人血清白蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的高效表達(dá)的制作方法【專利摘要】本發(fā)明涉及以重組DNA技術(shù)生產(chǎn)人血清白蛋白的方法，特別是涉及合成的適合哺乳細(xì)胞表達(dá)的密碼子組成的人血清白蛋白基因，攜帶所說的基因的重組表達(dá)載體和用所說的載體轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，以可分泌形式生產(chǎn)人血清白蛋白的方法。本發(fā)明的方法特征在于人血清白蛋白結(jié)構(gòu)基因在所說的哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)一次轉(zhuǎn)化獲得穩(wěn)定的高水平表達(dá)，9pcd(皮克每細(xì)胞每天)。并且人血清白蛋白表達(dá)產(chǎn)物將分泌到發(fā)酵液培養(yǎng)基內(nèi)，利于工業(yè)規(guī)模的分離和下游加工?！緦＠f明】人血清白蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的高效表達(dá)
技術(shù)領(lǐng)域：
[0001]本發(fā)明涉及以重組DNA技術(shù)生產(chǎn)人血清白蛋白的方法，特別是涉及合成的適合哺乳細(xì)胞表達(dá)的密碼子組成的人血清白蛋白基因，攜帶所說的基因的重組表達(dá)載體和用所說的載體轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，以可分泌形式生產(chǎn)人血清白蛋白的方法?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]人血清白蛋白是單鏈非糖基化蛋白質(zhì)，由585氨基酸組成，分子量為66000道爾頓，等電點(diǎn)為4.7。它以前原蛋白質(zhì)的形式在肝細(xì)胞中產(chǎn)生，并由細(xì)胞加工去除前原序列和信號(hào)肽后得以分泌。成熟的血清白蛋白分子呈橢圓形，并含有多個(gè)二硫鍵。人血清白蛋白在循環(huán)血液中可達(dá)42克每升，是血清中最豐富的蛋白。人體每天分解代謝消耗約14克，在正常情況下，肝細(xì)胞每天合成補(bǔ)充相同量的血清白蛋白使人體總HSA量保持動(dòng)態(tài)平衡。HSA分子在人體內(nèi)的半衰期為19天，平均壽命27天。[0003]人血清白蛋白是由人類血漿提取的一類血液制劑藥品，是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)用于預(yù)防和治療的不可缺少的藥品。人血清白蛋白具有維持血漿滲透壓，調(diào)節(jié)血壓，營(yíng)養(yǎng)和促進(jìn)傷口愈合的作用。其作為血液中的載體物質(zhì)，參與多種生物分子如激素，氨基酸，膽色素和生物活性物質(zhì)及藥物等在血液中的運(yùn)輸。因此，人的血漿中提取的人血清白蛋白，在臨床上主要用于治療因失血、燒傷、燙傷、整形外科手術(shù)及腦損傷引起的低蛋白血癥以及急性胃腸出血、肝硬化、腎水腫和合并水腫等病癥。同時(shí)，人血白蛋白還是生物藥物和疫苗的必不可少的保護(hù)劑和賦形劑。因而，臨床應(yīng)用廣泛，需求量非常大。[0004]目前臨床上使用的HSA主要來自于分離和純化獻(xiàn)血者的血液或胎盤組織，價(jià)格相對(duì)便宜。但是傳統(tǒng)血液HSA-方面受社會(huì)、經(jīng)濟(jì)和政治因素的制約，不能隨意開發(fā)，另一方面由于血液難免被各種病原微生物的感染，如：愛滋病毒、乙肝病毒、丙肝病毒等，使得血液制品的用藥安全成為國(guó)際社會(huì)關(guān)注的突出問題。這樣，使用現(xiàn)代生物技術(shù)研發(fā)和大規(guī)模生產(chǎn)人血清白蛋白，不僅能擺脫對(duì)人血源的依賴，而且能絕對(duì)避免病原微生物的污染、保證人血清白蛋白的用藥安全。[0005]人們嘗試用不同的表達(dá)系統(tǒng)以重組DNA技術(shù)大批量生產(chǎn)HSA。由于HSA分子量大，結(jié)構(gòu)相對(duì)復(fù)雜，所以用原核大腸桿菌和枯草芽孢桿菌等原核表達(dá)系統(tǒng)或酵母等真核表達(dá)系統(tǒng)難以得到正確折疊的表達(dá)產(chǎn)物。例如在細(xì)菌中表達(dá)HSA將產(chǎn)生不溶的多聚體，需要重新加工而形成成熟的可溶性蛋白。HSA還于酵母中表達(dá)，產(chǎn)率很低并有相當(dāng)一部分HSA已裂解，粘附在細(xì)胞上和不溶解（Sleepetal.1990，biotechnology8:42-46;Etcheverryetal.1986，Biotechnology4:729-730;Quirketal.1989，BiotechandAppliedBiochem.11:273-287)。另外，這些表達(dá)系統(tǒng)所產(chǎn)生的HSA往往存在難以去除的菌體毒素及其他異源蛋白質(zhì)污染物，所以很難得到大量的適合臨床使用的HSA產(chǎn)品。