專利名稱：：一種hiv-1整合酶表達(dá)菌株及整合酶抑制劑體外篩選模型的制作方法一種HIV-1整合酶表達(dá)菌株及整合酶抑制劑體外篩選模型
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明利用基因工程構(gòu)建可溶性整合酶表達(dá)載體和帶有整合酶底物L(fēng)TR序列的質(zhì)粒，用純化的整合酶作用于底物質(zhì)粒，加入樣品即可測定樣品對整合酶活性的影響。此檢測模型克服了已有ELISA檢測法成本高，本底高，影響因素多等缺點(diǎn)，可在體外大量而快速的對各種天然或化學(xué)合成的整合酶抑制劑進(jìn)行初步篩選。
背景技術(shù)：
：人類獲得性免疫缺陷綜合癥(acquiredimmunodeficiencysyndrome,AIDS,又稱艾滋病)是由人免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus,HIV)引起的。艾滋病是一種具有較高傳染率的疾病，全球HIV感染和死亡人數(shù)居高不下。目前尚沒有治療愛滋病的有效方法。整合酶是HIV-1感染至發(fā)病過程中的關(guān)鍵酶，而且在人體中沒有其同源類似物，因此抑制整合酶的藥物對人體的副作用相對較小。整合酶作為抗HIV的新靶點(diǎn)，近年來受到各研究者的關(guān)注。隨著研究的不斷深入，新型整合酶抑制劑不斷涌現(xiàn)，但是相比其它抗HIV-l藥物，整合酶抑制劑的研究進(jìn)展緩慢，這很大程度上是因?yàn)檎厦杆幬锖Y選模型的缺乏。大量抗HIV-1藥物的快速篩選、活性的研究、作用機(jī)理的闡明都需要高效、可靠的檢測模型。目前，還沒有理想的艾滋病動(dòng)物模型，而且動(dòng)物模型往往具有成本高，周期長，實(shí)驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定以及難以大規(guī)模篩選藥物等缺點(diǎn)，抗艾滋病藥物的篩選主要還是依賴于體外篩選模型。目前，對于HIV-1整合酶體外藥物篩選方法主要是放射自顯影法及改良ELISA法。這兩種方法都有很多缺點(diǎn)而得不到廣泛應(yīng)用。放射性自顯影法中用到的放射性元素對實(shí)驗(yàn)操作者具有一定的危害并且易對環(huán)境造成污染；改良的ELISA法對實(shí)驗(yàn)人員操作技術(shù)要求較高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定，反應(yīng)本底、假陽性率高和成本都較高。已有文獻(xiàn)報(bào)道，通過PCR技術(shù)引入F185K和C280S突變于HIV-1整合酶cDNA片段中，可增加整合酶的溶解度。純化后的HIV-1整合酶不需要特殊的細(xì)胞因子，在體外反應(yīng)體系中即可顯示3'切割活性和鏈轉(zhuǎn)移活性，可用于體外抗HIV-l整合酶藥物篩選。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是構(gòu)建一種快速，靈敏，干擾因素少，成本低的HIV-1整合酶抑制劑體外篩選模型，即整合酶切割質(zhì)粒篩選模型。本發(fā)明利用工程菌誘導(dǎo)表達(dá)并純化得到可溶性整合酶，再構(gòu)建整合酶作用最佳底物質(zhì)粒，并將整合酶和檢測樣品一同加入反應(yīng)體系，整合酶可將超螺旋底物質(zhì)粒線性化。利用DNA電泳和凝膠成像分析技術(shù)可快速檢測樣品活性。整合酶體外切割質(zhì)粒的篩選模型簡單、易操作，可在l小時(shí)內(nèi)完成對樣品整合酶抑制活性的檢測，并可開發(fā)制成基因芯片，進(jìn)行大規(guī)模檢測。本發(fā)明提供的HIV-1整合酶表達(dá)菌株，通過如下步驟構(gòu)建得到第l、根據(jù)HIV-1整合酶基因序列(來自質(zhì)粒pNL4-3，可在NCBI中査得)、需要突變的位點(diǎn)F185K和C280S、以及LTR序列(來自質(zhì)粒pNL4-3,可在NCBI中查得)設(shè)計(jì)引物并由擴(kuò)增得到目的片段；第2、將第1步得到的目的片段連接到pET28a載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌構(gòu)建工程菌，即得到HIV-1整合酶表達(dá)菌株。