一種血清的制備方法與流程

本發(fā)明涉及體外診斷醫(yī)學(xué)檢驗領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及一種血清的制備方法。

背景技術(shù)：

血清是血液凝固析出的淡黃色透明液體。如將血液自血管內(nèi)抽出，放入試管中，不加抗凝劑，則凝血反應(yīng)被激活，血液迅速凝固，形成膠凍。凝血塊收縮，其周圍所析出之淡黃色透明液體即為血清，也可于凝血后經(jīng)離心取得。在凝血過程中，纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成纖維蛋白塊，所以血清中無纖維蛋白原，這一點(diǎn)是與血漿最大的區(qū)別。而在凝血反應(yīng)中，血小板釋放出許多物質(zhì)，各凝血因子也都發(fā)生了變化。這些成分都留在血清中并繼續(xù)發(fā)生變化，如凝血酶原變成凝血酶，并隨血清存放時間逐漸減少以至消失。這些也都是與血漿區(qū)別之處。但大量未參加凝血反應(yīng)的物質(zhì)則與血漿基本相同。為避免抗凝劑的干擾，血液中許多化學(xué)成分的分析，都以血清為樣品。

血漿的各種化學(xué)成分常在一定范圍內(nèi)不斷地變動，其中以葡萄糖、蛋白質(zhì)、脂肪和激素等的濃度最易受營養(yǎng)狀況和機(jī)體活動情況的影響，而無機(jī)鹽濃度的變動范圍較小。血清與血漿的區(qū)別，主要在于血清不含纖維蛋白原，纖維蛋白原能轉(zhuǎn)換成纖維蛋白，具有凝血作用。

在體外診斷試劑行業(yè)，血清和血漿是體外診斷試劑生產(chǎn)的初級及重要的原料之一，常用于校準(zhǔn)品、稀釋液的配制以及內(nèi)部參考品的建立。其中血清由于其清澈雜質(zhì)較少，干擾較小等因素，是兩者中的首選。但血清的獲取量較少，無法滿足大體積的需求。而血漿的供應(yīng)量雖大，但是干擾性較強(qiáng)，且大量的纖維蛋白容易有絮狀沉淀，會影響產(chǎn)品質(zhì)量。此外，本領(lǐng)域制備血清的方法往往存在得率低、操作繁瑣、仍存在纖維蛋白絮狀沉淀等缺點(diǎn)。

因此，本領(lǐng)域急需操作簡便，得率高，將血漿轉(zhuǎn)化為血清的制備方法，所得到的血清中纖維蛋白充分去除，并且對待測物影響較小。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種血清制備方法，該方法制備的血清的得率高，制備工藝簡單，易于重復(fù)，且對于待測物無影響，測值回收率好。

本發(fā)明的另一目的在于提供本發(fā)明方法所制得血清以及包含這種血清的檢測試劑盒。

在第一方面，本發(fā)明提供一種血清的制備方法，所述方法包括在血漿中添加經(jīng)氯化鈣激活的凝血酶溶液，從而制得血清。

在具體的實施方式中，所述方法包括以下步驟：

(1)將凍存血漿平衡至室溫，過濾；

(2)孵育后，在血漿中添加經(jīng)氯化鈣激活的凝血酶溶液，混勻；

(3)將處理后的血漿平衡至室溫，然后凍存；

(4)取出再次平衡至室溫，離心，過濾后，制得血清。

在優(yōu)選的實施方式中，步驟(3)中將處理后的血漿平衡至室溫，然后在-15℃以下保存。

在優(yōu)選的實施方式中，步驟(1)中的過濾是將平衡至室溫的血漿經(jīng)醫(yī)用紗布過濾，收集濾液。

在具體的實施方式中，步驟(2)所述的孵育是在37℃孵育15～60分鐘；優(yōu)選地，孵育為30分鐘。

在具體的實施方式中，所述凝血酶溶液的濃度為50～200U/mL；優(yōu)選地，濃度為75-125U/mL；最優(yōu)選地，濃度為100U/mL。

在具體的實施方式中，所述經(jīng)氯化鈣激活的凝血酶溶液是將1000U/mL凝血酶溶液和1M CaCl₂溶液按照1:4～1:19的比例混合，反應(yīng)30分鐘后制得；優(yōu)選地，將1000U/mL凝血酶溶液和1M CaCl₂溶液按照1:9的比例混合。

在具體的實施方式中，步驟(3)所述的處理后的血漿平衡至室溫的時間為60～180分鐘；優(yōu)選地，平衡時間為120分鐘。

在具體的實施方式中，步驟(4)中離心轉(zhuǎn)速為4000rpm，過濾孔徑為0.8μm。

在優(yōu)選的實施方式中，步驟(4)還包括在制得的血清中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1％的Proclin 300。

