專利名稱：利用基因工程菌株耦合發(fā)酵合成gdp-甘露糖體系的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是基因工程領(lǐng)域中基因工程菌株的構(gòu)建技術(shù)，尤其是一種利用基因工程菌株 耦合發(fā)酵合成GDP-甘露糖體系的構(gòu)建方法。
技術(shù)背景WHO對(duì)來源于14個(gè)國(guó)家的36項(xiàng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在出生后6個(gè)月內(nèi)，母乳喂養(yǎng)嬰兒的痢疾發(fā) 生率比非母乳喂養(yǎng)嬰兒平均低4-5倍。母乳之所以能夠有效降低新生嬰兒痢疾的發(fā)病度和死亡數(shù)，主要?dú)w因于其含有抗感染、抗 炎癥等多種免疫調(diào)節(jié)因子，主要包括分泌型抗體(slgA)、寡糖、乳鐵蛋白、白細(xì)胞、細(xì)胞因子 等。由于新生嬰兒的免疫系統(tǒng)在2周歲之前未能完全發(fā)育成熟，母乳中這些因子可通過干擾病 原菌在腸道上的粘附、調(diào)節(jié)機(jī)體對(duì)病原菌的炎性反應(yīng)、刺激腸道系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的成熟而達(dá)到 抵抗嬰兒疾病的目的。人乳寡糖的含量在乳糖、脂類之后，為人乳中第三大物質(zhì)。研究表明，母乳喂養(yǎng)或用添加 有人乳寡糖的母乳替代品喂養(yǎng)的嬰兒，其糞便中的有害細(xì)菌數(shù)大大降低；同時(shí)，與通常母乳替 代品喂養(yǎng)嬰兒相比，因細(xì)菌感染而引起的死亡率也明顯降低。由此可見，人乳寡糖具有明顯的 抗感染和某些重要的非特異性免疫學(xué)功能， 一些研究也證明了人乳寡糖能促進(jìn)嬰兒消化道中雙 岐桿菌的增殖，并使梭狀芽胞桿菌和腸球菌的數(shù)量大大減少。人乳寡糖的抗病原菌粘附功能引起了人們的廣泛關(guān)注，許多醫(yī)藥公司也丌始進(jìn)行以人乳寡 糖及其類似物的抗粘附藥物的開發(fā)與臨床研究，但是，人乳寡糖的大量獲得并不容易。目前， 關(guān)于人乳寡糖的功能與制備研究在我國(guó)仍未得到有效丌展，我國(guó)對(duì)功能寡糖類物質(zhì)的丌發(fā)主要 集中在對(duì)天然植物、微生物多糖采用酸、堿、酶、氧化等化學(xué)方法進(jìn)行降解制備低分子量的寡 糖，如殼寡糖、果寡糖等，這類產(chǎn)品目前己成功上市。對(duì)寡糖藥物的開發(fā)雖也在不斷進(jìn)行中， 但僅是用化學(xué)合成方法進(jìn)行制備，并且大多數(shù)工作僅處于研究階段。也有研究單位或企業(yè)通過 微生物發(fā)酵方法生產(chǎn)一些低聚糖類；但僅是利用微生物體內(nèi)JH常酶系進(jìn)行生產(chǎn)，而對(duì)通過基因 工程技術(shù)開發(fā)寡糖的研究還未進(jìn)行。隨著越來越多的糖苷酶及其基因的不斷解析以及微生物代 謝調(diào)控路線的不斷闡明，構(gòu)建代謝工程菌生產(chǎn)結(jié)構(gòu)特定、功能明確的寡糖成為可能。但是，如 何獲得大量廉價(jià)的糖基供體對(duì)于寡糖的制備也是至關(guān)重要的。目前，無論化學(xué)法或酶法合成寡 糖，其所需糖基供均體價(jià)格不菲。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種利用基因工程菌株耦合發(fā)酵合成GDP-甘露糖體系的構(gòu)建方法，該 構(gòu)建方法利用Ac(^表達(dá)系統(tǒng)，對(duì)以甘露糖為底物合成GDP-甘露糖的相關(guān)酶進(jìn)行高效表達(dá)，利 用基因重組技術(shù)構(gòu)建含這三種酶的重組大腸桿菌菌株，進(jìn)行耦合發(fā)酵作用合成GDP-甘露糖的方 法，該方法構(gòu)建的工程菌株能增加三個(gè)酶基因的拷貝數(shù)，提高酶的表達(dá)量，從而能作用于底物 甘露糖合成GDP-甘露糖。