使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞如CH0或C0S細(xì)胞及昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，能產(chǎn)生有正確空間構(gòu)象的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。[0006]1981年Genentech公司率先從人肝臟中克隆出了全長(zhǎng)HSAcDNA。成熟的HSA蛋白質(zhì)由585個(gè)氨基酸組成。成熟蛋白前面（氨基端）還有一prepro序列。preHSA含18個(gè)氨基酸，呈疏水性。proHSA含6個(gè)氨基酸，呈堿性。proHSA末端是Arg-Arg堿性氨基酸并能被內(nèi)胎酶識(shí)別加工。Genentech公司研究人員首先將HSA成功地在大腸桿菌胞內(nèi)表達(dá)（Lawnetal，1981，NucleicAcidsRes.9:6103-6114)。哈佛大學(xué)Gilbert等用小鼠白蛋白cDNA探針從人胎肝臟中雜交分離出人血清白蛋白cDNA，并在大腸桿菌中成功地獲得分泌表達(dá)（PhilippBWandGilbertW，1982,JCellBiochem.Suppl6:337-346)。但是應(yīng)用大腸桿菌表達(dá)HSA容易形成折疊錯(cuò)誤及構(gòu)象有別于天然分子的重組白蛋白，表達(dá)量也低，一般在每升毫克水平，難以產(chǎn)業(yè)化（LattaMetal.1987,Bio/Technology5:1309-1314)。因而有研究人員進(jìn)而應(yīng)用低等真核生物酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)HSA。英國(guó)的Delta生物技術(shù)公司，匈牙利科學(xué)院遺傳學(xué)研究所和日本綠十字公司等研究小組成功地應(yīng)用釀酒酵母（SaccharomycesCerevisiae)表達(dá)系統(tǒng)分泌表達(dá)HSA，并達(dá)每升幾毫克到一百毫克水平（SleepDetal，1990，Bio/Technology8:42-46;KalmanMetal.1990，NucleicAcidsRes.18:6075-6081;0kabayashiK.etal，1991，J.Biochem110:103-110)。次年，HSA在乳酸克魯維酵母（KluyveromycesLactis)中分泌表達(dá)達(dá)每升幾百毫克水平，用高密度發(fā)酵技術(shù)更可提升產(chǎn)量到每升1-2克水平（FleerR.etal，1991，Bio/Technology9:968-975)。多形漢遜酵母（HansenulaPolymorpha)也可用高密度發(fā)酵技術(shù)分泌表達(dá)1-2克每升的HSA。應(yīng)用巴斯德畢赤酵母（pichiapastoris)表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行高密度二相發(fā)酵和誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)量更可高達(dá)每升2-4克（BarrKAetal·1992，ProtocolforefficientsecretionofHSAdevelopedfromPichiaPastoris.PharmEng.12:48-51)。九十年代以后，隨著轉(zhuǎn)基因植物和動(dòng)物技術(shù)的成熟，HSA也被在馬鈴薯（Solanumtuberosum)和煙草（Nicotianatabacum)中表達(dá)（HoekemaA.etal·1990，JCellBiochem.Suppl.14E:333;SijmonsPCetal·1990,BiotechnologyNY8:217-221)。HSA還在轉(zhuǎn)基因小鼠的乳汁中成功表達(dá)。表達(dá)量達(dá)到〇.3mg/ml(ShaniMetal·1992，TransgenicRes.1:195-208;BarashIetal·1994，TransgenicRes.3:141-1551;BarashIetal·1996，NucleicAcidsRes.24：602-610；HurwitzDRetal.1994,TransgenicRes3:365-375)〇【
發(fā)明內(nèi)容】[0007]本發(fā)明提供了適合哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的由優(yōu)化密碼子組成的合成的編碼人血清白蛋白的核昔酸序列及其功能等同物。[0008]根據(jù)本發(fā)明這一目的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中對(duì)所說的HSA編碼序列進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，使其具有SEQIDNO1所示的核苷酸序列。[0009]本發(fā)明的另一個(gè)目的是分泌表達(dá)HSA，其中提供了一個(gè)特殊的分泌肽核苷酸序列并將其融合的到HSA的5'端。[0010]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供包含上述HSA編碼序列的重組表達(dá)載體。