在優(yōu)選的實施方式中，所述制備方法制得的血清的得率達(dá)到80％以上，優(yōu)選85％以上，更優(yōu)選90％以上；總蛋白回收率達(dá)到93％以上，優(yōu)選95％以上，更優(yōu)選97％以上。

在第二方面，本發(fā)明提供一種血清，所述血清通過本發(fā)明第一方面所述的制備方法制備得到。

在優(yōu)選的實施方式中，所制備的血清的得率達(dá)到87％以上，優(yōu)選90％以上，更優(yōu)選93％以上；總蛋白回收率達(dá)到93％以上，優(yōu)選95％以上，更優(yōu)選97％以上。

在第三方面，本發(fā)明提供一種試劑盒，所述試劑盒裝有本發(fā)明第二方面所述的血清或本發(fā)明第一方面所述的制備方法制備的血清。

在優(yōu)選的實施方式中，所述血清用作檢測試劑盒中的校準(zhǔn)品、稀釋液、質(zhì)控品或內(nèi)部參考品。

在第四方面，本發(fā)明提供本發(fā)明第一方面所述的制備方法制備的血清或本發(fā)明第二方面所述的血清在制備檢測試劑盒中的用途。

在優(yōu)選的實施方式中，所述血清用作檢測試劑盒中的校準(zhǔn)品、稀釋液、質(zhì)控品或內(nèi)部參考品。

應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附圖說明

圖1顯示了通過本發(fā)明方法從不同血漿制備血清后，待測物的回收率、總蛋白濃度的比較。

具體實施方式

在研發(fā)實踐中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)直接采用血漿作為體外診斷試劑的校準(zhǔn)品、稀釋液及參考品時，其穩(wěn)定性不佳，且由于血漿中纖維蛋白的影響，往往形成絮狀沉淀，造成質(zhì)量問題；此外，直接采用血漿，其抗凝劑對待測物的測定形成干擾。而現(xiàn)有的制備血清的方法存在得率低、操作繁瑣、需要反復(fù)凍融等缺點(diǎn)，并且制得的血清中仍有纖維蛋白絮狀沉淀存在。發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，出乎意料地發(fā)現(xiàn)，在血漿中添加經(jīng)氯化鈣激活的凝血酶溶液并且控制凝血酶的用量，所制備的血清的得率較高，作為體外診斷試劑校準(zhǔn)品、稀釋液及參考品對后續(xù)檢測的干擾小，測值回收率好，并且該制備工藝簡單，易于重復(fù)，具有較大的工藝放大及推廣前景，能廣泛應(yīng)用于體外診斷領(lǐng)域。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。

本發(fā)明的血清的制備方法以及制備得到的血清

基于以上發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明首先提供一種血清的制備方法，所述方法通過在血漿中添加經(jīng)氯化鈣激活的凝血酶溶液而制得血清。

基于本發(fā)明的教導(dǎo)以及本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)手段，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以想到本發(fā)明的血清制備方法的各種具體實現(xiàn)方式。例如，可以將凍存血漿平衡至室溫，過濾，孵育后，在血漿中添加經(jīng)氯化鈣激活的凝血酶溶液，混勻；將處理后的血漿平衡至室溫，凍存；取出再次平衡至室溫，離心，過濾后，即制得所述血清。

在具體的實施方式中，本發(fā)明的血清制備方法包括以下步驟：

(1)將凍存血漿平衡至室溫，過濾；

(2)孵育后，在血漿中添加經(jīng)氯化鈣激活的凝血酶溶液，混勻；

(3)將處理后的血漿平衡至室溫，然后凍存，例如在；

(4)取出再次平衡至室溫，離心，過濾后，制得血清。

本領(lǐng)域技術(shù)人員可以基于本發(fā)明的教導(dǎo)以及本領(lǐng)域的常規(guī)要求確定本發(fā)明方法的一些細(xì)節(jié)。例如，步驟(1)的過濾是將平衡至室溫的血漿經(jīng)醫(yī)用紗布過濾，收集濾液；步驟(2)所述的孵育是在37℃孵育15～60分鐘；優(yōu)選地，孵育為30分鐘；步驟(3)中，可以將處理后的血漿平衡至室溫，然后在-15℃以下保存；