所述的HIV-1整合酶表達(dá)菌株的構(gòu)建方法的具體步驟如下第1.1、引物合成根據(jù)整合酶基因序列設(shè)計(jì)引物His-Primer1:5，-CAGCATATGTTTTTAGATGGAATAGATAAGGCCCMGATGMC-3，Ndel酶切位點(diǎn)CATATG;起始密碼子ATGPrimer2:5'-ATAGGATCCTTACTAATCCTCATCCTGTCTACTTGCCACAGMTCATCACCTGCC-3'BaraHI酶切位點(diǎn)GGATCC，終止密碼子TTA、CTA;突變位點(diǎn)AGA，得到C280S;Primer3:5'-CCACMTAAAMAAGAAMGGGGGGATTGGG-3'突變位點(diǎn)AAA，得到F185K;Primer4:5'-CCCMTCCCCCCTTTTCTTTTTTTATTGTGG-3'突變位點(diǎn)TTT;LTR-Primer1:5'-CAGTGGATCCGACTGTGGAAGGGCTAATTTGGTC-3，BamHI酶切位點(diǎn)GGATCC;整合酶作用位點(diǎn)ACTG;LTR-Primer2:5'-CGACGAATTCGACTGCTAGAGATTTCCAC-3'EcoRI酶切位點(diǎn)GAATTC;整合酶作用位點(diǎn)ACTG;第1.2、PCR反應(yīng)用以上設(shè)計(jì)的4條整合酶相關(guān)引物，以質(zhì)粒pNL4-3為模板，進(jìn)行雙重PCR得到位點(diǎn)突變的F185K/C280S整合酶目的基因(圖1);根據(jù)設(shè)計(jì)LTR序列設(shè)計(jì)引物，PCR得到HIV-1LTR目的片段(圖2);PCR程序94°C，5min;94°C30s，55°C30s，72°Clmin，30個(gè)循環(huán)；72。C，5min;4。C保存；第1.3、酶切連接Ndel/BaraHI雙酶切整合酶PCR產(chǎn)物，連接到表達(dá)載體pET28a構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌BL21中構(gòu)建HIV-1整合酶表達(dá)菌株；BamHI/EcoRI雙酶切LTR的PCR產(chǎn)物，連接到pUC19構(gòu)建底物質(zhì)粒。6表一酶切及連接體系DNA酶切體系DNA連接體系DNA外源DNA片段5"10XKbuffer1"載體DNA片段1"Ndel或EcoRI0.5uLiox連接緩沖液luLBamHI0.5uLT4DNA連接酶liiLddH203"ddH202"總體積10uL總體積10uL37t酶切2小時(shí)4'C過夜連接第1.4、轉(zhuǎn)化構(gòu)建工程菌按照1:10的比例將重組質(zhì)粒pET28a-IN轉(zhuǎn)化入BL21感受態(tài)細(xì)胞中，同樣的方法將PUC19-HIVLTR轉(zhuǎn)入DH5cx感受態(tài)細(xì)胞中；分別用帶有硫酸卡那霉素和氨節(jié)青霉素的LB平板進(jìn)行陽性克隆子的篩選，保存正確的克隆命名為ET28-IN(BL21)。一種HIV-1整合酶抑制劑體外篩選模型，該模型在上述HIV-1整合酶表達(dá)菌株的構(gòu)建基礎(chǔ)上，還包括如下步驟第3、將第2步得到的含有整合酶基因的工程菌大量培養(yǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)生整合酶，親和層析，純化整合酶；第4、大量培養(yǎng)含有底物質(zhì)粒pUC19-HIVLTR的工程菌DH5a，提取底物質(zhì)粒；所述的底物質(zhì)粒為含有LTR序列的質(zhì)粒，此質(zhì)粒能夠轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌DH5a中，并通過菌體培養(yǎng)質(zhì)粒提取而得到；第5、用整合酶切割底物質(zhì)粒模型檢測樣品對整合酶的抑制作用。