[0011]根據(jù)本發(fā)明這一目的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中對(duì)所說的重組表達(dá)載體包括一個(gè)或多個(gè)由⑴CMV的啟動(dòng)子區(qū)域，⑵編碼信號(hào)肽和HSA的核苷酸序列，⑶SV40轉(zhuǎn)錄終止子，(4)原核可選擇標(biāo)志基因（Amp抗性）和細(xì)菌復(fù)制原點(diǎn)（Oric)，（5)真核可選擇標(biāo)志基因(Zeo抗性）。[0012]本發(fā)明的再一目的是提供用上述攜帶HSA編碼序列的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。[0013]根據(jù)本發(fā)明這一目的的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的哺乳動(dòng)物細(xì)胞是中國(guó)倉(cāng)鼠卵細(xì)胞。[0014]根據(jù)本發(fā)明這一目的的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的中國(guó)倉(cāng)鼠卵細(xì)胞帶有LmElA.32(pgt)轉(zhuǎn)基因，以增強(qiáng)啟動(dòng)子功效。[0015]根據(jù)本發(fā)明這一目的的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的哺乳動(dòng)物細(xì)胞是CHO,C0S，HeLa，PerC6,NS01，SP1等細(xì)胞。[0016]本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供以DNA重組技術(shù)生產(chǎn)人血清白蛋白的方法，該方法包括在適于表達(dá)所需的蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)按上述方法制備的包含編碼人血清白蛋白的核苷酸序列的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，然后從培養(yǎng)物中回收并純化所需的人血清白蛋白。[0017]為了便于將本發(fā)明的合成的HSA基因連接到個(gè)不同的克隆載體或表達(dá)載體上，我們?cè)谄?'和3'端分別加入兩個(gè)單一酶切位點(diǎn)，其中Nhel和Xhol切點(diǎn)用于連接表達(dá)載體。另外，為了確保酶切位點(diǎn)的有效利用，我們將合成的HSA基因克隆進(jìn)pBlueScript質(zhì)粒以便酶切回收。為了便于將合成的HSA基因連接到信號(hào)肽的C末端上，在該基因的N末端加入了氨基酸序列AlaSer作為信號(hào)肽識(shí)別和切割位點(diǎn)。（HSA的C末端帶有終止密碼子TAA序列，以確保mRNA轉(zhuǎn)譯的正確終止。）上述這些修飾導(dǎo)致本發(fā)明合成的HSA基因序列總長(zhǎng)度為1821bp。[0018]用于表達(dá)本發(fā)明的HSA基因的表達(dá)載體可以是攜帶適用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)外源基因的表達(dá)調(diào)控元件，并可插入哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組的任何載體，例如pCl>neo(Promega)、pSecTagFRT/V5-His-T0P0(Invitrogen)和pOptivec-TOPO(Invitrogen)。本發(fā)明優(yōu)選的是pDirect載體（AntagenBiosciences)〇[0019]用于本發(fā)明的HSA是由化學(xué)全基因合成的，含有優(yōu)化的密碼子。此基因兩端分別帶有Nhel和Xhol酶切位點(diǎn)。HSA基因用Nhel和Xhol酶切出并插入pDirect載體的Nhel和Xhol酶切位點(diǎn)。信號(hào)肽為原pDirect載體自身帶有的從Mlul到Nhel位點(diǎn)之間的Secrecon序列。所形成的最終表達(dá)載體含有從5'起的CMV啟動(dòng)子，Secrecon信號(hào)肽，HSA編碼序列，SV40轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，Amp抗性基因，Oric，Zeo抗性基因?！靖綀D說明】[0020]圖1為本發(fā)明的真核可選擇標(biāo)志基因示意圖；[0021]圖2為本發(fā)明的鑒定HSA的實(shí)例示意圖?！揪唧w實(shí)施方式】[0022]為了使本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達(dá)成目的與功效易于明白了解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。[0023]實(shí)例介紹：[0024]1)詳細(xì)的HSA克隆過程[0025]實(shí)例1:HSA基因克隆和表達(dá)載體的構(gòu)建[0026]經(jīng)密碼子優(yōu)化的HSA基因的化學(xué)全合成服務(wù)購(gòu)自EpochBiolabs公司，并由該公司克隆進(jìn)pBlueScript載體，測(cè)序驗(yàn)證100%正確。