重組TsPKA-C蛋白及其應用
【專利摘要】本發(fā)明提供重組TsPKA?C蛋白及其應用，尤其涉及重組TsPKA?C蛋白作為豬帶絳蟲/囊尾蚴檢測抗原的應用和重組TsPKA?C蛋白在制備豬囊尾蚴病檢測試劑盒中的應用。本發(fā)明的重組TsPKA?C蛋白能夠特異性的檢測豬帶絳蟲/囊尾蚴，而與豬細頸囊尾蚴、豬旋毛蟲等無任何交叉反應。
【專利說明】
重組TsPKA-C蛋白及其應用
技術領域
[00011本發(fā)明涉及重組TsPKA-C蛋白及其應用，尤其涉及重組TsPKA-C蛋白作為豬帶絳 蟲/囊尾蝴檢測抗原的應用和重組TsPKA-C蛋白在制備豬囊尾蝴病檢測試劑盒中的應用。
【背景技術】
[0002] 豬帶絳蟲（Taenia solium)是一種重要的人獸共患寄生蟲，其幼蟲不僅可寄生于 人的腦、眼、肌肉等處，引起相應部位的囊蟲病，嚴重危害人類健康。而且還可寄生于豬的肌 肉、腦等組織，導致豬肉因此而廢棄和銷毀，造成養(yǎng)豬業(yè)較大的經(jīng)濟損失，是世界范圍公認 的社會、政治、經(jīng)濟病。目前，針對豬囊蟲病診斷方法多以ELISA、EITB等血清學方法為主，但 這些方法大多都與細頸囊尾蝴陽性血清存在嚴重的交叉反應，因而導致臨床診斷中易出現(xiàn) 豬囊尾蝴病假陽性病例。此外，豬囊尾蝴病疫苗和藥物開發(fā)仍存在很多不足，篩選并鑒定高 效疫苗和藥物靶標分子也是目前豬囊蟲病研究的熱點。因此，利用豬帶絳蟲基因組和轉(zhuǎn)錄 組數(shù)據(jù)，開展豬囊尾蝴病診斷和疫苗候選分子鑒定和功能研究，尋找新的藥物設計靶點，對 有效防控豬囊蟲病具有重要意義。
[0003] 蛋白激酶是一種潛在的寄生蟲病疫苗候選分子和藥物設計靶點。蛋白激酶A (protein kinase Α,ΡΚΑ)又名3' ,5'-環(huán)腺苷酸(cAMP)依賴的蛋白激酶，是PKA超家族中重 要成員，是一類絲/蘇氨酸激酶。cAMP依賴性蛋白激酶是cAMP信號通路中關鍵的信號轉(zhuǎn)導分 子，通過對許多蛋白質(zhì)特定的絲/蘇氨酸殘基磷酸化，調(diào)節(jié)細胞的生長、增殖、分化與凋亡及 特定基因的表達等。眾多的人類疾病與蛋白激酶的活性異常存在著直接或間接關系，蛋白 激酶已經(jīng)成為治療癌癥、炎癥和其他免疫調(diào)控紊亂等復雜疾病的重要藥物靶點。除此之外， cAMP依賴性蛋白激酶也可用于寄生蟲病的診斷。Diaz-Masmela Y等利用蛋白質(zhì)組學技術鑒 定出7個豬囊尾蝴特異性很高的抗原，其中就包括cAMP依賴性蛋白激酶。血清學反應結(jié)果表 明，該蛋白與豬蛔蟲(Ascaris suum)、細頸囊尾蝴(Cysticercus tenuicolIis)、細粒棘球 蝴(Echinococcus granulosa)等陽性血清沒有交叉反應。上述結(jié)果無疑說明，cAMP依賴性 蛋白激酶有望作為豬囊尾蝴病診斷的候選抗原分子，從而解決現(xiàn)有血清學診斷方法存在交 叉反應的難題。本發(fā)明在成功克隆和鑒定豬帶絳蟲cAMP依賴性蛋白激酶催化亞基基因 (TsPKA-C)的基礎上，探索其作為診斷抗原的可行性，為進一步研究其生物學功能和作用機 制，開展基于豬帶絳蟲TsPKA-C的重組抗原疫苗和生物藥物奠定基礎。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決現(xiàn)有技術中存在的問題，本發(fā)明提供了重組TsPKA-C蛋白及其應用，尤其 涉及重組TsPKA-C蛋白作為豬帶絳蟲檢測抗原的應用和重組TsPKA-C蛋白在制備豬囊尾蝴 病檢測試劑盒中的應用。
[0005] 本發(fā)明提供重組TsPKA-C蛋白，所述重組TsPKA-C蛋白的氨基酸序列為序列表SEQ ID No.2。
[0006] 本發(fā)明還提供作為重組TsPKA-C蛋白豬帶絳蟲/囊尾蝴檢測抗原的應用;所述重組 TsPKA-C蛋白的氨基酸序列為序列表SEQ ID No.2。
[0007] 本發(fā)明提供重組TsPKA-C蛋白在制備豬囊尾蝴病檢測試劑盒中的應用；所述重組 TsPKA-C蛋白的氨基酸序列為序列表SEQ ID No.2。
[0008] 本發(fā)明還提供一種豬囊尾蝴病ELISA檢測試劑盒，所述試劑盒中包被抗原為重組 TsPKA-C蛋白，所述重組TsPKA-C蛋白的氨基酸序列為序列表SEQ ID No.2。
[0009] 作為優(yōu)選，所述試劑盒中還包括HRP標記的兔抗豬IgG。
[0010] 本發(fā)明還提供一種豬帶絳蟲ELISA檢測方法，所述方法不以專利法規(guī)定的疾病的 診斷和治療為目的，以純化的重組TsPKA-C蛋白Iyg于37°C包被酶標反應板lh，封閉液為1% BSA，用I3BST充分洗滌后分別加入待測樣品和豬陰性血清，37 °C孵育Ih，PBST洗滌三次后，加 入1:5000倍稀釋的HRP標記的兔抗豬IgG，充分洗滌后再加入DAB顯色，用濃硫酸終止反應后 測定吸光度，當P(陽性)/N(陰性)>2時，檢測結(jié)果可判為陽性，反之，則為陰性。