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種利用基因工程菌株耦合發(fā)酵合成GDP-甘露糖體系的構(gòu)建方法，構(gòu)建方法包括以下歩驟(1) 基因擴(kuò)增根據(jù)大腸桿菌K-12基因組中己糖激酶基因glk、磷酸甘露糖變位酶基因manB 和甘露糖-l-磷酸鳥苷酰轉(zhuǎn)移酶基因manC的序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增出大腸桿菌中的三個(gè)酶基因序 列；(2) 重組質(zhì)粒的構(gòu)建用酶切連接的方法分別將上述三種目的基因與載體pET-22b相連，得 到攜帶酶基因的重組表達(dá)載體，并進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證；(3) 基因工程菌株的構(gòu)建將上述驗(yàn)證正確的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入宿主菌株BL21(DE3)中， 得到含有重組質(zhì)粒的三種基因工程菌株；(4) 混合發(fā)酵合成GDP-甘露糖三個(gè)基因工程菌株的混合發(fā)酵，通過改變細(xì)胞通透性使工程 菌株的產(chǎn)物作用于甘露糖合成GDP-甘露糖。而且，所述歩驟(3)的三種基因工程菌株分別為BL21(DE3)/pET-22b-glk 、 BL21(DE3)/pET-22b-manB和BL21(DE3)/pET-22b-manC。而且，所述歩驟(4)混合發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分為g/L: BL21(DE3)/pET-22b-gL濕重25; BL21(DE3)/pET-22b-manB濕重15; BL21(DE3)/pET-22b-manC濕重25;甘露糖30:植酸5; KH2P04 25; MgS04.7H20 5; ATP 5; NymeenS-215 4。本發(fā)明的積極效果1、 本發(fā)明以工業(yè)化大腸桿菌為基礎(chǔ)，采用基因工程重組技術(shù)構(gòu)建BL21(DE3)/pET-22b-glk、 BL21(DE3)/pET-22b-manB和BL21(DE3)/pET-22b-manC三種基因工程菌株，運(yùn)用發(fā)酵工程技術(shù) 將三株工程菌進(jìn)行混合發(fā)酵，作用于甘露糖從而合成GDP-甘露糖，為寡糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供一 條可行途徑，不僅得率高，且可以節(jié)約工業(yè)用料，具有明顯社會(huì)效益。2、 本發(fā)明以生產(chǎn)GDP-甘露糖為目的，以甘露糖為出發(fā)點(diǎn)，利用基因工程技術(shù)構(gòu)建代謝工 程菌株，實(shí)現(xiàn)代謝途徑中各種酶的高效表達(dá)，進(jìn)而達(dá)到GDP-甘露糖的大量合成，為進(jìn)一歩批量 生產(chǎn)人乳寡糖提供有效的途徑，打破大量合成巖藻糖基化寡糖大量獲得較難的瓶頸；尤其對(duì)于 當(dāng)前抗生素普通濫用引起的細(xì)菌抗藥性問題不斷惡化問題，采用溫和治療方法如抗粘附療法等進(jìn)行治療，而利用人乳寡糖抵抗病原菌感染就是其中理想選擇之一。本發(fā)明為天'然寡糖藥物的 生產(chǎn)提供了原料，為這一目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)提供可能性，符合當(dāng)前生物藥物領(lǐng)域發(fā)展趨勢(shì)，不僅具有 較強(qiáng)的基礎(chǔ)理論研究?jī)r(jià)值，而且具有巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益，市場(chǎng)開發(fā)能景廣闊。


-圖1為本發(fā)明的擴(kuò)增電泳圖，其中1、己糖激酶glk; 2、磷酸甘露糖變位酶基因manB; 3、甘露糖-l-磷酸鳥苷酰轉(zhuǎn)移酶基因manC;圖2為本發(fā)明pET-glk,pET-manB，pET-manC的重組表達(dá)質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)圖，其中a、重組質(zhì)粒 pET-glk的構(gòu)建；b、重組質(zhì)粒pET-manB的構(gòu)建c、重組質(zhì)粒pET-manC的構(gòu)建；圖3為本發(fā)明利用基因工程菌株混合發(fā)酵合成GDP-甘露糖體系的構(gòu)建流程圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明，下述實(shí)施例是說明性的，不是限定性的，不能以 下述實(shí)施例來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明所涉及的利用基因工程菌株耦合發(fā)酵合成GDP-甘露糖體系的構(gòu)建方法，是利用大腸 桿菌表達(dá)系統(tǒng)BL21(DE3)/pET-22b，對(duì)催化以甘露糖為底物合成GDP-甘露糖的相關(guān)酶(己糖激 酶基因(glk)、磷酸甘露糖變位酶基因(manB)和甘露糖-l-磷酸g苷酰轉(zhuǎn)移酶基因(manC)) 進(jìn)行高效表達(dá)，構(gòu)建分別包含這三種酶的三個(gè)重組大腸菌株，通過代謝調(diào)控手段來進(jìn)行GDP-甘露糖的高效合成。