綿羊FecB基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因引物設(shè)計及載體構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002] FecB基因是在Booroola Merino羊中發(fā)現(xiàn)的與高繁殖率相關(guān)的主效基因， FecB基因位于綿羊6號常染色體，對綿羊的排卵率及產(chǎn)羔數(shù)有很大影響，（[l]Souza C J，MacDougall C，Campbell B K，et al. The Booroola (FecB)phenotype is associated with a mutation in the bone morphogenetic receptor type IB(BMPR1B)gene [J]. Journal of Endocrinology，2001， 169(2):R1-R6。 [2]MCNATTY K P，SMITH P，HUDS0N N L， et al. 0 ff-S and Braw Tal R. Development of the sheep ovary during fetal and early neonatal life and the effect of fecundity genes[J]. Journal of Reproduction and Fertility Supplement，1995,49:123-135)。該基因?qū)嶋H為骨形態(tài)發(fā)生蛋白IB型受體基 因（BMPR-IB，即 bone morphogenetic protein receptor IB)，在澳大利亞多胎綿羊品 種Booroola羊中BMPR-IB基因編碼序列中有1個A746G點突變，（[3]Davis G H，McEwan J C,Fennessy P F，et al. Evidence for the presence of a major gene influencing ovulation rate on the X chromosome of sheep[J]. Biol Reprod. 1991，44(4):620 ; [4]Mulsant P，Lecerf F，F(xiàn)abre S，et al. Mutation in bone morphogenetic protein receptor-IB is associated with increased ovulation rate in Booroola Merino ewes[J].Proc Natl Acad Sci USA. 2001，98(9):5104)，致使綿羊產(chǎn)羔數(shù)增加（[5] MONTGOMERY G W，LORD E A，PENTY J M，et al. The Booroola fecundity(FecB)gene maps to she印 chromosome6[J]. Genomics，1994,22:148-153. [6]LORD E A，DAVIS G H，DODDS K G?et al. Identification of Booroola carries using microsatellite markers[J]. Wool Technology and Sheep Breeding，1998,46:245-249) D 1989 年，該基因被綿、山羊遺傳命 名委員會正式定名為 FecB(即 Fecundity B = Booroola)基因（[7]Dolling C H S，Piper L, Ruvinsky A. Standardized genetic nomenclature for sheep [J]. The genetics of she印.1997:593-601. h柳淑芳等（[8]柳淑芳，姜運良，杜立新.BMPR-IB和BMP15基因作 為小尾寒羊多胎性能候選基因的研究[<1].遺傳學(xué)報，2003,30(8) :755-760)〇以81?1?-18 基因作為多胎性能候選基因?qū)π∥埠虻难芯孔C明，BMPR-IB基因的BB基因型在多胎品種 小尾寒羊群體內(nèi)為優(yōu)勢基因型，推測其可能是控制小尾寒羊多胎性能的主效基因或與之存 在緊密的遺傳連鎖。
[0003] 產(chǎn)羔數(shù)是衡量綿羊繁殖力的主要指標(biāo)，由于綿羊產(chǎn)羔性狀遺傳力很低（0.03~ 0.1) ([9]胡錦平，白蓮清，張泉福，等.湖羊繁殖與羔皮性狀遺傳參數(shù)和表型 參數(shù)的研究.浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1992, 18(1) : 39-43) ;[10]Davis G H，Morris C A，Dodds K G.Genetic studies of prolificacy in New Zealand sheep[J]. Animal Science，1998,67:289-297 ; [11]Fogarty N M. Genetic parameters for live weight, fat and muscle measurements, wool production and reproduction in sheep:a review[J]. Animal Breeding Abstracts, 1995, 63(3):101-143. ； [12]Casellas J,Caja G, Ferret A, Piedrafita J. Analysis of litter size and days to lambing in the Ripollesa ewe.II. Estimation of variance components and response to phenotypic selection on litter size[J]. Journal of Animal Science, 2007, 85:625-631)通過表觀選擇難以 提高產(chǎn)羔性狀，影響綿羊多胎性狀的因素很多，如：年齡，基因，季節(jié)變化以及綿羊的營養(yǎng) 狀況，而基因是影響綿羊多胎性狀的最主要的一個因素。