專(zhuān)利名稱(chēng)：一種條件性基因敲除載體的構(gòu)建方法
一種條件性基因敲除載體的構(gòu)建方法技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物基因工程領(lǐng)域中的基因敲除技術(shù)，特別是涉及基因
敲除載體的構(gòu)建方法，尤其是一種適用于小鼠染色體基因敲除載體的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
基因敲除(geneknockout)，是指對(duì)一個(gè)結(jié)構(gòu)已知但功能未知的基因， 從分子水平上設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，將該基因去除，然后從整體觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，推測(cè)相應(yīng)基因的功能。 基因敲除除可中止某一基因的表達(dá)外，還包括引入新基因及引入定點(diǎn)突變。既可以是用突 變基因或其它基因敲除相應(yīng)的正?；?，也可以用正?；蚯贸鄳?yīng)的突變基因。
基因敲除是80年代后半期應(yīng)用DNA同源重組原理發(fā)展起來(lái)的一門(mén)新技術(shù)。
基因敲除的技術(shù)路線(xiàn)如下
(1)構(gòu)建重組基因敲除載體 (2)用電穿孔、顯微注射等方法把重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞核內(nèi)
(3)用選擇培養(yǎng)基篩選已擊中的細(xì)胞 (4)將擊中細(xì)胞轉(zhuǎn)入胚胎使其生長(zhǎng)成為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)行形態(tài)觀察 及分子生物學(xué)檢測(cè) 條件性基因敲除法可定義為將某個(gè)基因的修飾限制于小鼠某些特定類(lèi)型的細(xì)胞 或發(fā)育的某一特定階段的一種特殊的基因敲除方法。它實(shí)際上是在常規(guī)的基因敲除的基礎(chǔ) 上，利用重組酶Cre介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性重組技術(shù)，在對(duì)小鼠基因修飾的時(shí)空范圍上設(shè)置一 個(gè)可調(diào)控的"按鈕"，從而使對(duì)小鼠基因組的修飾的范圍和時(shí)間處于一種可控狀態(tài)。具體的 講，就是在要敲除的基因兩側(cè)各插入一個(gè)lo鄧序列。 其中，條件性基因敲除載體的構(gòu)建工作在目前要花費(fèi)大量的時(shí)間和人力成本，敲
除載體的構(gòu)建方法也關(guān)系到整個(gè)基因敲除方案的設(shè)計(jì)的難易。 條件性基因敲除載體的最終形式如附圖1所示。 第一、條件性基因敲除載體構(gòu)建的第一種方法(附圖2) 傳統(tǒng)的基因敲除載體構(gòu)建方法是以細(xì)菌體內(nèi)同源重組為基本技術(shù)進(jìn)行的。要用到 可進(jìn)行高效體內(nèi)同源重組的工程菌株(如DY380、EL350或EL250)，以及多個(gè)基礎(chǔ)質(zhì)粒(如 pL253、pL452、pL451)(附圖3)?；静襟E如下:
l.BAC的抽提及純化 2.電轉(zhuǎn)用感受態(tài)重組菌(如EL350)的制備及電轉(zhuǎn)化BAC到重組菌株
3.構(gòu)建pL253打耙質(zhì)粒
4.套取BAC中的目的片段
5.構(gòu)建pL452打耙質(zhì)粒 6.插入第一個(gè)loxP (兩個(gè)loxp中間夾一個(gè)neo)
7.純化含第一個(gè)lo鄧的質(zhì)粒 8.菌體內(nèi)表達(dá)cre酶刪除neo，剩下一個(gè)loxp序列
9.構(gòu)建pL451打耙質(zhì)粒 10.插入第二個(gè)loxP ( —個(gè)loxp和一個(gè)neo)
11.純化質(zhì)粒
12.測(cè)序鑒定最終得到的質(zhì)粒 該方法存在的缺點(diǎn)是步驟繁瑣，耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)(通常做一個(gè)載體需要兩個(gè)月甚至 更長(zhǎng)的時(shí)間)，工作量極大。需要的材料較多，重組菌和基本質(zhì)粒一般實(shí)驗(yàn)室難以獲得，所需 的儀器設(shè)備較多，如電轉(zhuǎn)化儀、水浴搖床等，并非所有實(shí)驗(yàn)室都有這個(gè)條件，繁瑣的步驟使 得該方法具體設(shè)計(jì)變得極其復(fù)雜，并且容易受制于酶切位點(diǎn)，選酶變得非常困難。