本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，凝血酶溶液的用量對于通過本發(fā)明方法獲得高質(zhì)量的血清也有影響。在具體的實施方式中，所述凝血酶溶液的濃度為50～200U/mL；優(yōu)選地，濃度為75-125U/mL；最優(yōu)選地，濃度為100U/mL。在優(yōu)選的實施方式中，所述經(jīng)氯化鈣激活的凝血酶溶液是將1000U/mL凝血酶溶液和1M CaCl₂溶液按照1:4～1:19的比例混合，反應(yīng)30分鐘后制得；優(yōu)選地，將1000U/mL凝血酶溶液和1M CaCl₂溶液按照1:9的比例混合。

在優(yōu)選的實施方式中，所述處理后的血漿平衡至室溫的時間為60～180分鐘；更優(yōu)選，平衡時間為120分鐘。

在優(yōu)選的實施方式中，所述步驟(4)中離心轉(zhuǎn)速為4000rpm，過濾孔徑為0.8μm。在另一優(yōu)選的實施方式中，所述步驟(4)還包括在制得的血清中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1％的Proclin 300。在另一優(yōu)選的實施方式中，所述步驟(4)還包括在制得血清后將其在2～8℃保存。

相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的血清制備方法能夠制備得到具備優(yōu)異特性的血清，例如，得率高，總蛋白回收率高等等。而具有如此優(yōu)異特性的血清是現(xiàn)有技術(shù)無法獲得的。在具體的實施方式中，本發(fā)明制備方法制得的血清的得率達(dá)到80％以上，優(yōu)選85％以上，更優(yōu)選90％以上；總蛋白回收率達(dá)到93％以上，優(yōu)選95％以上，更優(yōu)選97％以上。

本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，血清可以在試劑盒中用作校準(zhǔn)品、稀釋液、質(zhì)控品或內(nèi)部參考品。因此，本發(fā)明制備方法制得的血清的可以用于各種檢測試劑盒中，從而提高這些檢測試劑盒的性能。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)

1)本發(fā)明制備的血清的得率高，一般可達(dá)到80％以上；

2)本發(fā)明制備的血清，對待測物的測定無影響，且重復(fù)性好；

3)本發(fā)明制備的血清經(jīng)反復(fù)凍融后，依舊維持澄清透明，無絮狀沉淀析出；

4)本發(fā)明的血清制備方法的工藝重復(fù)性好，操作簡單。

下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量份數(shù)。

除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。

實施例

材料

血漿來自通化市紅十字會中心血站

凝血酶購自于Sigma，

二水氯化鈣購自于國藥試劑，

雙縮脲試劑盒購自于Sigma，

Proclin 300購自于Amersco。

實施例1.血清的制備

1)將凍存血漿200ml放置于室溫，使其完全融化，平衡至室溫；

2)將200ml血漿通過8層醫(yī)用紗布，記錄過濾體積V₁；

3)將14.7g的二水氯化鈣溶于純化水中，制得1M CaCl₂溶液；

4)在0.5mL 1000U/mL的凝血酶溶液中加入4.5mL 1M CaCl₂溶液，混勻，室溫反應(yīng)30分鐘，制得激活凝血酶溶液；

5)在V₁mL的血漿中按照1:100的比例加入0.01V₁mL激活凝血酶溶液，混勻，37℃孵育30分鐘；

6)將血漿置于室溫平衡120分鐘；

7)將平衡后的血漿置于-15℃以下保存至少48小時；

8)將血漿置于室溫平衡4小時，4000rpm離心30分鐘，取上清；

9)將上清液過0.8μm濾膜過濾，取濾液，過濾后的體積為V₂；

10)按照0.1％的體積比加入Proclin 300，混勻；

11)置于2～8℃保存，制得血清。

實施例2.所制得血清的物理性狀比較

利用實施例1所得的血清，對外觀進(jìn)行觀察，同時通過雙縮脲試劑盒測定制備前后的總蛋白含量，結(jié)果如下表所示：

從上表可以看出，本發(fā)明制得的血清，能夠去除纖維蛋白，使得液體澄清透明，無沉淀，其得率也達(dá)到了91.50％，液體損失較小。通過處理前后血漿和血清的蛋白含量的測定，其總蛋白含量的分別為75.68mg/mL和71.44mg/mL，兩者差異不大，其基本的物理性狀較為理想。

實施例3.血清制備工藝的重復(fù)性

利用實施例1所述的方法，對10份不同的血漿進(jìn)行處理，考察得率情況。同時通過雙縮脲試劑盒測定制備前后的總蛋白含量，乙型肝炎病毒表面抗體檢測試劑盒測定anti-HBs，評價其處理前后總蛋白和待測物回收率，結(jié)果如下表所示：

從上表可以看出，通過比較處理前后的10份不同血漿和血清的得率為87.63％～96.34％，總蛋白回收率為92.99％～97.93％，anti-HBs測值回收率93.00％～100.97％。從結(jié)果看，血清對于總蛋白含量及anti-HBs的測值無明顯影響，且制備平均得率達(dá)到了90％，效果良好。