即將第3步得到的整合酶和第4步得到的底物質(zhì)粒加入到切割反應(yīng)體系中37'C作用30min，電泳20min，凝膠成像檢測不同構(gòu)型質(zhì)粒的IOD值，線型DNA的IOD值越高，表明整合酶切割質(zhì)粒的效率越高。所述的HIV-1整合酶抑制劑體外篩選模型的構(gòu)建方法的具體構(gòu)建步驟如下第3.1、HIV-1整合酶的表達(dá)和純化第3.1.1、過夜培養(yǎng)的種子菌BL21-ET28a-IN按照1;100接種到新鮮LB培養(yǎng)基中，加入硫酸卡那霉素至終濃度60"g/ml，37°C，180轉(zhuǎn)，培養(yǎng)3小時(shí)；第3.1.2、加入IPTG至終濃度0.4mM，37°C，150轉(zhuǎn)，誘導(dǎo)表達(dá)3小時(shí)；第3.1.3、5000rpm離心30min收集菌體，1L發(fā)酵液的菌體溶于50mlO.OIM的PBS;第3.1.4、300W超聲破碎30min,20，OOOrpm離心30min取上清液;第3.1.5、上清液通過NTA-Ni親和層析柱，用100mM咪唑洗去雜質(zhì)，用500mM咪唑洗脫目的蛋白；7第3.1.6、用PBS緩沖液超濾，除去咪唑，冷凍干燥得到整合酶于-8(TC保存(圖3);第3.2、整合酶體外切割實(shí)驗(yàn)第3.2.1、在10ul20mM的Tris-HC1反應(yīng)體系中加入20pmol整合酶，200ngpUC19-HIVLTR，2mMMnCl，5mMe-巰基乙醇；第3.2.2、37。C溫育30min;第3.2.3、加入1"10Xloadingbuffer終止反應(yīng)，1%瓊脂糖凝膠60V電泳；第3.2.4、利用DNA電泳技術(shù)及凝膠成像系統(tǒng)分析不同質(zhì)粒構(gòu)型的IOD值(圖4)，計(jì)算公式抑制率(％)=(Is-IQ)/(Ib-I())X100%Is:被測樣品組底物質(zhì)粒在整合酶作用下3種構(gòu)型質(zhì)粒的IOD比值(ccDNA+1DNA+ocDNA)/1DNA;Io:負(fù)對照組底物質(zhì)粒在整合酶作用下3種構(gòu)型質(zhì)粒的IOD比值(ccDNA+1DNA+ocDNA)/1DNA;Ib:空白對照組即底物質(zhì)粒在無整合酶作用下3種構(gòu)型質(zhì)粒的IOD比值(ccDNA+1DNA+ocDNA)/1DNA。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果本發(fā)明構(gòu)建的HIV-1整合酶切割質(zhì)粒篩選模型簡單易操作，可在1小時(shí)內(nèi)完成樣品對整合酶3'切割活性的檢測，快速，靈敏，干擾因素少，成本低廉，還可開發(fā)成基因芯片進(jìn)行大規(guī)模檢測，可制成商品試劑盒用作天然抗HIV-1整合酶藥物篩選，對抗HIV-1整合酶藥物的開發(fā)具有重大意義。圖1是利用雙重PCR擴(kuò)增HIV-1IN基因1.用Primer2和Primer3以pNL4-3為模板PCR擴(kuò)增得到約300bp的片段1;2.用Primer1和Primer4以pNL4-3為模板PCR擴(kuò)增得到約600bp的片段2;3.用Primer1和Primer2以片段1和片段2為模板PCR擴(kuò)增出約900bp的目的片段；4.MarkerII.)圖2是含重組質(zhì)粒PUC-LTR菌株的鑒定1.約600bp的LTRPCR產(chǎn)物；2.MarkerII.圖3是HIV-1IN表達(dá)鑒定；表達(dá)條件1:100接菌，37°C培養(yǎng)4小時(shí)，加入IPTG至終濃度0.4mM，30。C誘導(dǎo)表達(dá)2小時(shí)；1.未誘導(dǎo)表達(dá)IN的菌體裂解液；2.IPTG誘導(dǎo)表達(dá)IN的菌體裂解液；3.MK;圖4是His-IN體外切割pUC19質(zhì)粒；1.30pmolHis-IN+200ngpUC19-HIVLTR;2.對照pUC19-HIVLTR。