第二、條件性基因敲除載體構(gòu)建的第二種方法 由于PCR酶的擴(kuò)增效率和保真性的提高，目前世界上很多實(shí)驗(yàn)室采用PCR的方法 來(lái)獲取同源臂和要敲除的基因序列(即附圖1中的L、M、R)，用普通的酶切連接法將三個(gè)片 段依次連入基本質(zhì)粒(如pEASY-Flirt)中，從而達(dá)到載體構(gòu)建的目的。(附圖4)。步驟如 下 1、分別PCR出L、M、R片段(如附圖1所示)，回收片段；
2、用BamHI酶切基本質(zhì)粒pEASY-Flirt和L片段，并回收；
3、連接，轉(zhuǎn)化普通大腸桿菌感受態(tài)，涂板；
4、挑克隆提質(zhì)粒鑒定； 5、用Ascl酶切上已連入L片段的pEASY-Flirt質(zhì)粒R片段，并回收；
6、連接，轉(zhuǎn)化普通大腸桿菌感受態(tài)，涂板；
7、挑克隆提質(zhì)粒鑒定； 8、用Sail酶切已連入L和R片段的pEASY-Flirt和M片段，并回收； 9、連接，轉(zhuǎn)化普通大腸桿菌感受態(tài)，涂板； 挑克隆提質(zhì)粒鑒定； 10、測(cè)序鑒定最終得到的質(zhì)粒。 該方法步驟簡(jiǎn)單，但是由于方法本身的原因，有些無(wú)法克服的缺點(diǎn)，如 1.很難連接長(zhǎng)片段的同源臂。由于基因敲除載體是用于基因打靶的，要求同源臂
不能太短，一般2K到7K左右，而這種長(zhǎng)度的大片段用傳統(tǒng)的酶切連接方法非常困難。 2.克隆過(guò)程中載體自連情況嚴(yán)重。這是此種方法實(shí)際應(yīng)用起來(lái)最為困難的一個(gè)情
況，由于載體是采用單酶切連接，且連接片段較長(zhǎng)，即便是優(yōu)化的連接體系中，也需要耗費(fèi)
非常多的工作量從大量的克隆中篩選正確克隆。陽(yáng)性克隆率極低。 3.實(shí)際耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)。由于極低的陽(yáng)性克隆率，造成在工作量大的同時(shí)耗費(fèi)的時(shí)間
也相對(duì)較長(zhǎng)，一般用此種方法完成一個(gè)載體構(gòu)建需要一個(gè)月左右的時(shí)間。 4.選酶較為困難。由于基本質(zhì)粒只提供單酶切位點(diǎn)，如果在L上有BamHI，M上有
SalI，R上有Ascl則無(wú)法進(jìn)行，只能換方案或者用消化成平末端進(jìn)行連接，但是會(huì)產(chǎn)生更多問(wèn)題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提供一種高效并且合
理的完成條件性基因敲除載體的構(gòu)建方法。
本發(fā)明提供的條件性基因敲除載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟 第1、設(shè)計(jì)引物按常規(guī)設(shè)計(jì)左右同源片段L和R以及要敲除的序列M的引物，并
在引物的5'端加入如下序列 L上游引物加入TAGCGGCCGCGGATCCL下游引物加入ACGAAGTTATGGATCC
4
M上游引物加入TAGGAACTTCGTCGAC
M下游引物加入AAATGACGTGGTCGAC
R上游引物加入CGAAGTTATGGCGCGCC
R下游引物加入TGTTTAAACGGCGCGCC ; 第2、 PCR左右同源片段L、 R和要敲除的序列M，回收片段； 第3、BamHI酶切基本質(zhì)粒(如pEASY-Flirt)，回收，根據(jù)實(shí)際情況，也可先切其他 兩個(gè)位點(diǎn)； 第4、 10微升亍本系中加入亍本外重纟且酶(In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit) 1微升，buffer2微升，載體和片段L按試劑說(shuō)明書(shū)比例加入，水補(bǔ)齊；體系放置于 37°C 30min， 50°C 30min ;之后加入40微升pH = 8. 0的TE，混勻，從中取5微升轉(zhuǎn)化感受態(tài) 細(xì)胞，轉(zhuǎn)化感受態(tài)，然后加入LB液體培養(yǎng)基500微升，放置于37t:搖床200rpml小時(shí)；涂相 應(yīng)抗性平板，37t:培養(yǎng)箱放置過(guò)夜；挑克隆，提質(zhì)粒，酶切鑒定正確的質(zhì)粒；
第5、將第4步鑒定正確的質(zhì)粒用Ascl切，回收；標(biāo)記為+pL
第6、10微升體系中加入體外重組酶(In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit) 1 微升，buffer2微升，第5步得到的載體+pL和片段R按試劑說(shuō)明書(shū)比例加入，水補(bǔ)齊；體系 放置于37°C 30min，50。C 30min ;之后加入40微升pH = 8. 0的TE，取5微升轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì) 胞；轉(zhuǎn)化后加LB500微升200rpml小時(shí)；涂相應(yīng)抗性平板，37。C培養(yǎng)箱放置過(guò)夜；挑克隆，提 質(zhì)粒，酶切鑒定正確的質(zhì)粒； 第7、將第6步鑒定正確的質(zhì)粒用Sail切，回收；標(biāo)記為+pLR第8、10微升體系中加入體外重組酶(In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit) 1