本發(fā)明所用的三個(gè)酶來源是￡xo//-K12，本發(fā)明中重組載體的的宿主細(xì)胞 為大腸桿菌BL21(DE3)。代謝過程中三個(gè)重要的酶DNA序列的重組表達(dá)載體；重組表達(dá)載體除包括編碼酶的DNA 序列外，還具有表達(dá)該基因所需的控制元件，這些載體攜帶有完整的閱讀框架，即含有一個(gè)啟 動(dòng)子和一個(gè)終止子，在啟動(dòng)子和終止子之間有一段多克隆位點(diǎn)，這些多克隆位點(diǎn)分別包含有若 干單一酶切位點(diǎn)，選用限制酶將載體切成線狀，并用DNA連接酶將酶基因連接到所選載體上，從而構(gòu)建成一個(gè)在啟動(dòng)子和終止子之間含有目的基因的重組載體。 構(gòu)建方法步驟是1、己糖激酶基因(glk)、磷酸甘露糖變位酶基因(manB)和甘露糖-l-磷酸鳥苷酰轉(zhuǎn)移酶 基因(manC)的擴(kuò)增提取大腸桿菌￡."http://-&12的基因組，設(shè)計(jì)如下引物 Pglkl: 5，-GGAATTCCATATGATGACAAAGTATGCATTAGTCGGT-3，酶切位點(diǎn)為Nde I ; Pglk2: 5,-CGCQQ^I￡￡TTACAGAATGTGACCTAAGGTCTG-3'酶切位點(diǎn)為BaraH I ; PmanBl: 5，-GGAATTCCATATGATGAAAAAATTAACCTGCTTT-3，酶切位點(diǎn)為Nde I ; PmanB2: 5，-CCCAAGCTTTTACTCGTTCAGCAACGTC-3，酶切位點(diǎn)為HindIII; PmanCl: 5，-CATGCCATGGATATGACAAAGTATGCATTAGTCGGT-3'酶切位點(diǎn)為Nco I ; Pmanc2: 5，-CCCAAGCTTTTACAGAATGTGACCTAAGGTCTG-3，酶切位點(diǎn)為HindIII。以大腸桿菌五.co/Z-K12染色體DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，按以下次序，在滅菌EP管內(nèi) 混合，5a.采用50nL的PCR擴(kuò)增體系
Buffer5[i匕、
dNTP4pL
上游引物
下游引物
模板
聚合酶luL
無菌水30|ilJ
b.用于擴(kuò)增目的基因的PCR條件:
95 °C5min 、
95 。C45s
55 °C45s
72 °C90s
72 °ClOmin;
將所得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)到擴(kuò)增產(chǎn)物
0.9kb(glk),1.3kb(manB)，1.4kb(manC)，結(jié)果如圖1所示，可以看到在約0.9kb,1.3kb,1.4kb處出現(xiàn)
一條特異性條帶，其大小與目的基因大小完全吻合，連接在pET-22b載體上，得到 pET-g汰,pET-wa"S,pET-附a"C，將其測(cè)序可知(委托北京i生物)擴(kuò)增到得己糖激酶基因、磷酸 tf露糖變位酶基因和甘露糖-l-磷酸鳥苷酰轉(zhuǎn)移酶基因的DNA序列如后表。
2、重組質(zhì)粒的構(gòu)建
(l)表達(dá)載體的制備
在氨芐宵霉素(50pg/mL)的LB培養(yǎng)基中接種攜帶質(zhì)粒pET-22b的大腸桿菌JM109菌株 (購自寶生物公司)，于37'C振蕩培養(yǎng)過夜。將1.5mL菌液轉(zhuǎn)入微量離心管中，12000r/min鐘， 離心30s收集菌體，棄上清，控干殘液。將沉淀重懸于IOOPL預(yù)冷的溶液1(5Ommo1蔗糖，25mmo1 Tris,lOmmol EDTA,PH8.0)，混合均勻。加入200PL新配置的溶液2 (0.2mol NaoH，l。/。SDS)蓋 緊管口，輕輕搖勻，放置冰上l-2min至液體清亮。加入150叱預(yù)冷的溶液3(3mo1乙酸甲，PH4.8) 輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)離心管，使溶液3在粘稠的細(xì)菌裂解液中混合均勻，冰浴3-5min， 12000r/min，離心 5min，將上清轉(zhuǎn)移到另一管中，12000r/min鐘，離心5min，再將上清移到另一離心管中。加入 2-2.5倍體積的無水乙醇，混勻，冰浴(或-20。C)放置30min。 12000r/min,離心5min，收集質(zhì) 粒DNA沉淀。用70%乙醇洗滌沉淀2-3次，棄去殘液，空氣中干燥10-20min，用20PL的雙蒸 水溶解沉淀。所獲得的pET-22b即可用作連接淀粉酶基因的載體。
