸方法中以檢測(cè)這里所描述的多態(tài)性之一，因此這種基因分型寡核苷酸這里稱作“引物延伸寡核苷酸”。在優(yōu)選實(shí)施方案中，引物延伸寡核苷酸的3’末端是與多態(tài)性位點(diǎn)緊臨的核苷酸互補(bǔ)的脫氧核苷酸。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包括包裝在分開容器中的至少兩個(gè)基因分型寡核苷酸的試劑盒。該試劑盒也可以含有包裝在分開容器中的其它成分如雜交緩沖液(此時(shí)寡核苷酸待用作探針)?？晒┻x擇地，當(dāng)寡核苷酸待用于擴(kuò)增靶區(qū)域時(shí)，該試劑盒可以含有包裝在分開容器中的聚合酶和用于聚合酶介導(dǎo)的引物延伸如PCR的經(jīng)優(yōu)化反應(yīng)緩沖液。
本發(fā)明還涉及一種診斷患者包括缺血性腦卒中、冠心病以及出血性腦卒中、動(dòng)脈夾層的血管疾病的易感性的體外方法，所述方法包括檢測(cè)來自所述患者的樣品中維生素K環(huán)氧化物還原酶基因中選自-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多態(tài)性位點(diǎn)的存在。
本發(fā)明還涉及一種確定患者包括缺血性腦卒中、冠心病以及出血性腦卒中、動(dòng)脈夾層的血管疾病的易感性的體外方法，所述方法包括檢測(cè)來自所述患者的樣品中維生素K環(huán)氧化物還原酶基因中選自-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多態(tài)性位點(diǎn)的存在。
本發(fā)明還涉及一種分析從患者分離的離體生物樣品的方法，包括確定所述樣品中維生素K環(huán)氧化物還原酶基因中選自-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多態(tài)性位點(diǎn)的核苷酸。在本發(fā)明所述方法中，使用包括選自以下的差異核酸分析技術(shù)的試驗(yàn)用質(zhì)譜對(duì)PCR產(chǎn)物直接質(zhì)量分析、對(duì)侵入性切割產(chǎn)物直接分析、直接序列分析、等位基因特異性擴(kuò)增、等位基因特異性雜交、寡核苷酸連接試驗(yàn)、侵入者試驗(yàn)、DNA芯片分析和限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性。
在本發(fā)明所述方法中，其中所述來自患者的樣品選自血清、尿樣、唾液、體液和/或(活檢)組織樣本，任選的，所述樣品可以預(yù)先進(jìn)行純化，例如分離總DNA。
本發(fā)明還涉及一種用于檢測(cè)維生素K環(huán)氧化物還原酶基因中選自-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多態(tài)性位點(diǎn)的微陣列，其中包含前述定義的維生素K環(huán)氧化物還原酶基因中選自-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多態(tài)性位點(diǎn)的分型寡核苷酸。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述微陣列是DNA芯片的形式。
本發(fā)明還涉及檢測(cè)生物學(xué)樣品中維生素K環(huán)氧化物還原酶基因中選自-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的的多態(tài)性位點(diǎn)的存在的物質(zhì)在制備診斷試劑的用途，所述診斷試劑用于診斷患者缺血性腦卒中(特別是包括腦血栓形成、腔隙性腦梗塞)的易感性。在本發(fā)明中，所述物質(zhì)選自用于檢測(cè)維生素K環(huán)氧化物還原酶基因中選自-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多態(tài)性位點(diǎn)的工具，例如，維生素K環(huán)氧化物還原酶基因中多態(tài)性位點(diǎn)+2255T/C多態(tài)性分型寡核苷酸，優(yōu)選地，所述多態(tài)性分型寡核苷酸是(1)等位基因特異性核酸引物，它能夠檢測(cè)維生素K環(huán)氧化物還原酶基因中選自-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的的多態(tài)性位點(diǎn)的多態(tài)性，或者(2)用于檢測(cè)維生素K環(huán)氧化物還原酶基因中選自-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多態(tài)性位點(diǎn)的寡核苷酸探針，其能特異地與具有維生素K環(huán)氧化物還原酶基因中選自-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的的多態(tài)性位點(diǎn)的核酸雜交，優(yōu)選地，寡核苷酸探針的長(zhǎng)度為17-50個(gè)核苷酸；能夠特異識(shí)別維生素K環(huán)氧化物還原酶基因中選自-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的的多態(tài)性位點(diǎn)的突變的抗體；和能夠特異識(shí)別維生素K環(huán)氧化物還原酶基因中選自-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的的多態(tài)性位點(diǎn)的引物或者探針或者限制性內(nèi)切酶。