微升，buffer2微升，第7步得到的載體+pLR和片段M按試劑說(shuō)明書(shū)比例加入，水補(bǔ)齊；體
系放置于37°C 30min， 50°C 30min ;之后加入40微升pH = 8. 0的TE，取5微升轉(zhuǎn)化感受態(tài)
細(xì)胞；轉(zhuǎn)化后加LB500微升200rpml小時(shí)；涂相應(yīng)抗性平板，37。C培養(yǎng)箱放置過(guò)夜；挑克隆，
提質(zhì)粒，酶切鑒定正確的質(zhì)粒； 第9、測(cè)序鑒定最終得到的基因敲除載體。 此方法不僅可以用于小鼠條件性基因敲除載體的構(gòu)建，而且可以用于其它符合此 基因敲除原理的其他物種的條件性基因敲除載體構(gòu)建工作。而且本技術(shù)思路還可用于基因 敲入載體的構(gòu)建。 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果 本發(fā)明與現(xiàn)有載體構(gòu)建方法比較具有如下優(yōu)點(diǎn) 1、極大節(jié)省時(shí)間。本發(fā)明所述方法一般用一周時(shí)間即可完成載體構(gòu)建工作；
2、適合長(zhǎng)片段的同源臂。由于采用重組的方法而非傳統(tǒng)酶切連接的方法，可以在 不明顯降低效率的情況下適合幾十bp到十幾Kb長(zhǎng)度的片段重組。 3、陽(yáng)性克隆率極高。高的克隆效率和正確率使得該方法的重復(fù)性很好，基本可以 保證一次成功。 4、極大節(jié)省工作量。該方法應(yīng)用簡(jiǎn)單，并且不需要大量的挑克隆鑒定工作，大大節(jié) 省勞動(dòng)量。 5、受酶切位點(diǎn)的影響小了很多。采用重組而非酶切，所以即便L上有BamHI， M上 有Sall， R上有Ascl也可照樣進(jìn)行載體構(gòu)建而無(wú)須改動(dòng)設(shè)計(jì)。

圖1是條件性基因敲除載體示意圖，圖中，L為左同源臂、N為PGK-Neo序列、M為 要敲除的基因序列、R為右同源臂、TK為負(fù)篩選標(biāo)記、三角形代表LoxP序列、橢圓形代表FRT 序列、虛線(xiàn)部分為載體骨架序列； 圖2是條件性基因敲除載體構(gòu)建方法一的流程圖；
圖3是條件性基因敲除載體構(gòu)建方法二的示意圖；
圖4是本發(fā)明方法的示意圖；
圖5是實(shí)施例1的最終條件性基因敲除載體圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1 : mirna-146a的條件性基因敲除載體的構(gòu)建
第1、設(shè)計(jì)引物，L上游引物TAGCGGCCGCGGATCCGGCTCTCTGTGAGATCTCACGA
L下游引物ACGAAGTTATGGATCCGATATCATCCCAGCGAAGAAGAAGGT
M上游引物TAGGAACTTCGTCGACTATGGGGTGGCCTCAAACTG
M下游引物AAATGACGTGGTCGACGCTCTCTTTTTCTTCTTGACGAT
R上游引物CGAAGTTATGGCGCGCCGATATCAAACATTGTGGCACATAC
R下游引物TGTTTAAACGGCGCGCCTCTTTGGTATCAACTTGACA 。 第2、用以上引物PCR左右同源片段和要敲除的序列，分別標(biāo)記為aL、 aR和aM，回 收片段； 第3 、 BamHI酶切基本質(zhì)粒pEASY-Fl irt ，回收 第4、 10微升體系中加入體外重組酶(In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit)l微升，buffer2微升，載體和片段aL按試劑說(shuō)明書(shū)比例加入，水補(bǔ)齊。體系放置于 37°C 30min， 50°C 30min。之后加入40微升pH = 8. 0的TE，混勻，從中取5微升轉(zhuǎn)化感受態(tài) 細(xì)胞，轉(zhuǎn)化感受態(tài)，然后加入LB液體培養(yǎng)基500微升，放置于37t:搖床200rpml小時(shí)；涂相 應(yīng)抗性平板，37t:培養(yǎng)箱放置過(guò)夜；挑克隆，提質(zhì)粒，酶切鑒定正確的質(zhì)粒。