(2)己糖激酶基因(glk)、磷酸甘露糖變位酶基因(manB)和甘露糖-l-磷酸鳥苷酰轉(zhuǎn)移酶基 因(manC)表達(dá)載體的構(gòu)建
①對(duì)載體pET-22b和glk，manB,manCPCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，然后電泳、切膠回收酶切后的 質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物，均選用50pL酶切體系<formula>formula see original document page 7</formula>上述酶切片段采用DNA純化試劑盒(TaKaBa公司)進(jìn)行純化，所獲得的線性純化pET-22b 和glk、 manB、 manC即可用來構(gòu)建重組質(zhì)粒。 ②載體和目的基因的連接 均選用lOiaL連接體系
solutionl 5|oL、 質(zhì)粒pET-22b lpL^10pL 14°C 15h
glk/manB/manC 4|xlJ 所得連接混合物采用DNA純化試劑盒(TaKaBa公司)進(jìn)行純化，純化后產(chǎn)物用于電轉(zhuǎn)化 法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。 3、基因工程菌株的構(gòu)建
按下述方法制備大腸桿菌BL21(DE3)的感受態(tài)細(xì)胞接大腸桿菌-BL21(DE3)斜面菌種接 種于5mLLB培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)2-3h，使細(xì)胞達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD6()()=0.6)，將三角瓶 轉(zhuǎn)移到冰上放置20min， 3000r/min， 4'C離心15min，收集細(xì)胞，用30(HiL、 10%的甘油懸浮細(xì) 胞，3000r/min， 4。C離心15min，此過程重復(fù)一次，最后將細(xì)胞懸浮在300nL、 10%的甘油中， 按每一份40pL分裝到預(yù)冷的離心管，然后放置-7(TC保存。
使用時(shí)將感受態(tài)細(xì)胞置于冰上融化，同時(shí)將電轉(zhuǎn)化杯也放在冰上冷卻。在一管40pL的感 受態(tài)中加入5juL上述連接產(chǎn)物，混勻后加入電轉(zhuǎn)化杯中，輕擊液體以確保細(xì)菌與DNA懸液位 于電轉(zhuǎn)化杯底部。打開電轉(zhuǎn)化儀，調(diào)整到Ecl檔，即專為大腸桿菌轉(zhuǎn)化設(shè)置的-檔，擦干電轉(zhuǎn) 化杯外面的冷凝水和霧氣，放進(jìn)電轉(zhuǎn)化儀中，按上述設(shè)定的檔，啟動(dòng)對(duì)細(xì)胞的電轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化結(jié)束后，盡可能快的取出電轉(zhuǎn)杯，加入lmLSOC培養(yǎng)液，混—?jiǎng)蚝筠D(zhuǎn)入f.'5mL離心管中，于37°C 培養(yǎng)lh。按每個(gè)平板100nL涂布到含氨芐青霉素(100叫/mL)的LA平板上，37'C倒置培養(yǎng)過 夜(16-20h)。從平板上挑取單一菌落，接種于液體LB培養(yǎng)基中，于37。C培養(yǎng)2-18 h，然后 小量提取質(zhì)粒DNA，用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切鑒定。重組質(zhì)粒結(jié)構(gòu)見圖2。
4、三株工程菌株的混合發(fā)酵合成GDP-甘露糖