實施例4.含有本發(fā)明血清的乙型肝炎病毒表面抗體試劑盒性能結(jié)果

1)最低檢測限：本試劑盒的最低檢測限不高于2mIU/mL。

測定空白樣本20次，計算20次測定結(jié)果均值(M)和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，M+2SD對應(yīng)的濃度即為試劑盒的最低檢測限。

2)準(zhǔn)確度：本試劑盒的回收率在85％～115％之間。

3)重復(fù)性：本試劑盒的相對變異系數(shù)(CV)≤8％。

4)線性范圍：本試劑盒的線性范圍為2～1000mIU/mL。

將接近線性范圍上限的高值樣本進(jìn)行系列稀釋，計算實測值與理論稀釋度之間的線性相關(guān)系數(shù)r，結(jié)果應(yīng)大于或等于0.9900。

5)批間差：本試劑盒批間的相對變異系數(shù)(CV)≤15％。

6)穩(wěn)定性：本試劑盒2～8℃保存12個月，試劑盒的性能仍穩(wěn)定。

實施例5.含有本發(fā)明血清的超敏感C-反應(yīng)蛋白定量測定試劑盒(免疫比濁法)性能結(jié)果

1)試劑空白：波長340nm左右處，試劑空白吸光度應(yīng)≤1.8A。

2)準(zhǔn)確度：測定結(jié)果在所使用質(zhì)控品的允許范圍內(nèi)。

3)精密度：：批內(nèi)變異系數(shù)cv≤10％；批間相對極差≤15％。

4)線性范圍：在樣本濃度1.0-10mg/l范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)r≥0.990。在樣本濃度1.0-5.0mg/l范圍內(nèi)，線性絕對偏差應(yīng)不超過±0.75mg/l。在樣本濃度5-10mg/l范圍內(nèi)，線性相對偏差應(yīng)不超過±15％。

5)分析靈敏度：測試濃度為(2.0±0.5)mg/L的樣本，將測試結(jié)果換算成濃度為2.0mg/L的樣本時，吸光度差值(△A)應(yīng)≥0.01A。

6)校準(zhǔn)品準(zhǔn)確度：用試劑盒內(nèi)待檢校準(zhǔn)品及上級工作校準(zhǔn)品分別校準(zhǔn)試劑，然后測定質(zhì)控品，兩者對同一質(zhì)控品的測定結(jié)果之間的相對偏差應(yīng)在±15％的范圍內(nèi)。

7)校準(zhǔn)品均一性：CV瓶間≤15％。

8)穩(wěn)定性：校準(zhǔn)品在2℃-8℃遮光儲存至有效期末，試劑盒的性能仍穩(wěn)定。

實施例6.含有本發(fā)明血清的心肌質(zhì)控品性能結(jié)果

1)外觀：塊狀凍干品，復(fù)溶后為澄明溶液。

2)準(zhǔn)確度：質(zhì)控品的檢測值在各項目的允許范圍內(nèi)。

3)均一性：質(zhì)控品瓶間CV≤5％。

4)復(fù)溶穩(wěn)定性：質(zhì)控品復(fù)溶后放置于2℃～8℃7天和-20℃1個月，質(zhì)控品靶值仍然穩(wěn)定。

5)效期穩(wěn)定性：質(zhì)控品2～8℃保存12個月，質(zhì)控品靶值仍然穩(wěn)定。

6)生物安全性：檢測質(zhì)控品中HBsAg、抗HIV1/2，抗HCV，抗TP，結(jié)果為陰性。

對比例1.

本發(fā)明人根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)方法，在血漿中直接加入氯化鈣來制得血清。對所制得的血清重復(fù)以上實施例2-3，結(jié)果如下表所示。

從以上結(jié)果可以看出，對比例的得率、測值回收率和總蛋白回收率均比實施例低。因此，現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)方法無法制得本發(fā)明的高質(zhì)量血清。

對比例2.

本發(fā)明人重復(fù)了實施例1，區(qū)別在于將凝血酶溶液直接加入血漿，然后再加入氯化鈣溶液。對所制得的血清重復(fù)以上實施例2-3，結(jié)果如下表所示。

從以上結(jié)果可以看出，對比例的得率、測值回收率和總蛋白回收率均比實施例低。

綜上所述，以上對比例證明，現(xiàn)有技術(shù)中直接向血漿中加入氯化鈣無法制得高質(zhì)量的血清；即便增加凝血酶的用量，依舊無法制得高質(zhì)量的血清。

在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。