第5、鑒定正確的質(zhì)粒用Ascl切，回收； 第6、 10微升體系中加入體外重組酶(In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit)l微升，buffer2微升，載體和片段aR按試劑說(shuō)明書(shū)比例加入，水補(bǔ)齊。體系放置于 37°C 30min， 50°C 30min。之后加入40微升pH = 8. 0的TE，混勻，從中取5微升轉(zhuǎn)化感受態(tài) 細(xì)胞，轉(zhuǎn)化感受態(tài)，然后加入LB液體培養(yǎng)基500微升，放置于37t:搖床200rpml小時(shí)；涂相 應(yīng)抗性平板，37t:培養(yǎng)箱放置過(guò)夜；挑克隆，提質(zhì)粒，酶切鑒定正確的質(zhì)粒。
第7、鑒定正確的質(zhì)粒用Sail切，回收 第8、 10微升體系中加入體外重組酶(In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit)l微升，buffer2微升，載體和片段aM按試劑說(shuō)明書(shū)比例加入，水補(bǔ)齊。體系放置于 37°C 30min， 50°C 30min。之后加入40微升pH = 8. 0的TE，混勻，從中取5微升轉(zhuǎn)化感受態(tài) 細(xì)胞，轉(zhuǎn)化感受態(tài)，然后加入LB液體培養(yǎng)基500微升，放置于37t:搖床200rpml小時(shí)；涂相
6應(yīng)抗性平板，37。C培養(yǎng)箱放置過(guò)夜；挑克隆，提質(zhì)粒，酶切鑒定正確的質(zhì)粒。 第9、將最終得到設(shè)計(jì)的基因敲除載體質(zhì)粒，質(zhì)粒送測(cè)序公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與設(shè)
計(jì)的序列比對(duì)后證明序列完全符合設(shè)計(jì)。測(cè)序結(jié)果如下，
aL ggctctctgtgagatctcacgagggtggggcaaaggcctggcagccttggtcttgctgcatccccagca tctggcctcacctctccg gtectctgtgggtgagtgatgagccggtggaggtggagggagagctgtcgctggatc^tgcgattggc ttttcaaagtgcatcatg gtcccctcctagggcacttggcatgctgtgggaggcatcctacctgctcaagtctcatatgctcataaa gctgcca^gag^gg^t tagatgataccatctttcatctttggagtctggctcacacaggagctttgtgaaggcacacaggctgga c3C肌3tg肌ggtg3ctcatctc3ctttg3tgC3C3CC3tggg^tg3gggtgtegg^^tg^ttte actctgtctcctttcttgaaaaaaaatttctggactgtgtctatgatccaagtgtgttctagaagctgg ctactccctactccgacatgaaaaaagttaaaagtgagcttatagggtcagaaccccccctggaaatat ^tete3ttcttet^ttte3tg3te^^g3C3^c3gcccagttteg^gttgc肌^tetgtg肌t tttttttttttgtctgaacaaagta gctgtgc3肌tgc3gte肌teg3tg^肌ggtgcgc^cctcattegcc3cc3ggg3g3ggc3^tc^
^CC3C3gtg3ggC3C cgctttgtecctgctggg3g^ctec^tc^肌3gtc3ggccatetegc^ggctgtgg3g^3gg^ cccccagaccctggcg g3gg^3tgtc^3tggtgg3gc3gctttegtgg3g3gtgtg3g3gttctcte^g3g3C3tggatgte atggaaccccaccatcta ctctg3gttec3g3gtc^g3g^3tg3C3gcatctetc3gc3C3g3gctggg肌tggcccteg^gc3 C3g3ggtgggctgg3g3gggggctgtgttte3肌gc3c3gactgttcttgc3g3ggtgcc^gtttgct ccccagaacccatgttgg tggctcacaacaacttgtaaatctagctctagggggactctgtagcctcctttgccacctgcattcatg ccteg3ggtcgggteteg^gtc3gg3gte^tgtg3ttegc3tgtegttteggg3tg3tt^^catt cttagattaactatggtggct atcaaacaacttcatggtaatattgaaagccattgagttttatcctttatgagtaggtaaattgtatag tcgtgagttctatttcaaagaaac agttacaattatttaaaaaaaattacttgttgttgtaggggggtcttttgttcagagacttactctataatgctagttggtctggaacccataa tgctacccaggatgaccttgaactcacagaaatcctcctgccttaacctcaagagtgctagggttacag gaatgctccattttgccgag ctgttgtttatatactttcaaaaaaaagcactagcatgggctctgcccctgtgaaaatatagtcttgtt