一株高效表達(dá)2[4Fe4S]鐵氧還蛋白的重組大腸桿菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因重組工程菌及其應(yīng)用，尤其涉及一種高效表達(dá)2[4Fe4S]鐵氧還 蛋白的重組大腸桿菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 鐵氧還蛋白是一類含鐵硫簇的酸性蛋白，其中的鐵硫簇又主要分為[4Fe4S]、 [2Fe2S]、[3Fe4S]等類型。鐵氧還蛋白作為一種常見的電子載體，參與呼吸作用、光合作用、 發(fā)酵等重要代謝過程。目前，商業(yè)上出售的只有來自菠菜的[2Fe2S]型鐵氧還蛋白，然而因 物種差異，該鐵氧還蛋白在分析來自其他物種的酶的時候表現(xiàn)出不同的效率，且該蛋白價 格非常昂貴，這在很大程度上限制了鐵氧化還原蛋白的應(yīng)用和科學(xué)家對鐵氧還蛋白相關(guān)的 酶和代謝過程的研究。
[0003] 在已有的文獻(xiàn)報道中，大部分鐵氧還蛋白是從野生細(xì)菌等生物體中純化獲得的， 也有通過異源表達(dá)來制備，但這些方法具有很多不足，比如消耗大量的時間，純化步驟繁 瑣，表達(dá)量低，鐵氧還蛋白的鐵硫簇組裝不完整而活力較低，最終產(chǎn)量和純度較低等。基于 此，研究和開發(fā)能夠高效表達(dá)2 [4Fe4S]鐵氧還蛋白的方法成為目前亟待解決的課題，經(jīng)檢 索，有關(guān)能夠高效表達(dá)2[4Fe4S]鐵氧還蛋白的重組大腸桿菌及其在發(fā)酵生產(chǎn)2[4Fe4S]鐵 氧還蛋白中的應(yīng)用還未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種高效表達(dá)2 [4Fe4S]鐵氧還蛋白 的重組大腸桿菌及其應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明所述的高效表達(dá)2[4Fe4S]鐵氧還蛋白的重組大腸桿菌，其特征在 于，所述重組大腸桿菌命名為大腸桿菌（Escherichiacoli)pCodonPlus/pRKISC/ pETDuet-2[4Fe4S]Fd，該菌株含有2[4Fe4S]鐵氧還蛋白基因，其核苷酸序列如SEQIDNO. 1 所示；所述重組大腸桿菌是將2[4Fe4S]鐵氧還蛋白基因連接入pETDuet-1載體，制得重組 質(zhì)粒命名為pETDuet-2 [4Fe4S]，并將制得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入含有pCodonPlus和pRKISC質(zhì)粒 的E.coliC41(DE3)中獲得。
[0006] 上述的高效表達(dá)2[4Fe4S]鐵氧還蛋白的重組大腸桿菌中，所述2[4Fe4S]鐵氧還 蛋白基因優(yōu)選來源于巴斯德梭菌（Clostridiumpasteurianum)DSM525〇
[0007] 本發(fā)明所述高效表達(dá)2[4Fe4S]鐵氧還蛋白的重組大腸桿菌在發(fā)酵生產(chǎn)2[4Fe4S] 鐵氧還蛋白中的應(yīng)用。
[0008] 其中，所述重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)2 [4Fe4S]鐵氧還蛋白的方法是：
[0009] (1)將重組大腸桿菌菌株以體積比1~5%的接種量接種到含有抗生素和鐵硫源 的TB培養(yǎng)基中，在37± 1°C和180± 10rpm轉(zhuǎn)速條件下培養(yǎng)2~3小時至0D62(]nni為0. 4~ 0.6,獲得菌液；
[0010] 其中，上述TB培養(yǎng)基的配方及組分終濃度是：Tryptone12g/L，Yeastextract 24g/L，Glycerol4ml/L，ΚΗ2Ρ042· 3g/L，Κ2ΗΡ0412· 5g/L;
[0011] 上述抗生素分別是終濃度為25μg/ml的氯霉素，終濃度為10μg/ml的四環(huán)素，終 濃度為100μg/ml的氨芐青霉素；