具體實(shí)施方式實(shí)施例1:本發(fā)明提供的篩選模型的具體構(gòu)建步驟如下1、引物合成根據(jù)整合酶基因序列(來自質(zhì)粒pNL4-3，可在NCBI中査得)設(shè)計(jì)引物His-Primerl:5，-CAGCATATGTTTTTAGATGGMTAGATAAGGCCCMGATGAAC-3'Ndel酶切位點(diǎn)CATATG;起始密碼子ATGPrimer2:5,-ATAGGATCCTTACTAATCCTCATCCTGTCTACTTGCCACAGMTCATCACCTGCC-3，BamHI酶切位點(diǎn)GGATCC，終止密碼子TTA、CTA;突變位點(diǎn)AGA(得到C280S);Primer3:5'-CCACMTAAAAAAAGAAAAGGGGGGATTGGG-3，突變位點(diǎn)AAA(得到F185K);Primer4:5'-CCCMTCCCCCCTTTTCTTTTTTTATTGTGG-3'突變位點(diǎn)TTT;LTR-Primer1:5，-CAGTGGATCCGACTGTGGAAGGGCTAATTTGGTC-3，BaraHI酶切位點(diǎn)GGATCC;整合酶作用位點(diǎn)ACTG;LTR-Primer2:5，-CGACGAATTCGACTGCTAGAGATTTCCAC-3'EcoRI酶切位點(diǎn)GAATTC;整合酶作用位點(diǎn)ACTG;2、PCR反應(yīng)用設(shè)計(jì)的4條整合酶相關(guān)引物，以質(zhì)粒pNL4-3為模板，進(jìn)行雙重PCR得到位點(diǎn)突變的F185K/C280S整合酶目的基因(圖一)；根據(jù)設(shè)計(jì)LTR序列設(shè)計(jì)引物，PCR得到HIV-lLTR目的片段(圖二)。PCR程序94°C，5min;94°C30s，55°C30s，72°Clmin,30個(gè)循環(huán);72°C，5min;4°C保存。3、酶切連接Ndel/BamHI雙酶切整合酶PCR產(chǎn)物，連接到表達(dá)載體pET28a構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌BL21中構(gòu)建表達(dá)菌株。BaraHI/EcoRI雙酶切LTR的PCR產(chǎn)物，連接到pUC19構(gòu)建底物質(zhì)粒。表一酶切及連接體系DNA酶切體系DNA連接體系DNA5"外源DNA片段5uL載體DNA片段1uLIOX連接緩沖液luL10XKbufferNdel或EcoRI0.5uL<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>4、轉(zhuǎn)化構(gòu)建工程菌按照1:10的比例將重組質(zhì)粒pET28a-IN轉(zhuǎn)化入BL21感受態(tài)細(xì)胞中，同樣的方法將pUC19-HIVLTR轉(zhuǎn)入DH5a感受態(tài)細(xì)胞中。分別用帶有硫酸卡那霉素和氨節(jié)青霉素的LB平板進(jìn)行陽性克隆子的篩選，保存正確的克隆命名為ET28-IN(BL21)。5、HIV-1整合酶的表達(dá)和純化(1)過夜培養(yǎng)的種子菌BL21-ET28a-IN按照1;100接種到新鮮LB培養(yǎng)基中，加入硫酸卡那霉素至終濃度60Pg/ml，37°C，180轉(zhuǎn)，培養(yǎng)3小時(shí)；(2)加入IPTG至終濃度0.4mM，37°C，150轉(zhuǎn)，誘導(dǎo)表達(dá)3小時(shí)；(3)5000rpra離心30min收集菌體，1L發(fā)酵液的菌體溶于50ml0.01M的PBS;(4)300W超聲破碎30min，20,OOOrpm離心30min取上清液；(5)上清液通過NTA-Ni親和層析柱，用100mM咪唑洗去雜質(zhì)，用500raM咪唑洗脫目的蛋白；(6)用PBS緩沖液超濾，除去咪唑，冷凍干燥得到整合酶于-80'C保存(圖3)。6、整合酶體外切割實(shí)驗(yàn)(1)在10u120mM的Tris-HC1反應(yīng)體系中加入20pmo1整合酶，200ngpUC19-HIVLTR，2mMMnCl,5raM巰基乙醇；(2)37。C溫育30min;(3)加入lul10Xloadingbuffer終止反應(yīng)，1%瓊脂糖凝膠60V電泳;(4)用凝膠成像系統(tǒng)分析不同質(zhì)粒構(gòu)型的IOD值(圖4)。