g3C3tc^3ggctctetc^ttegttteteactetg^ggg^gg3ttg^c3tg3C3C3gg3g^tgg caggtetcactgggg^c gg3g3cg3ggtettegtg3ggctettec3ctc肌tg3ttcte3C3gatgccte^tegc3gtggcttg3 ■agggg^ggtcctgctc ttgctgacgtgaagaaatacagtttcaaagatcatctagtgccatgccctgccctatcatgggtggtgc atggcccacattgcatggtg tgggtgcagctgtactgtgcgctctgtctccatgtagaactgggtcactctaggaaatggggcctttgt gcc3ggagtgtgtgtecac ggtgtgtggggggg3ggggtggtgggttcggtg^c3C3g^g3g3C3C3gggtgac^tcc3gtc3tc tctgctattgatggtct tgctg3gg3ggtgattc3gteggtg3g3gcctc3gg3gg^teggcgttg3gggc3gttttcc3ggcc3 ggggcac3tgtetgag ggcacagtggggacggaaagaccatctgtcatgttcctgattgcttttgagaaaatcttgctacgtact tcaggctgcccttggaccag cagtcctcttgatgcaccttcttcttcgctgggatgatatc
aR gatatcaaacattgtggcacataccttcactccaagaaatttggaagcagaggcaggtggctctctggt 3ggcc3gcctgatgtec3 g3gc^gttcc3ggctegcc3g3gctetetegtg3g3ttgtgtctc肌c^3g3gg肌3^肌tegag3 ttgtacttgaccccctctctacacttaaagagtctaggatcacctgcctagggaatgatgctgcctaca gtgggcttggatcttcctatg ccaattaatataatcaatatatccatccacagatatacataggtcaacctgatcgagatgatccctcac taacactctttctaaatgatcc aagattgtgtcaggttgacagtgctaagcaatatagtatggcaattcctcctccggttgggaaaagcga agcatcctataaatagcct cactgagtggttcttgctgctgtgactcttgtttacatttccatgatttaggatgagtcaggtatgaag gggacteagtgctetgcatgct gtteteggagact cat ggg^3C3ccactt teat g^gcttg3g3g3C3C3ggattgcc^gc3gt gat ttcccagtctctttatggg accagatggaattaattgtatgtggcaattatcctttagcatggtctgctgaggtgtttggctgctttt taaagaacacatccttcttatagcccctcatcccttttatttgaacctgtgctttcttgcctactttaa gc^ac^ggggtegagtgttctt
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C3tC3Cgg3CCtg^g^C3 ctggttgg肌C3^ctctg^ggccttcategtctgcc^gg肌cttg^g3gtgg3g3g3gtggggtg ■gcgtgg^ctgctg gcaccggagggagtcatgttggattgatgtgtgttctaatttcatttctgttgctctgataaaatatct ^3gggtttetteg3ttet肌ttcc3ggtc3C3gctg3tcatteteggg^g3C3^gtegg肌cttg3
agcagctcgtctcatacatc gtc^g^g^3^g3gagc最終的mirna-146a條件性基因敲除載體圖見(jiàn)附圖5。
SEQUENCE LISTING
9〈uo〉南開(kāi)大學(xué)〈120〉 一種條件性基因敲除載體的構(gòu)建方法〈130〉〈160>21〈170>PatentIn version<210>1〈211>16〈212>DNA<213>Artificial〈220〉〈223〉<400>1tagcggccgc ggatcc〈210>2<211>16〈212>DNA〈213〉A(chǔ)rtificial<220>〈223〉〈400>23cg朋gttet ggatcc〈210>3〈211>16〈212>DNA〈213〉A(chǔ)rtificial<220>〈223〉〈400>3taggaacttc gtcgac〈210>4〈211>16<212>DNA〈213〉A(chǔ)rtificial〈220〉<223>〈400>4a朋tgacgtg gtcgac〈210>5〈211>17