[0012] 上述鐵硫源配方及組分終濃度是：檸檬酸鐵銨0.2-0. 3g/L，L-半胱氨酸 0· 1-0. 2g/L，檸檬酸鐵 0· 18-0. 3g/L，F(xiàn)eS04 · 7H20 0· 25-0. 4g/L;
[0013] (2)向制得的菌液中加入終濃度為0· 5mM的IPTG，在16~37°C和180±10rpm轉(zhuǎn) 速下誘導(dǎo)2. 5~24小時，收集培養(yǎng)液離心，獲得含2 [4Fe4S]鐵氧還蛋白的重組大腸桿菌細(xì) 胞；
[0014] (3)破碎細(xì)胞，分離純化制備2 [4Fe4S]鐵氧還蛋白。
[0015] 上述的應(yīng)用中，步驟（2)所述IPTG優(yōu)選在35~37°C和180rpm轉(zhuǎn)速下誘導(dǎo)10~ 20小時。
[0016] 步驟（3)中破碎細(xì)胞的方法是：將離心后獲得的含2 [4Fe4S]鐵氧還蛋白的重 組大腸桿菌細(xì)胞用含10%甘油的緩沖液A重懸后，采用超聲波破碎儀器進(jìn)行細(xì)胞破碎， 12, 000轉(zhuǎn)/分鐘離心30min，取上清液用0. 22um孔徑濾膜過濾，即獲得含有組氨酸標(biāo)簽的 2[4Fe4S]鐵氧還蛋白粗酶液。
[0017] 步驟（3)中分離純化制備2 [4Fe4S]鐵氧還蛋白的方法是：
[0018] 鎳柱純化：將制得含有組氨酸標(biāo)簽的2[4Fe4S]鐵氧還蛋白粗酶液，經(jīng)過上樣柱進(jìn) 入鎳柱中，上樣速度為2ml/min。上樣結(jié)束，用緩沖液A沖洗鎳柱，去除雜蛋白。再用緩沖液 A和B按一定比例混合，進(jìn)行梯度洗脫，收集目的蛋白。純化完成后將鎳柱保存在20%的乙 醇中。
[0019] 洗脫出來的蛋白用濃縮管進(jìn)行濃縮，并用洗滌緩沖液洗滌蛋白，SDS-PAGE觀察蛋 白的大小及純度，用考馬斯亮藍(lán)法測蛋白含量，用分光光度計對蛋白進(jìn)行全波長掃描。
[0020] 最后得到純化好的蛋白在厭氧條件下低溫儲存。
[0021] 活性測定：分別用氫化酶和NfnAB兩種酶測定純化出來的鐵氧還蛋白的活性。
[0022] 上述緩沖液A的配方是：磷酸鈉20mM，NaCl0. 5M，pH7. 4。
[0023] 上述緩沖液B的配方是：磷酸鈉20mM，NaCl(λ5M，咪唑500mM，pH7· 4。
[0024] 上述步驟所有操作過程均在厭氧操作箱中進(jìn)行，所有溶液均進(jìn)行煮沸后脫氣厭氧 處理。
[0025] 本發(fā)明成功構(gòu)建了能夠表達(dá)帶有組氨酸標(biāo)簽的2[4Fe4S]鐵氧還蛋白的重組大腸 桿菌，它的應(yīng)用就是大家熟悉的大腸桿菌中異源表達(dá)的方法，不需要大量培養(yǎng)產(chǎn)鐵氧還蛋 白的野生菌，節(jié)省了大量的時間，節(jié)約了成本。本發(fā)明的重組大腸桿菌種含有的pCodonPlus 與pRKISC質(zhì)粒和誘導(dǎo)時加入的鐵硫源促進(jìn)了蛋白上鐵硫簇的合成，活力強(qiáng)表達(dá)量高，使 2[4Fe4S]鐵氧還蛋白最終產(chǎn)量顯著提升。實(shí)驗(yàn)證實(shí)：通過SDS-PAGE觀察蛋白純度較好， 大小與預(yù)期的相符；每升培養(yǎng)物最終可以獲得3. 7mg純化后的2 [4Fe4S]鐵氧還蛋白，遠(yuǎn)大 于從野生菌中純化出來的0. 5mg的產(chǎn)量；蛋白進(jìn)行全波長掃描后在390nm處有特征吸收峰 (見圖1)，其A390/A280比值為0. 71，與野生菌中純化出來蛋白的0. 76比值接近，說明鐵硫 簇構(gòu)建比較完整，獲得的融合標(biāo)簽的鐵氧還蛋白具有與野生蛋白相同的活性。活性檢測中 分別測得氫化酶的比活為22. 6± 1. 3U/mg，NfnAB的比活為19. 5± 1. 5U/mg與文獻(xiàn)中報道的 接近。預(yù)示本發(fā)明提供的重組大腸桿菌在工業(yè)化生產(chǎn)中具有很好的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0026] 圖1 :為本發(fā)明所述重組大腸桿菌表達(dá)的帶有組氨酸標(biāo)簽的2[4Fe4S]鐵氧還蛋白 全波長掃描圖。