以下實(shí)施例用于對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步舉例說明，而不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例首先我們通過測(cè)序分析VKOR的2Kb的3’非翻譯區(qū)、整個(gè)編碼區(qū)，內(nèi)含子，以及2Kb的5’非翻譯區(qū)的單個(gè)核苷酸的多態(tài)性。在50個(gè)中風(fēng)病人和50個(gè)正常人中的測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)頻率在5％以上的SNPs有5個(gè)，分別是-1639A/G(rs9923231)位于啟動(dòng)子區(qū)，+1173T/C(rs9934438)位于第一個(gè)內(nèi)含子區(qū)，+1542C/G(rs8050894)和+2255T/C(rs2359612)位于第二個(gè)內(nèi)含子區(qū)，+3730G/A(rs7294)位于5非翻譯區(qū)。并且通過連鎖不平衡分析，我們發(fā)現(xiàn)這5個(gè)SNPs存在嚴(yán)重的連鎖不平衡(D’＞0.9，r2＞0.9)，這樣也就是說其中任何一個(gè)SNP都能夠反應(yīng)整個(gè)這個(gè)區(qū)域的單倍型。
于是我們挑選了2255這個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行大規(guī)模臨床分析。病例為1811個(gè)腦中風(fēng)病人，740個(gè)冠心病病人，253動(dòng)脈夾層病人，其中腦中風(fēng)病人分為3個(gè)亞型-798個(gè)腦缺血，514個(gè)腔梗，499個(gè)腦出血；2968個(gè)對(duì)照(1811個(gè)匹配腦中風(fēng)，740個(gè)匹配冠心病，417個(gè)與動(dòng)脈夾層對(duì)照)。全部通過醫(yī)學(xué)檢查確認(rèn)(腦卒中通過CT，MRI檢查；冠心病至少1支70％狹窄；動(dòng)脈夾層通過UFCT和超聲檢查，排除動(dòng)脈炎、外部損傷等病人)。
所有受試者均取空腹12小時(shí)靜脈血，EDTA抗凝，離心分離血細(xì)胞，采用低滲緩沖液溶血法從白細(xì)胞中提取基因組DNA，PCR擴(kuò)增相應(yīng)的+2255T/C的目的片斷。+2255T/C位點(diǎn)基因分型上游引物5’-TCTGAACCATGTGTCAGCCAGGACC-3’和下游引物5’-GAACAGAGAGAGGAACCAAGGGAGTGGA-3’PCR產(chǎn)生一個(gè)198bp的片斷。NcoI(New England Biolabs)酶37℃孵育一個(gè)小時(shí)，A等位基因型產(chǎn)生出2個(gè)DNA片斷，分別是172和26bp，用4％瓊脂糖凝膠電泳分離。G等位基因型不能夠切開。測(cè)序驗(yàn)證PCR產(chǎn)物(ABI prism 377，Perkin Elmer)以確認(rèn)分型結(jié)果。Spss10.0軟件包統(tǒng)計(jì)結(jié)果，組間差異采用卡方檢驗(yàn)或不配對(duì)t檢驗(yàn)。OR值和95％的置信區(qū)間采用多元logistic回歸分析校正，最后通過年齡、性別、體重指數(shù)、收縮血壓、舒張血壓、吸煙、飲酒、血糖、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、總膽固醇、甘油三脂校正得到校正OR值。采用雙側(cè)檢驗(yàn)P＜0.05認(rèn)為差異顯著。CC+CT基因型在+2255位點(diǎn)病人組出現(xiàn)頻率明顯高于對(duì)照組。腦中風(fēng)-19.7％vs 11.7％，OR＝1.95(1.58-2.41)，P＜0.001；冠心病-16.9％vs 11.2％，OR＝1.72(1.24-2.38)，P＜0.01；動(dòng)脈夾層-17.0％vs 10.1％，OR＝1.90(1.04-3.48)，P＜0.05。在缺血型腦卒中中更為顯著。+2255位點(diǎn)CC+CT基因型頻率病人組高于對(duì)照組1.95倍(95％CI，OR＝2.33(1.76-3.06)；P＜0.001)。這里所有的OR值經(jīng)過性別、年齡、體重指數(shù)、血壓、吸煙、飲酒、血糖、高密脂蛋白、低密脂蛋白、總膽固醇、甘油三脂多元回歸調(diào)整。為了進(jìn)一步確認(rèn)這種相關(guān)性，我們檢測(cè)了2255位點(diǎn)基因型和血清中維生素K依賴性蛋白PIVKA-II和undercarboxylated-osteocalcin的濃度是否具有相關(guān)性。這兩種蛋白都是非羧基化的蛋白。當(dāng)維生素K的γ羧化作用增強(qiáng)時(shí)，這兩種蛋白的含量降低，反之升高。我們選擇了49個(gè)正常樣本，2255位點(diǎn)基因型TT的26個(gè)，TC的18個(gè)，CC的5個(gè)。Spearman相關(guān)系數(shù)分別時(shí)rs＝-0.219(P＝0.021，undercarboxylated-osteocalcin)和-0.567(P＜0.001，PIVKA-II)。The comparison TT和CC攜帶者的血清中抗原水平是明顯的(P＝0.021在undercarboxylated-osteocalcin中和P＜0.001在PIVKA-II中).這個(gè)結(jié)果表明C等位基因?qū)е乱粋€(gè)高的VKOR活性。
由以上結(jié)果可見，VKOR的單倍域G-C-G-C-A(-1639～+1173～+1542～+2255～+3730)導(dǎo)致較高的血管疾病如中風(fēng)、冠心病和動(dòng)脈夾層的風(fēng)險(xiǎn)。也就是VKOR的SNPs與中風(fēng)、冠心病、動(dòng)脈夾層存在相關(guān)性，并且獨(dú)立于其他傳統(tǒng)的這些血管疾病的危險(xiǎn)因素。因此VKOR的SNPs可作為新的預(yù)示心血管事件的基因標(biāo)記。
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權(quán)利要求