10693902 A〈212>DNA〈213〉A(chǔ)rtificial〈220〉〈223〉〈400>5cgaagttatg gcgcgcc〈210>6〈211>17〈212>DNA〈213〉A(chǔ)rtificial〈220〉〈223〉〈400〉6tgtttaaacg gcgcgcc〈210>7〈211>16〈212>DNA〈213>Artificial〈220〉〈223〉〈400>7tagcggccgc ggatcc〈210>8〈211>16〈212>DNA〈213〉A(chǔ)rtificial〈220〉〈223>〈400>8acg朋gttet ggatcc〈210>9〈211>16〈211>16〈212>DNA〈213〉A(chǔ)rtificial<220>〈223〉〈400>10肌atgacgtg gtcgac〈210>11〈211>17〈212>醒〈213〉A(chǔ)rtificial〈220〉〈223〉〈400>11cgaagttatg gcgcgcc〈210>12〈211>17<212>DNA〈213〉A(chǔ)rtificial〈220〉〈223〉〈400>12tgtttaaacg gcgcgcc〈210>13<211>38〈212>DNA〈213〉A(chǔ)rtificial〈220〉〈223〉〈400>13tagcggccgc ggatccggctctctgt.gagatctcacga<210>14〈211>42〈212>DNA〈213〉A(chǔ)rtificial〈220〉〈223〉〈400>14acg朋gttat ggatccg;at3tcatcccagcg33g朋gemg gt
〈210>15 〈211〉36 〈212>DNA 〈213〉A(chǔ)rtificial 〈220〉 〈223〉 〈400>15 taggaacttc gtcgactatg gggtggcctc aaactg 36 〈210>16 〈211>39 〈212>DNA 〈213〉A(chǔ)rtificial 〈220> 〈223〉 〈400〉 16 aaatgacgtg gtcgacgctc tctttttctt cttgacgat 39 〈210〉17 〈211>41 〈212>DNA 〈213〉A(chǔ)rtificial <220> 〈223〉 〈400>17 cgaagttatg gcgcgccgat atcaaacatt gtggcacata c 41 〈210>18 〈211>37 〈212>DNA 〈213〉A(chǔ)rtificial 〈220〉 〈223〉 〈400〉18 tgtttaaacg gcgcgcctct ttggtatcaa cttgaca 37 〈210>19 〈211 〉2435 〈212>DNA 〈213>Mus musculus 〈400〉19 ggctctctgt g卿tctcac gagggtgggg caaaggcctg gcagccttgg tcttgctgca 60 tccccagcat ctggcctcac ctctccggt.a ctctgtgggt gagtgatgag ccggtggagg 120
13
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〈210〉20〈211〉1704〈212〉DNA〈213〉Mus musculus〈400〉20gatetc朋3cattgtggcacataccttcacctctctggtaggccagcctgatgtecagagg卿ttgtgtctc朋ca朋gttgaccccctctctacactt3朋gagtcte織gtgggcttggatcttcctatgccaattacctgatcgagatgatcccttgtgtc郷ttgacagtgctgcg朋gcatcctete朋tegcctcactgagtttccatgattteggatgagtcaggtetgaggagactcatggg朋3C3CCactttaatgagatttcccagtctctttatgggaccagatggcatggtctgctg郷tgtttggctgctttcacatccttcttatagcccctcatcccttt朋gca朋c朋ggggt卿gtgttcttttgttacactccactgtaactgacagtttcttccctatttggacatatagtctagacctctgtc3CC朋gC3tgttgggtctctgattatctgggcttttgaatttgggaactcctctttgactcatcactacgttgtctctgaatga朋3gag郷gaggtegtgctcagtctttcaactgaggaacgteggtgctttgcctatacgatctcagtgaatcttacaacaaaaggattttttcccctgttattetattttggctcggtattgttctgagagctgctggccacatgacctcggcaggctcactttctcctttgcatg朋gtccaggttetggtggctcttcttecatcaattaactactcgatctaaateacccctcctegggateatcttgtcaagttgatacca朋ga〈210〉21〈211〉644〈212〉DNA〈213〉Mus musculus〈400〉21