然后，我們將帶有HSA基因的pBlueScript質(zhì)粒轉(zhuǎn)化T0P10化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞（Invitrogen)，取30ul涂布在含Amp的瓊脂糖平板上，37°C培養(yǎng)過夜。次日，挑單克隆菌落，接種到2ml含Amp的LB培養(yǎng)液，37°C培養(yǎng)過夜。次日，用Qiagen公司的試劑盒提取質(zhì)粒。用Nhel和Xhol酶酶切，走瓊脂糖凝膠電泳，從膠上回收1.7kb左右的HSA基因片斷，用T4連接酶（NewEnglandBiolabs)在16C連接過夜插入pDirect載體的Nhel和Xhol酶切位點(diǎn)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Stable3化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞（Invitrogen)，細(xì)菌全部涂布在含Amp的瓊脂糖平板上，37°C培養(yǎng)過夜。次日，挑單克隆菌落，接種到2ml含Amp的LB培養(yǎng)液，37°C培養(yǎng)過夜。再次日，用Qiagen公司的試劑盒提取質(zhì)粒。用Nhel和Xhol酶酶切鑒定含HSA基因片斷的細(xì)菌克隆。[0027]2)詳細(xì)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞過程[0028]實(shí)例2:HSA穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的建立[0029]轉(zhuǎn)化：采用逆轉(zhuǎn)化法將含有HSA的表達(dá)載體質(zhì)粒pDiect-HSA轉(zhuǎn)化進(jìn)CH0細(xì)胞中。具體實(shí)施如下：先將15ul脂質(zhì)轉(zhuǎn)化試劑（例如HiPerfect，QIAGEN)稀釋到250ul無血清培養(yǎng)基OptiMEM(Invitrogen)，室溫培養(yǎng)5分鐘。同時(shí)將2.5ug線性化的表達(dá)載體質(zhì)粒稀釋到250ul無血清培養(yǎng)基OptiMEM。將室溫培養(yǎng)好的脂質(zhì)轉(zhuǎn)化試劑加入到稀釋的DNA溶液中，再在室溫培養(yǎng)15-20分鐘。培養(yǎng)期間可消化處理細(xì)胞。將貼壁的CH0用0.025%的胰蛋白酶/0.01%EDTA溶液于37°C消化5分鐘。收集單細(xì)胞懸浮液，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。將40萬細(xì)胞懸浮在2.5ml的DMEM-10%小牛血清培養(yǎng)基中（不含抗生素），并轉(zhuǎn)移到一個(gè)6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。將經(jīng)過15-20分鐘培養(yǎng)的DNA/脂質(zhì)轉(zhuǎn)化試劑的混合物直接加入細(xì)胞中。并將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱培養(yǎng)24-48小時(shí)。[0030]克隆形成：將轉(zhuǎn)化好的細(xì)胞用0.025%的胰蛋白酶/0.01%EDTA溶液于37C消化5分鐘。于500xg離心力下將細(xì)胞離心下來，去除上清。將細(xì)胞懸浮在10ml新鮮DMEM-10%小牛血清培養(yǎng)基中（可含抗生素），并加入100-500ug/ml的Zeocin(Invitrogen)后，將細(xì)胞加入到96孔培養(yǎng)板中，每孔加100ul細(xì)胞懸浮液。將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱培養(yǎng)8-12天直到抗性克隆出現(xiàn)。[0031]有限稀釋克隆細(xì)胞株：將表達(dá)HSA的細(xì)胞從96孔中取出，經(jīng)過細(xì)胞計(jì)數(shù)，將100個(gè)細(xì)胞懸浮在l〇ml的新鮮培養(yǎng)基中，并將細(xì)胞加入到新的96孔培養(yǎng)板中。將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱培養(yǎng)8-12天直到細(xì)胞克隆出現(xiàn)。[0032]3)詳細(xì)的HSA定量過程[0033]實(shí)例3:檢測(cè)HSA的表達(dá)量[0034]細(xì)胞處理：將細(xì)胞于24孔或6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)至50-90%滿。用消毒過的磷酸鹽緩沖液洗一下細(xì)胞。然后加入適量的新鮮DMEM-10%小牛血清培養(yǎng)基。經(jīng)過24小時(shí)培養(yǎng)后，收集培養(yǎng)上清，同時(shí)用0.025%的胰蛋白酶/0.01%EDTA溶液于37°C消化細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。培養(yǎng)上清可直接用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定HSA的量。[0035]HSA標(biāo)準(zhǔn)溶液：將純化的人血清白蛋白凍干粉（Sigma-Aldrich)溶解在磷酸鹽緩沖液中。