將構(gòu)建好的BL21(DE3)/pET-22b-glk、 BL21(DE3)/pET-22b-manB禾口 BL21(DE3)/pET-22b-manC基因工程菌株分別在LB培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)菌體生長(zhǎng)量達(dá)到 OD6M=0.4~0.6時(shí)作為混合發(fā)酵合成GDP-甘露糖的準(zhǔn)備菌。
混合發(fā)酵合成GDP-甘露糖在250mL的搖瓶中30mL的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行的，其組成成分 為(g/L): BL21(DE3)/pET-22b-glk， 25 (菌體重量為濕重)；BL21(DE3)/pET-22b-manB, 15; BL21(DE3)/pET-22b-manC， 25;甘露糖，30;植酸，5; KH2P04， 25; MgS04.7H20， 5; ATP, 5; NymeenS-215， 4 (表面活性劑，增加細(xì)菌表面的滲透性)；反應(yīng)體系用4N的NaOH將pH 值維持在7.2，反應(yīng)在32'C， 900r/min的條件下進(jìn)行22 h。
反應(yīng)混合物在4。C下離心，4000r/min， 15min,除去菌體。取上清lOOpL與lOO)iL的(1-苯-3甲基-5吡唑啉酮)PMP/甲醇溶液(015mol/L)混合，7(TC下反應(yīng)30 min，取出后冷卻至 室溫，加入1.5mL純水，真空干燥，重復(fù)2次，干燥后的物質(zhì)用lmL純水及1 mL氯仿溶 解，充分振蕩后除去有機(jī)相，重復(fù)3次，水相溶液以13000r/min的速度高速離心2min后， 進(jìn)行HPLC分析。色譜條件為色譜柱為Waters Symmetry C18( 3.9 mm X 150mm X 5fiin)。 流動(dòng)相A是90% 0.1 mol /L醋酸銨(pH = 5.0) + 10%乙腈，流動(dòng)相B是75% 0.1 mol /L醋酸銨 (pH = 5.0) + 25%乙腈。采用梯度洗脫45% B流動(dòng)相55 min, 100%B流動(dòng)相，流速為1 mL /min， 柱溫為30'C，進(jìn)樣量10nL，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm。
外標(biāo)法計(jì)算GDP-甘露糖的產(chǎn)量為10mg/L， GDP-甘露糖的回歸方程
y=0.001+12.7x (R=0.9998)
三個(gè)基因工程菌株的混合發(fā)酵，通過改變細(xì)胞通透性使工程菌株的產(chǎn)物作用于甘露糖合成 GDP-甘露糖。SEQUENCE LISTING
<110>天津科技大學(xué)
<120>利用基因工程菌株耦合發(fā)酵合成GDP-甘露糖體系的構(gòu)建方法 <130> 2009-09-18 <160> 9
<170>PATENTIN VERSION 3.3
<210> 1
<211> 37
<212> DNA
<213> PGLK1
<400> 1
GGAATTCCAT ATGATGACAA AGTATGCATT AGTCGGT 37
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> PGLK2
<■> 2
CGCGGATCCT TACAGAATGT GACCTAAGGT CTG 33
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> PMANB1
<400> 3
GGAATTCCAT ATGATGAAAA AATTAACCTG CTTT 34
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> PMANB2
<400> 4CCCAAGCTTT TACTCGTTCA GCAACGTC 28
<210> 5
<211〉 36
<212〉 D腿
<213> PMANC1
<400> 5
CATGCCATGG ATATGACAAA GTATGCATTA GTCGGT 36
<210> 6
〈211> 33
〈212〉 DNA
<213> PMANC2
<糊〉6
CCCAAGCTTT TACAGAATGT GACCTAAGGT CTG 33
<210> 7
<211> 9"
<212> DNA
<213>己糖激酶(GLK)
<■> 7