[0027] 其中：在390nm處顯示有特征吸收峰。
[0028] 圖2 :為本發(fā)明所述重組大腸桿菌表達(dá)的帶有組氨酸標(biāo)簽的2[4Fe4S]鐵氧還蛋白 SDS-PAGE電泳圖。
[0029] 其中，Μ表不蛋白marker，1表不目的蛋白在大腸桿菌中異源表達(dá)后的粗酶液，2表 不純化后的2[4Fe4S]鐵氧還蛋白。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 下面結(jié)合實(shí)施例對本
【發(fā)明內(nèi)容】
作進(jìn)一步闡述。
[0031] 本發(fā)明中所用菌株、材料及來源說明：
[0032] 含pCodonPlus和pRKISC質(zhì)粒的E.coliC41 (DE3)細(xì)胞由Dr.Yasuhiro Takahashi(大阪大學(xué)）構(gòu)建和提供，其中pCodonPlus和E.coliC41 (DE3)分別來自 Stratagene公司和Lucigen公司。巴斯德梭菌（Clostridiumpasteurianum)DSM525 購自 德國微生物菌種保藏中心。
[0033] 質(zhì)粒小提試劑盒、DNA純化回收試劑盒、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化 科技（北京）有限公司。QIAampDNAMini試劑盒、MinElutePCR純化試劑盒購自Qiagen 公司。Wizard基因組DNA純化試劑盒購自Promega公司。pETDuet-1載體購自Novagen公 司。高保真FastPfuDNA聚合酶購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。pEASY-Blunt克隆載體 購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。E.coliMach1-T1細(xì)胞購自Invitrogen公司。內(nèi)切 酶、T4DNA連接酶購自Thermo公司。采用的鎳柱為HisTrapHPColumn，購自GEHealthcare 公司。
[0034] 實(shí)施例1 :高效表達(dá)C.pasteurianumDSM525中的2[4Fe4S]型鐵氧還蛋白的重 組大腸桿菌的構(gòu)建
[0035] 取C.pasteurianumDSM525細(xì)胞，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒推薦 方法，從C.pasteurianumDSM525細(xì)胞中提取基因組DNA。根據(jù)已知的巴斯德梭菌 (C.pasteurianum)DSM525基因組中2[4Fe4S]型鐵氧還蛋白基因序列如SEQIDN0.1所 示，設(shè)計引物如下：
[0036] F引物：5,CGCGGATCCGATGGCATATAAAATCGCTGA3'
[0037] R引物：5,CCCAAGCTTTTATTCTTGTACTGGTGCTCC3'
[0038] 以提取的C.pasteurianumDSM525基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得 2[4Fe4S]型鐵氧還蛋白基因。PCR反應(yīng)體系如下：
[0039]
[0040]
[0041] PCR反應(yīng)條件為：
[0042] 95 °C 5min
[0043] 95°C30s，55°C30s，72°C30s30 個循環(huán)
[0044] 72°ClOmin
[0045] 4。。保溫
[0046] PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳初步確認(rèn)正確后，用DNA純化回收試劑盒純化。將純化 的PCR產(chǎn)物與pETDuet-Ι載體分別用BamHI和Hindlll在37°C酶切20分鐘，酶切體系如 下：
[0047]
[0048] 用DNA純化回收試劑盒回收后進(jìn)行連接，連接