蛋白濃度用MicroBCA法（Pierce)測(cè)定。然后將HSA濃度用磷酸鹽緩沖液調(diào)整到lmg/ml，并加入NaN3防腐劑保護(hù)。[0036]酶聯(lián)免疫吸附法：在做此實(shí)驗(yàn)的前一天，將15C7抗HSA小鼠單克隆抗體用0.5MNaC03稀釋到5ug/ml，然后加50ul每孔到高吸附96孔板中（Nunc)，4°C包被過夜。然后板用含0.1%了￥661120的了83緩沖液〇^1')洗一次。每孔中再加入200-300111的含10%小牛血清的TBST的溶液在室溫封閉一小時(shí)。96孔板去除封閉液后用TBST洗三次，然后可加入待測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清或標(biāo)準(zhǔn)HSA溶液，每孔加50ul。HSA的標(biāo)準(zhǔn)溶液要先用封閉液稀釋到1000ng/ml，然后做1:2的序列稀釋。樣品可在37°C保溫培養(yǎng)2小時(shí)或4°C過夜培養(yǎng)。經(jīng)培養(yǎng)的樣品板用TBST液洗三次，然后加入50ul每孔的經(jīng)稀釋的檢查抗體1A9-HRP偶聯(lián)物。在37°C保溫培養(yǎng)1小時(shí)后，96孔板用TBST洗至少六次，每次十分鐘。然后每孔中加入lOOul的3,3,5,5-四甲基聯(lián)苯胺/TMB底物溶液。經(jīng)過室溫5-10分鐘，加入2N硫酸終止液。TMB底物顏色有藍(lán)變黃。經(jīng)96板讀板器讀取450nm吸收數(shù)據(jù)，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品曲線計(jì)算出樣品中的HSA含量。在根據(jù)總培養(yǎng)上清量和細(xì)胞總數(shù)計(jì)算出每個(gè)細(xì)胞每天可產(chǎn)出的皮克HSA。表1提供了一個(gè)測(cè)定pcd的實(shí)例。[0037]表1:細(xì)胞株的pcd測(cè)定[0040]4)詳細(xì)的細(xì)胞培養(yǎng)過程[0041]實(shí)例4:細(xì)胞株的擴(kuò)增[0042]經(jīng)過有限稀釋克隆好的細(xì)胞株，用上述HSA定量測(cè)定法測(cè)定出高產(chǎn)細(xì)胞株。然后將高表達(dá)HSA的細(xì)胞從96孔中取出，轉(zhuǎn)移至24孔培養(yǎng)板中擴(kuò)增培養(yǎng)2-7天。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80-90%覆蓋率后，轉(zhuǎn)移至6孔培養(yǎng)板中擴(kuò)增培養(yǎng)2-7天。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80-90%覆蓋率后，可進(jìn)行Η產(chǎn)量的測(cè)定，同時(shí)將剩余的細(xì)胞冷凍保藏于液氮中。[0043]5)HSA的定性鑒定[0044]實(shí)例5:HSA的定性鑒定[0045]正確表達(dá)的HSA可用Western免疫印記法測(cè)定。細(xì)胞先用0.025%的胰蛋白酶/0.01%EDTA溶液于37C消化，然后用磷酸鹽緩沖液洗一下細(xì)胞。細(xì)胞再經(jīng)蛋白裂解液(1%TritonX-100,50mMTris-HCl，150mMNaCl，蛋白酶抑制劑（Roche))裂解。經(jīng)過高速離心后，蛋白上清用MicroBCA(Pierce)定蛋白量。在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。100°C或沸水浴加熱3-5分鐘，以充分變性蛋白。把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)，進(jìn)行電泳。溴酚藍(lán)到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳。轉(zhuǎn)膜利用iBlot(lnvitrogen)，根據(jù)廠商的產(chǎn)品說明，將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙稀PVDF膜上（一般5-7分鐘）。轉(zhuǎn)膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預(yù)先準(zhǔn)備好的Western封閉液（5%脫脂奶粉），在搖床上緩慢搖動(dòng)，室溫封閉60分鐘。吸盡封閉液，立即加入稀釋好的一抗（例如1A9-HRP)，室溫或4°C在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育一小時(shí)。經(jīng)洗滌液洗滌5-10分鐘，共洗滌3次，可使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光法ECL類試劑來檢測(cè)蛋白信號(hào)，并用VersaDoc(Bio-Rad)暗箱記錄信號(hào)。圖2提供了一個(gè)鑒定HSA的實(shí)例。[0046]6)詳細(xì)的純化過程[0047]根據(jù)常規(guī)純化工藝進(jìn)行純化。