ATGACAAAGT ATGCATTAGT CGGTGATGTG GGCGGCACCA ACGCACGTCT TGCTCTGTGT 60 GATATTGCCA GTGGTGAAAT CTCGCAGGCT AAGACCTATT CAGGGCTTGA TTACCCCAGC 120 CTCGAAGCGG TCATTCGCGT TTATCTTGAA GAACATAAGG TCGAGGTGAA AGACGGCTGT 180 ATTGCCATCG CTTGCCCAAT TACCGGTGAC TGGGTGGCGA TGACCAACCA TACCTGGGCG 24 0 TTCTCAATTG CCGAAATGAA AAAGAATCTC GGTTTTAGCC ATCTGGAAAT TATTAACGAT 300 TTTACCGCTG TATCGATGGC GATCCCGATG CTGAAAAAAG AGCATCTGAT TCAGTTTGGT 360 GGCGCAGAAC CGGTCGAAGG TAAGCCTATT GCGGTTTACG GTGCCGGAAC GGGGCTTGGG 420GTTGCGCATC TGGTCCATGT CGATAAGCGT TGGGTAAGCT TGCCAGGCGA AGGCGGTCAC 480
GTTGATTTTG CGCCGAATAG TGAAGAAGAG GCCATTATCC TCGAAATATT GCGTGCGGAA 540
ATTGGTCATG TTTCGGCGGA GCGCGTGCTT TCTGGCCCTG GGCTGGTGAA TTTGTATCGC 600
GCAATTGTGA AAGCTGACAA CCGCCTGCCA GAAAATCTCA AGCCAAAAGA TATTACCGAA 660
CGCGCGCTGG CTGACAGCTG CACCGATTGC CGCCGCGCAT TGTCGCTGTT TTGCGTCATT "7 20
ATGGGCCGTT TTGGCGGCAA TCTGGCGCTC AATCTCGGGA CATTTGGCGG CGTGTTTATT 780
GCGGGCGGTA TCGTGCCGCG CTTCCTTGAG TTCTTCAAAG CCTCCGGTTT CCGTGCCGCA 840
TTTGAAGATA AAGGGCGCTT TAAAGAATAT GTCCATGATA TTCCGGTGTA TCTCATCGTC 900
CATGACAATC CGGGCCTTCT CGGTTCCGGT GCACATTTAC GCCAGACCTT AGGTCACATT 960
CTGTAA <210> 8 <211> 1371 <212> DNA
<213>磷酸甘露糖變位酶(MANB) <■> 8
ATGAAAAAAT TAACCTGCTT TAAAGCCTAT
966
GATATTCGCG GGAAATTAGG CGAAGAACTG 60
AATGAAGATA TCGCCTGGCG CATTGGTCGC GCCTATGGCG AATTTCTCAA ACCGAAAACC 120
ATTGTGTTAG GCGGTGATGT CCGCCTCACC AGCGAAACCT TAAAACTGGC GCTGGCGAAA 180
GGTTTACAGG A-TGCGGGCGT TGAGGTGCTG GATATTGGTA -TGTGGGGCAC CGAAGAGATC 240TATTTCGCCA CGTTCCATCT CGGCGTGGAT GGCGGCATTG AAGTTACCGC CAGCCATAST
CCGATGGATT ATAACGGCAT GAAGCTGGTT CGCGAGGGGG CTCGCCCGAT CAGCGGAGAT
ACCGGACTGC GCGACGTCCA GCGTCTGGCT GAAGCCAACG ACTTTCCTCC CGTCGATGAA
ACCAAACGCG GTCGCTATCA GCAAATCAAC CTGCGTGACG CTTACGTTGA TCACCTGTTC
GGTTATATCA ATGTCAAAAA CCTCACGCCG CTCAAGCTGG TGATCAACTC CGGGAACGGC
GCAGCGGGTC CGGTGGTGGA CGCCATTGAA GCCCGCTTTA AAGCCCTCGG CGCGCCCGTG
GAATTAATCA AAGTGCACAA CACGCCGGAC GGCAATTTCC CCAACGGTAT TCCTAACCCA
CTACTGCCGG AATGCCGCGA CGACACCCGC AATGCGGTCA TCAAACACGG CGCGGATATG
GGCATTGCTT TTGATGGCGA TTTTGACCGC TGTTTCCTGT TTGACGAAAA AGGGCAGTTT
ATTGAGGGCT ACTACATTGT CGGCCTGTTG GCAGAAGCAT TCCTCGAAAA AAATCCCGGC