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15
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一種條件性基因敲除載體的構(gòu)建方法，其特征在于該方法包括如下步驟第1、設(shè)計(jì)引物按常規(guī)設(shè)計(jì)左右同源片段L和R以及要敲除的序列M的引物，并在引物的5’端加入如下序列L上游引物加入TAGCGGCCGCGGATCCL下游引物加入ACGAAGTTATGGATCCM上游引物加入TAGGAACTTCGTCGACM下游引物加入AAATGACGTGGTCGACR上游引物加入CGAAGTTATGGCGCGCCR下游引物加入TGTTTAAACGGCGCGCC；第2、PCR左右同源片段L、R和要敲除的序列M，回收片段；第3、BamHI酶切基本質(zhì)粒，回收，根據(jù)實(shí)際情況，也可先切其他兩個(gè)位點(diǎn)；第4、10微升體系中加入體外重組酶(In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit)1微升，buffer2微升，載體和片段L按試劑說(shuō)明書(shū)比例加入，水補(bǔ)齊；體系放置于37℃30min，50℃30min；之后加入40微升pH＝8.0的TE，混勻，從中取5微升轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化感受態(tài)，然后加入LB液體培養(yǎng)基500微升，放置于37℃搖床200rpm1小時(shí)；涂相應(yīng)抗性平板，37℃培養(yǎng)箱放置過(guò)夜；挑克隆，提質(zhì)粒，酶切鑒定正確的質(zhì)粒；第5、將第4步鑒定正確的質(zhì)粒用AscI切，回收；標(biāo)記為+pL第6、10微升體系中加入體外重組酶(In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit)1微升，buffer2微升，第5步得到的載體+pL和片段R按試劑說(shuō)明書(shū)比例加入，水補(bǔ)齊；體系放置于37℃30min，50℃30min；之后加入40微升pH＝8.0的TE，取5微升轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞；轉(zhuǎn)化后加LB500微升200rpm1小時(shí)；涂相應(yīng)抗性平板，37℃培養(yǎng)箱放置過(guò)夜；挑克隆，提質(zhì)粒，酶切鑒定正確的質(zhì)粒；第7、將第6步鑒定正確的質(zhì)粒用SalI切，回收；標(biāo)記為+pLR第8、10微升體系中加入體外重組酶(In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit)1微升，buffer2微升，第7步得到的載體+pLR和片段M按試劑說(shuō)明書(shū)比例加入，水補(bǔ)齊；體系放置于37℃30min，50℃30min；之后加入40微升pH＝8.0的TE，取5微升轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞；轉(zhuǎn)化后加LB500微升200rpm1小時(shí)；涂相應(yīng)抗性平板，37℃培養(yǎng)箱放置過(guò)夜；挑克隆，提質(zhì)粒，酶切鑒定正確的質(zhì)粒；第9、測(cè)序鑒定最終得到的基因敲除載體。
全文摘要
一種高效并且合理的完成條件性基因敲除載體的構(gòu)建方法。包括如下步驟設(shè)計(jì)出包含15bp重組序列的左右同源片段L和R以及要敲除的序列M的引物，并PCR擴(kuò)增出L、R和M，經(jīng)過(guò)三次線(xiàn)性化載體，體外重組酶(In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit)重組，轉(zhuǎn)化感受態(tài)的步驟，完成最終載體的構(gòu)建工作。本發(fā)明極大的節(jié)省了構(gòu)建時(shí)間，且陽(yáng)性克隆率極高，適合長(zhǎng)片段的同源臂。此方法不僅可以用于小鼠條件性基因敲除載體的構(gòu)建，而且可以用于符合此基因敲除原理的其它物種的條件性基因敲除載體構(gòu)建工作，同時(shí)還可用于基因敲入載體的構(gòu)建。
文檔編號(hào)C12N15/85GK101693902SQ200910070819
公開(kāi)日2010年4月14日 申請(qǐng)日期2009年10月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月16日
發(fā)明者尹芝南, 張松, 王璞玥, 羅維, 趙立青 申請(qǐng)人:南開(kāi)大學(xué);