實(shí)施例2:構(gòu)建HIV-1整合酶抑制劑體外篩選模型1、從-8(TC中取出構(gòu)建好的保存于甘油管中的表達(dá)菌株BL21-ET28a-IN，按照1:1000接種于20ml含硫酸卡納霉素60ug/ml的LB培養(yǎng)基中，37°C，180轉(zhuǎn)，過夜培養(yǎng)；2、上步過夜培養(yǎng)的種子菌按照1;100接種到10瓶200mlLB培養(yǎng)基中，加入硫酸卡那霉素至終濃度60ng/ml，37°C，180轉(zhuǎn)，培養(yǎng)3小時(shí)；3、向第2步的每瓶培養(yǎng)物中加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度0.4mM，37°C，150轉(zhuǎn)，誘導(dǎo)表達(dá)3小時(shí)；4、將第3步的每瓶培養(yǎng)物5000卬m離心30min收集菌體，菌體溶于100ml0.01M的PBS緩沖液中，-2(TC冷凍后，再融化；105、將第4步的每瓶培養(yǎng)物300W超戸破碎30min，2U,UOUrpm禺心30min，取上清液；6、向第5步得到的上清中加入咪唑至終濃度20mM，然后通過PBS(0.OIM，pH7.4)平衡好的5mlNTA-Ni親和層析柱，用100mM咪唑100ml洗去雜質(zhì)，先用500mM咪唑洗脫，棄去最初的3ml流出液，收集30ml洗脫液，然后用500mM咪唑充分洗柱，再用PBS平衡柱子可再次使用；7、收集到的洗脫液，用PBS緩沖液超濾，除去咪唑，濃縮成10ml，將濃縮液冷凍干燥得到整合酶干粉于-80°C保存。8、擴(kuò)增培養(yǎng)含有質(zhì)粒pUC19-HIVLTR的大腸桿菌DH5a，提取質(zhì)粒，得到的pUC19-HIVLTR質(zhì)粒溶解于TEbuffer中，-20。C保存。實(shí)施例3:HIV-1整合酶抑制劑體外篩選模型應(yīng)用1、在10u120mM的Tris-HCl反應(yīng)體系中加入20pmo1實(shí)施例1得到的整合酶，200ngpUC19-HIVLTR，2mMMnCl，5raMP-巰基乙醇以及不同濃度的待測樣品；2、將l步中的反應(yīng)體系于37。C溫育30min后，加入1u110Xloadingbuffer終止反應(yīng)，1%瓊脂糖凝膠60V電泳20min;3、用凝膠成像系統(tǒng)UVPBiolmagingSystem觀察2步電泳中的質(zhì)粒條帶，用分析UbWorks45ImageAcquisitionandAnalysisSoftware4.5.00.0分析超螺旋、線形禾口開環(huán)DNA的IOD值。結(jié)果見表二。利用此模型檢測，整合酶抑制劑標(biāo)準(zhǔn)品可顯示出整合酶抑制的活性，結(jié)果表明該模型的構(gòu)建是成功的。利用此模型檢測了天然樣品L2f-2和L2f-3，樣品濃度和抑制率呈良好的線性關(guān)系，說明此模型穩(wěn)定可靠。抑制率(。/。)-(Is-Io)/(Ib-Io)x100。/。Is:被測樣品組底物質(zhì)粒在整合酶作用下3種構(gòu)型質(zhì)粒的IOD比值(ccDNA+腿A+ocDNA)/腿A;Io:負(fù)對照組底物質(zhì)粒在整合酶作用下3種構(gòu)型質(zhì)粒的IOD比值(ccDNA+1DNA+ocDNA)/1DNA;Ib:空白對照組即底物質(zhì)粒在無整合酶作用下3種構(gòu)型質(zhì)粒的IOD比值(ccDNA+腿A+ocDNA)/lDNA。表二從蓮藕中提取的天然活性成分L2f-2和L2f-3對HIV-1IN活性的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>Thevaluesaxemean±S.D.