GCGAAGATCA TCCACGATCC ACGTCTCTCC TGGAACACCG TTGATGTGGT GACTGCCGCA
GGTGGCACGC CGGTAATGTC GAAAACCGGA CACGCCTTTA TTAAAGAACG TATGCGCAAG
GAAGACGCCA TCTATGGTGG CGAAATGAGC GCCCACCATT ACTTCCGTGA TTTCGCTTAC
TGCGACAGCG GCATGATCCC GTGGCTGCTG GTCGCCGAAC TGGTGTGCCT GAAAGATAAA
ACGCTGGGCG AACTGGTACG CGACCGGATG GCGGCGTTTC CGGCAAGCGG TGAGATCAAC
AGCAAACTGG CGCAACCCGT TGAGGCGATT AACCGCGTGG AACAGCATTT TAGCCGTGAG
300
360
420
徹
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
12GCGCTGGCGG TGGATCGCAC CGATGGCATC AGCATGACCT TTGCCGACTG GCGCTTTAAC 丄260
CTGCGCACCT CCAATACCGA ACCGGTGGTG CGCCTGAATG TGGAATCGCG CGGTGATCTG 1320
CCGCTGATGG AAGCGCGAAC GCGAACTCTG CTGACGTTGC TGAACGAGTA A 1371 <210> 9 <211> 1437 <212> D隱
<213>甘露糖-l-磷酸鳥哲酰轉(zhuǎn)移酶(MANC) <400> 9
ATGGCGCAGT CGAAACTCTA TCCAGTTGTG ATGGCAGGTG GCTCCGGTAG CCGCTTATGG 60
CCGCTTTCCC GCGTACTTTA TCCCAAGCAG TTTTTATGCC TGAAAGGCGA TCTCACCATG 120
CTGCAAACCA CCATCTGCCG CCTGAACGGC GTGGAGTGCG AAAGCCCGGT GGTGATTTGC 180
AATGAGCAGC ACCGCTTTAT TGTCGCGGAA CAGCTGCGTC AACTGAACAA ACTTACCGAG 24 0
AACATTMTC TCGAACCGGC AGGGCGAAAC ACGGCACCTG CCATTGCGCT GGCGGCGCTG 300
GCGGCAAAAC GTCATAGCCC GGAGAGCGAC CCGTTAATGC TGGTATTGGC GGCGGATCM1 ，
GTGATTGCCG ATGAAGACGC GTTCCGTGCC GCCGTGCGTA ATGCCATGCC ATATGCCGAA 420
GCGGGCAAGC TGGTGACCTT CGGCATTGTG CCGGATCTAC CAGAAACCGG TTATGGCTAT 徹
ATTCGTCGCG GTGAAGTGTC TGCGGGTGAG CAGGATATGG TGGCCTTTGA AGTGGCGCAG 540
TTTGTCGAAA AACCGAATCT GGAAACCGCT CAGGCCTATG TGGCAAGCGG CGAATATTAC 600
TGGAACAGCG GTMGTTCCT GTTCCGCGCC GGACGCTATC TCGAAGAACT GAAAAAATAT 660CGCCCGGATA TCCTCGATGC CTGTGAAAAA GCGATGAGGCi CCGTCGATCC GGATCTCAAT 720
TTTATTCGCG TGGATGAAGA AGCGTTTCTC GCCTGCCCGG AAGAGTCGGT GGATTACGCG 780
GTCATGGAAC GTACGGCAGA TGCTGTTGTG GTGCCGATGG ATGCGGGCTG GAGCGATGTT 84 0
GGCTCCTGGT CTTCATTATG GGAGATCAGC GCCCACACCG CCGAGGGCAA CGTTTGCCAC 900
GGCGATGTGA TTAATCACAA AACTGAAAAC AGCTATGTGT ATGCTGAATC TGGCCTGGTC 960
ACCACCGTCG GGGTGAAAGA TCTGGTAGTG GTGCAGACCA AAGATGCGGT GCTGATTGCC 1020
GACCGTAACG CGGTACAGGA TGTGAAAAAA GTGGTCGAGC AGATCAAAGC CGATGGTCGC 1080