[0048]以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征及本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)，本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)，本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定?！局鳈?quán)項(xiàng)】1.人血清白蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的高效表達(dá)，其特征在于，合成的適合哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的密碼子組成的人血清白蛋白的核苷酸序列及其功能等同物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人血清白蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的高效表達(dá)，其特征在于，核苷酸序列，于5'-端加入信號(hào)肽核苷酸序列。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人血清白蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的高效表達(dá)，其特征在于，其中對(duì)所說的人血清白蛋白編碼序列具有SEQIDNO1所示的核苷酸序列。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人血清白蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的高效表達(dá)，其特征在于，編碼具有SEQIDNO2所示的蛋白質(zhì)序列。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中的任意一項(xiàng)所述的人血清白蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的高效表達(dá)，其特征在于，包含編碼人血清白蛋白的核苷酸序列的適合哺乳動(dòng)物表達(dá)的重組表達(dá)載體。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人血清白蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的高效表達(dá)，其特征在于，其中包括一個(gè)或多個(gè)由（l)CMV的啟動(dòng)子區(qū)域，（2)編碼信號(hào)肽和HSA的核苷酸序列，（3)SV40轉(zhuǎn)錄終止子，（4)原核可選擇標(biāo)志基因（Amp抗性）和細(xì)菌復(fù)制原點(diǎn)（Oric)，（5)真核可選擇標(biāo)志基因（Zeo抗性）。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人血清白蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的高效表達(dá)，其特征在于，所述的改構(gòu)的人血清白蛋白基因片段表達(dá)盒的基因重組表達(dá)載體或質(zhì)粒為pDirect-HSA，或其他用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的載體，重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，哺乳動(dòng)物細(xì)胞為中國(guó)倉(cāng)鼠卵細(xì)胞；中國(guó)倉(cāng)鼠卵細(xì)胞具有LmElA.32(pgt)轉(zhuǎn)基因序列，以增強(qiáng)啟動(dòng)子功效。8.根據(jù)權(quán)利要求9所述的人血清白蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的高效表達(dá)，其特征在于，哺乳動(dòng)物細(xì)胞為CHO,COS，HeLa，PerC6,NS01，SP1細(xì)胞中的任何一種細(xì)胞。9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的人血清白蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的高效表達(dá)，其特征在于，用于本發(fā)明的HSA是由化學(xué)全基因合成的，含有優(yōu)化的密碼子，化學(xué)全基因兩端分別帶有Nhel和Xhol酶切位點(diǎn)。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人血清白蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的高效表達(dá)，其特征在于，本表達(dá)方法適用于自然界存在的任何信號(hào)肽序列?！疚臋n編號(hào)】C12N15/85GK105985981SQ201510059615【公開日】2016年10月5日【申請(qǐng)日】2015年2月5日【發(fā)明人】高聞達(dá),岳國(guó)華,楊海林【申請(qǐng)人】安泰吉（北京）生物技術(shù)有限公司