(n=3)*整合酶抑制劑標(biāo)準(zhǔn)序列表<110〉南開大學(xué)〈120〉一種HIV-1整合酶抑制劑體外篩選模型<160〉6〈210>1<211>43<212>DNA〈213〉人工序列<400>1cagcatatgtttttagatggaatagatagiggcccaagatgaac43<210〉2<211〉55〈212〉DNA〈213〉人工序列<400>2ataggatccttactaatcctcatcctgtctacttgccacagaatcatcacctgcc55〈210〉3〈211〉31〈212〉DNA<213>人工序列〈400〉3cc3c肪taa33朋ag333aggggggsttggg31〈210>4〈211〉31<212>歸<213>人工序列<400〉4'cccaatccccccttttctttttttattgtgg31<210>5〈211〉34〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉5cagtggatccgactgtggaagggctaatttggtc34<210>6〈211〉29〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉6cgacgaattcgactgctagagatttccac29權(quán)利要求1、一種HIV-1整合酶表達(dá)菌株，其特征在于該菌株通過如下步驟構(gòu)建得到第1、根據(jù)HIV-1整合酶基因序列、需要突變的位點(diǎn)F185K和C280S、以及LTR序列設(shè)計(jì)引物并由擴(kuò)增得到目的片段；第2、將第一步得到的目的片段連接到pET28a載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌構(gòu)建工程菌，即得到HIV-1整合酶表達(dá)菌株。2、如權(quán)利要求l所述的HIV-lS^SI^i菌株的構(gòu)建友法，，征在于i^法的具術(shù)勾建步驟如下第l.l、引物合成根據(jù)齡麟因序列設(shè)計(jì)弓嫩His-Primerl:5，~CAGCATATGTTTTTAGATGGAATAGATMGGCCCAAGATGMC-3,Ndel酶切位點(diǎn)CATATG;起始密碼子ATGPri鵬r2:5'-ATAGGATCCTTACTMTCCTCATCCTGTCTACTTGCCACAGAATCATCACCTGCC-3，Banffl酶切位點(diǎn)GGATCC，終止密碼子TTA、CTA;突變位點(diǎn)AGA，得到C280S;Primer3:5，~CCACAATAAAAAAAGAAMGGGGGGATTGGG-3，突變位點(diǎn)AM，得到F腿；Primer4:5，HXCMTCCCCCCTnTCTnTTTTATTGTGG-3，突變位點(diǎn)TTT;LTR-Primerl:5，"CAGTGGATCCGACTGTGGMGGGCTMTTTGGTC-3，BamHI酶切位點(diǎn)GGATCC;齡SIJ乍用位點(diǎn)ACTG;LTR-Primer2:5，"CGACGAATTCGACTGCTAGAGATTTCCAC-3，EcoRI酶切位點(diǎn)GAATTC;^ftj乍用位點(diǎn)ACTG;第L2、PCR^iS用以上設(shè)計(jì)的4條^,關(guān)引物，以質(zhì)粒pNL4-3為卑鎌，進(jìn)行)MPCR得至股點(diǎn)突變的F185K/C280S,酶目的基因；根據(jù)設(shè)計(jì)LTR序列設(shè)計(jì)引物，PCR得到HIV-1LTR目的片段；PCR辦94°C，5min;94°C30s，55°C30s，72°Clmin，30個(gè)循環(huán)；72°C，5min;4。C保存；第1.3、酶切連接Ndel/BamHI雙酶切^^PCR產(chǎn)物，連接至U^i^體pET28a構(gòu)錢鄉(xiāng)服粒，轉(zhuǎn)《4^A鄉(xiāng)桿菌BL21中構(gòu)建HIV-1S^"^i菌株；BamHI/EcoRI)X^切LTR的PCR產(chǎn)物，連接到pUC19構(gòu),物質(zhì)粒。第1.4、轉(zhuǎn)化構(gòu)^X程菌按照1:10的比例將重組質(zhì)粒pET28a-IN轉(zhuǎn)化入BL21感受態(tài)細(xì)胞中，同樣的方法將pUC19-HIVLTR轉(zhuǎn)入DH5a感受態(tài)細(xì)胞中；分別用帶頓醉那霉素和氨轉(zhuǎn)霉素的LB平^jj行陽性克HT的篩選，保存正確的克隆命名為BL21-ET28a-IN。