CATGAGCATC GGGTGCATCG CGAAGTGTAT CGTCCGTGGG GCAAATATGA CTCTATCGAC 114 0
GCGGGCGACC■GCTACCAGGT GAAACGCATC ACCGTGAAAC CGGGCGAGGG CTTGTCGGTA 1200
CAGATGCACC ATCACCGCGC GGAACACTGG GTGGTTGTCG CGGGAACGGC AAAAGTCACC 1260
ATTGATGGTG ATATCAAACT GCTTGGTGAA AACGAGTCCA 士TTATATTCC GCTGGGGGCG 1320
ACGCATTGCC TGGAAAACCC GGGGAAAATT CCGCTCGATT TAATTGAAGT GCGCTCCGGC 1380
TCTTATCTCG AAGAGGATGA TGTGGTGCGT TTCGCGGATC GCTACGGACG GGTGTAA 143權(quán)利要求
1、一種利用基因工程菌株耦合發(fā)酵合成GDP-甘露糖體系的構(gòu)建方法，其特征在于構(gòu)建方法包括以下步驟(1)基因擴(kuò)增根據(jù)大腸桿菌K-12基因組中己糖激酶基因glk、磷酸甘露糖變位酶基因manB和甘露糖-1-磷酸鳥苷酰轉(zhuǎn)移酶基因manC的序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增出大腸桿菌中的三個(gè)酶基因序列；(2)重組質(zhì)粒的構(gòu)建用酶切連接的方法分別將上述三種目的基因與載體pET-22b相連，得到攜帶酶基因的重組表達(dá)載體，并進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證；(3)基因工程菌株的構(gòu)建將上述驗(yàn)證正確的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入宿主菌株BL21(DE3)中，得到含有重組質(zhì)粒的三種基因工程菌株；(4)混合發(fā)酵合成GDP-甘露糖三個(gè)基因工程菌株的混合發(fā)酵，通過改變細(xì)胞通透性使工程菌株的產(chǎn)物作用于甘露糖合成GDP-甘露糖。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用基因工程菌株耦合發(fā)酵合成GDP-甘露糖體系的構(gòu)建方法，其特征在于所述步驟(3)的三種基因工程菌株分別為BL21(DE3)/pET-22b-glk、BL21(DE3)/pET-22b-manB和BL21(DE3)/pET-22b-manC。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用基因工程菌株耦合發(fā)酵合成GDP-甘露糖體系的構(gòu)建方法，其特征在于所述歩驟(4)混合發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分為g/L: BL21(DE3)/pET-22b-gL濕重25; BL21(DE3)/pET-22b-manB濕重15; BL21(DE3)/pET-22b-manC濕重25;甘露糖30;植酸5; KH2P04 25; MgS04.7H20 5; ATP 5; NymeenS-215 4。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用基因工程菌株耦合發(fā)酵合成GDP-甘露糖體系的構(gòu)建方法，是利用基因工程技術(shù)構(gòu)建代謝工程菌株實(shí)現(xiàn)代謝途徑中各種酶的高效表達(dá)，進(jìn)而達(dá)到GDP-甘露糖的大量合成，打破大量獲得巖藻糖基化寡糖較難的瓶頸，為進(jìn)一步批量生產(chǎn)人乳寡糖提供有效的途徑，為天然寡糖藥物的生產(chǎn)提供了原料，符合當(dāng)前生物藥物領(lǐng)域發(fā)展趨勢(shì)，不僅具有較強(qiáng)的基礎(chǔ)理論研究?jī)r(jià)值，而且具有巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益，市場(chǎng)開發(fā)前景廣闊。
文檔編號(hào)C12P19/32GK101671692SQ200910070580
公開日2010年3月17日 申請(qǐng)日期2009年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月25日
發(fā)明者孔董俊, 玉 李, 王春霞, 路福平 申請(qǐng)人:天津科技大學(xué)