1.用于鑒別選自如下的維生素K環(huán)氧化物還原酶基因的多態(tài)性位點(diǎn)-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的工具。
2.權(quán)利要求1的工具，它是維生素K環(huán)氧化物還原酶基因的多態(tài)性位點(diǎn)-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A分型寡核苷酸，優(yōu)選地，所述多態(tài)性分型寡核苷酸是(1)等位基因特異性核酸引物，它能夠檢測(cè)選自如下的維生素K環(huán)氧化物還原酶基因-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多態(tài)性，或者(2)用于檢測(cè)維生素K環(huán)氧化酶基因多態(tài)性的寡核苷酸探針，其能特異地與具有選自-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的維生素K環(huán)氧化酶基因多態(tài)性位點(diǎn)的核酸雜交，優(yōu)選地，寡核苷酸探針的長(zhǎng)度為17-50個(gè)核苷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的工具，其是限制性內(nèi)切酶。
4.一種試劑盒，其包含至少一種權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的工具，以及，任選的，用于檢測(cè)反應(yīng)的合適的緩沖體系和顯色體系。
5.診斷患者包括缺血性腦卒中、冠心病以及出血性腦卒中、動(dòng)脈夾層的血管疾病易感性的方法，所述方法包括檢測(cè)來自所述患者的樣品中選自如下的維生素K環(huán)氧化物還原酶基因-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多態(tài)性位點(diǎn)的存在。
6.確定患者包括缺血性腦卒中、冠心病以及出血性腦卒中、動(dòng)脈夾層的血管疾病的易感性方法，所述方法包括檢測(cè)來自所述患者的樣品中選自如下的維生素K環(huán)氧化物還原酶基因-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多態(tài)性位點(diǎn)的存在。
7.分析從患者分離的離體生物樣品的方法，包括確定所述樣品中選自如下的維生素K環(huán)氧化物還原酶基因-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多態(tài)性位點(diǎn)。
8.權(quán)利要求5-7中任一項(xiàng)的方法，其中使用包括選自以下的差異核酸分析技術(shù)的試驗(yàn)用質(zhì)譜對(duì)PCR產(chǎn)物直接質(zhì)量分析、對(duì)侵入性切割產(chǎn)物直接分析、直接序列分析、等位基因特異性擴(kuò)增、等位基因特異性雜交、寡核苷酸連接試驗(yàn)、侵入者試驗(yàn)、DNA芯片分析和限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性。
9.權(quán)利要求5-7中任一項(xiàng)的方法，其中所述來自患者的樣品選自外周血細(xì)胞、白細(xì)胞、血清、尿樣、唾液、體液和/或(活檢)組織樣本，任選的，所述樣品可以預(yù)先進(jìn)行純化，例如分離總DNA。
10.一種微陣列，其中包含權(quán)利要求2所定義的選自如下的維生素K環(huán)氧化物還原酶基因-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多態(tài)性位點(diǎn)的分型寡核苷酸。
11.權(quán)利要求10的微陣列，它是DNA芯片的形式。
12.檢測(cè)生物學(xué)樣品中選自如下的維生素K環(huán)氧化物還原酶基因-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多態(tài)性位點(diǎn)的存在的物質(zhì)在制備診斷試劑的用途，所述診斷試劑用于診斷患者包括缺血性腦卒中、冠心病以及出血性腦卒中、動(dòng)脈夾層的血管疾病易感性。
13.權(quán)利要求12的用途，其中所述物質(zhì)選自權(quán)利要求1-3的工具；能夠特異識(shí)別選自如下的維生素K環(huán)氧化物還原酶基因-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多態(tài)性位點(diǎn)的突變的抗體；和能夠特異識(shí)別選自如下的維生素K環(huán)氧化物還原酶基因-1639A/G、+1173T/C、+1542C/G、+2255T/C、和+3730G/A的多態(tài)性位點(diǎn)的引物或者探針或者限制性內(nèi)切酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用維生素K環(huán)氧化物還原酶(VKOR)基因的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)確定患者對(duì)血管疾病(如缺血性腦卒中、冠心病以及出血性腦卒中、動(dòng)脈夾層)的易感性的方法，用于該方法的物質(zhì)、組合物、試劑盒及其用途。
文檔編號(hào)G01N33/50GK1952173SQ20051010937
公開日2007年4月25日 申請(qǐng)日期2005年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月17日
發(fā)明者惠汝太, 汪一波, 鄭翼, 楊濤, 楊旭, 張禪那, 陳敬洲 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外心血管病醫(yī)院