3、一種HIV-1齡,制劑體外篩選輕，辦征在于該模型的構(gòu)建是在權(quán)利要求1臓HIV-1^"^i菌株的構(gòu)建基石liUl，還包括如下步驟第3、將第2步得至啲含有整合麟因的工程菌大影歸誘導(dǎo)產(chǎn)^^酶，親和層析，純爐合酶；第4、大M^^有底物質(zhì)粒pUCl^HIVLTR的工程菌DH5a，提,物質(zhì)粒；所述的底物質(zhì)粒為含有LTR序列的質(zhì)粒，jfe^粒倉辦樹^tA大腸桿菌DH5a中，并艦菌體培養(yǎng)質(zhì)米4JI取而得到；第5、用齡酶切割底物質(zhì)樹難檢測樣品對^H的抑制作用，即將第3步得到的齡,第4步得到的底物質(zhì)粒加入至徹割ffi體系中37'C作用30min，電泳2(Mn，？^像檢測不同構(gòu)MM粒的IOD值，線型DNA的IOD值越高，表明整合酶切割質(zhì)粒的效率越高。4、如權(quán)利要求3所述的HIV-1^,制劑體外篩選,的構(gòu)建方法，，征在方法的具鵬建步驟如下第3.1、HIV-1整合酶的皿和純化第3丄l、過夜歸的種子菌BL21-ET28a-IN按照1;100接種到,LBi^^基中，力口入硫酸卡夷瞎素至終濃度60ug/ml，37°C，180轉(zhuǎn)，培養(yǎng)3小時(shí)；第3.1.2、加入IPTG至終濃度0.4mM，37°C，150轉(zhuǎn)，誘導(dǎo)表達(dá)3小時(shí)；第3.1.3、5000rpm離心30min收集菌體，1L發(fā)酵液的菌鵬于50ral0.01M的PBS;第3.1.4、300W超聲破碎30rain，20，OOOrpm離心30min取上清液；第3.1.5、上清M31NTA-Ni親和層析柱，用lOOmM咪(去雜質(zhì)，用500mM咪唑^fel兌目的蛋白；第3.1.6、用PBS緩沖^^濾，除去咪唑，冷凍^B對尋至j齡酶^"8(TC保存；第3.2、齡,外切割實(shí)驗(yàn)第3.2.1、在10u120mM的Tris-HC1反應(yīng)體系中加入20pmo1^酶，200ngpUC19-HIVLTR，2mMMnCl，5raMPi基乙醇；第3.2.2、37。C溫育30min;第3.2,3、力口入1u110Xloadingbuffer終止反應(yīng)，1%瓊月|^繊60V電泳；第3.2.4、利用DNA電泳^:及》W^像系統(tǒng)分析不同質(zhì)粒構(gòu)型的IGD值，計(jì)算公式抑制率(％)=(Wo)/(Ib-Io)x100%Is:被測樣品,物質(zhì)粒^^^f乍用下3種構(gòu)MM粒的IOD比值(ccDNA+lDNA+ocDNA)/lDNA;Io:負(fù)對照鄉(xiāng)fiiS物質(zhì)粒SM合Slf乍用下3種構(gòu)MM粒的IOD比值(ccDNA+IDNA+ocDNA)/lDNA;Ib:空白對照組即底物質(zhì)粒在無整合酶作用下3種構(gòu)型質(zhì)粒的IOD比值(ccDNA+lDNA"focDNA)/lDNA。全文摘要一種HIV-1整合酶表達(dá)菌株及整合酶抑制劑體外篩選模型。本模型首先利用基因工程技術(shù)構(gòu)建HIV-1整合酶可溶性表達(dá)質(zhì)粒和帶有整合酶最適底物L(fēng)TR序列的質(zhì)粒，將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pET28a-IN轉(zhuǎn)化進(jìn)入商品化大腸桿菌BL21中得到整合酶表達(dá)菌株；然后大規(guī)模培養(yǎng)，分離純化整合酶，作用于底物質(zhì)粒，加入樣品測定活性。此檢測模型克服了已有ELISA檢測法成本高，本底高，影響因素多等缺點(diǎn)，可在體外大量而快速的對各種天然或化學(xué)合成的整合酶抑制劑進(jìn)行初步篩選，是一種快速，靈敏，干擾因素少，成本低的HIV-1整合酶抑制劑體外篩選模型。文檔編號(hào)C12Q1/25GK101671646SQ20091007079公開日2010年3月17日申請日期2009年10月14日優(yōu)先權(quán)日2009年10月14日發(fā)明者喬文濤,方劉,呂鵬云,聃張,曲麗媛,寧李,筠江,王常榮,陳芝惠申請人:南開大學(xué)