FecB基因已被證明是冰島羊，爪 洼羊，劍橋羊，美利奴羊肉用、毛用多胎品系（[13]王啟貴，鐘發(fā)剛，李輝等.綿羊BMPR-IB 基因多態(tài)性與其產(chǎn)羔數(shù)的相關(guān)研究[J].草食家畜，2003,（2) :20-23)，小尾寒羊（[14]王 根林，毛鑫智，Davis G H.等.DNA分析發(fā)現(xiàn)我國湖羊和小尾寒Booroola(FecB)多胎基因 [J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2003, 26⑴；104-106)，以及多浪羊（[15]陳曉軍，鐘發(fā)剛，羅淑 萍，等.多浪羊BMPR-IB基因多態(tài)性的初步研究[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004,41(1):6-9.) 等綿羊品種中發(fā)現(xiàn)對其繁殖力有很大效應(yīng)的主基因。目前檢測綿羊FecB基因的方法主要 有PCR-RFLP和PCR-SSCP技術(shù)[16]儲明星，狄冉，葉素成，等.綿羊多胎主效基因FecB分 子檢測方法的建立與應(yīng)用[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2009,17(1) :52-58.)，兩種方法均耗時 費力，成本較高。本研究通過克隆小尾寒羊FecB基因并構(gòu)建原核表達(dá)載體，表達(dá)純化重組 FecB基因蛋白，通過多克隆抗體制備出FecB基因的抗體，為綿羊FecB基因ELISA檢測方法 的建立提供基礎(chǔ)，也為綿羊多胎品種的選育提供思路。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于避免現(xiàn)有技術(shù)的不足之處而提供一種綿羊FecB基因原核表達(dá) 載體的構(gòu)建方法。
[0005] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：一種綿羊FecB基因原核表達(dá)載體的 構(gòu)建方法，其特征在于通過反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增FecB基因片段，反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增方法為：94°C預(yù) 變性41^11 ;941€4〇8,591€4〇8,72°(：11111115〇8,35個循環(huán)，72°(：1〇111111，4°(：保存 ；1%的瓊脂 糖檢測。
[0006] 所述的綿羊FecB基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建方法，還包括有：
[0007] 上游引物 BamHIF ：5, -GGATCCAACATGCTTTTGCGAAGTTC-3?,
[0008] 下游引物 EcoRIR:5' -GGAATTCCAGAGCTTAATGTCCTGGGACT-3'，
[0009] PCR擴(kuò)增片段為：1509bp，上游引物是BamHI和下游引物是EcoRI，下方劃線為 引物上添加的酶切位點。
[0010] 所述的綿羊FecB基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建方法，將雙酶切的FecB基因PCR擴(kuò)增 片段和經(jīng)雙酶切的pET30a載體質(zhì)粒T4連接酶作用下連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌菌株；
[0011] 雙酶切體系如下：BamHI0? 5 y L，EcoRI0? 5 y L，10XK Buffer 2 y L，質(zhì)粒載 體DNA 7 y L，加去離子水至20 y L ;37°C酶切4h ;2 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物， 切膠回收空載體和目的基因片段；用T4連接酶切后目的基因片段和空載體；連接體系： T4DNA連接酶lyL，雙酶切后的表達(dá)質(zhì)粒載體1.5yL，雙酶切后目的基因片段10yL， Buffer 2. 5 y L，加無菌水至20 y L ;16°C過夜連接；將連接產(chǎn)物加入100 y L感受態(tài)大腸桿 菌BL21 (DE3)中，挑取白色斑點，于含卡納的液體培養(yǎng)基中搖床6h，菌液PCR檢測陽性克隆， 提取重組質(zhì)粒，雙酶切鑒定，陽性克隆送上海生工測序。
[0012] 所述的綿羊FecB基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建方法，綿羊FecB基因編碼區(qū)（⑶S)核 酸序列為：
[0013]
[0014]

[0015] 本發(fā)明的有益效果：
[0016] 本發(fā)明構(gòu)建了 FecB基因的原核表達(dá)載體，該重組載體轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌 BL21(DE3)體內(nèi)后經(jīng)過誘導(dǎo)可體外表達(dá)出FecB蛋白，免除了從組織中提取蛋白的繁瑣步 驟。為研究該蛋白創(chuàng)造有效途徑。
【附圖說明】：
[0017] 圖1BMPR-IB基因P1引物PCR擴(kuò)增結(jié)果。
[0018] 圖2 BMPR-IB基因AvaII限制性內(nèi)切酶酶切結(jié)果；
[0019] 圖中：M.DL2000DNAMarker;l-2.BB型；3.++ 型；4-5.B+型；
[0020] 圖3重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定；
[0021] 圖中：M.D