[0011] 本發(fā)明利用豬帶絳蟲基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)設計豬帶絳蟲TsPKA-C特異引物，以豬 帶絳蟲成蟲總RNA為模板，通過RT-PCR擴增TsPKA-C基因完整ORF，并通過生物信息學分析進 行鑒定。構(gòu)建pET-30a-TsPKA-C重組表達載體，在大腸桿菌BL21 (DE3)中進行誘導表達。純化 的目的蛋白進行SDS-PAGE和Western-blotting分析。結(jié)果表明，TsPKA-C的ORF由1032個核 苷酸組成，編碼343個氨基酸殘基，與細粒棘球蝴和多房棘球蝴氨基酸的一致性分別達 78.7%和98%; TsPKA-C具有蛋白激酶A的結(jié)構(gòu)域及其催化亞基特征性活性位點，且存在9個潛 在的線性B淋巴細胞抗原表位。TsPKA-C基因的表達產(chǎn)物主要以包涵體形式存在，且可與豬 囊尾蝴陽性血清發(fā)生反應，在42kDa處產(chǎn)生特異條帶。本發(fā)明克隆并鑒定了豬帶絳蟲cAMP依 賴性蛋白激酶催化亞基(TsPKA-C)基因，其表達產(chǎn)物可被豬囊尾蝴陽性血清所識別，作為豬 囊尾蝴檢測抗原使用。
【附圖說明】
[0012] 附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與本發(fā)明的實 施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。在附圖中： 圖1為豬囊尾蝴的TsPKA-C基因的PCR擴增，其中，M: DNA分子質(zhì)量標準；I: TsPKA-C; 圖2為TsPKA-C三級結(jié)構(gòu)預測;A為豬囊尾蝴的TsPKA-C三級結(jié)構(gòu);B為人PKA-Ca三級結(jié) 構(gòu)；其中，I: ATP結(jié)合位點；2: Ser/Thr激活位點；3: PKA調(diào)節(jié)亞基結(jié)合位點；4:保守的磷酸化 位點； 圖3為豬帶絳蟲PKA-C與其他物種的PKA-C多序列比對； 圖4為不同物種PKA-C的系統(tǒng)進化分析;E.multilocularis(CDJ04331)，E· granulosus (CDS23692)，Η·sapiens(P17612)，S.mansoni(GQ168377)，S. japonicum(GU130533)， C·elegans(NP_493605)，D·melanogaster(NP_476977)，M. musculus(P05132)，Pig (P36887)； 圖5為重組質(zhì)粒pET-30a-TsPKA-C的酶切鑒定;其中，M:DNA分子質(zhì)量標準；I:重組質(zhì)粒 pET-30a-TsPKA-C; 2: pET-30a-TsPKA-C 酶切； 圖6為TsPKA-C重組蛋白的表達;其中，M:蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準；1:空載體;2:未誘導的 重組菌;3:誘導后的上清;4:誘導后沉淀； 圖7為TsPKA-C重組蛋白的純化;其中，M:蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準；1:200 mmol/L咪唑；2: I OOmmo I/L咪唑； 圖8為TsPKA-C重組蛋白的Western-blotting;其中，Μ:蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準；I:豬囊尾 蝴陽性血清;2:豬囊尾蝴陰性血清。
【具體實施方式】
[0013] 以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為市 售。
[0014] 實施例1 1材料與方法 1.1蟲株與血清 豬帶絳蟲成蟲、豬囊尾蝴陽性和陰性血清均由中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所蠕蟲病 課題組保存。
[0015] 1.2試劑 TRIzol Reagent、DNA膠回收試劑盒、pMD-T_19(simple)Vector、質(zhì)粒小量提取試劑盒、 限制性內(nèi)切酶BamH I、Hind ΙΠ 、Τ4 DNA連接酶均購自日本Takara公司。RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒、Prestained Protein Ladder均購自美國Thermo公 司。大腸埃希菌DH(5a)感受態(tài)細胞、表達載體pET-30a、大腸埃希菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞、 異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG)、X-Gal、5 X蛋白上樣緩沖液均購自北京全式金生物技術 有限公司。辣根過氧化物酶(HRP)標記的兔抗豬IgG購自Sigma公司。Ni Sepharose 6 Fast Flow蛋白純化試劑盒購自美國GE公司。
[0016] 1.3總RNA的提取及CDNA合成 用Trizol法提取豬帶絳蟲成蟲的總RNA，以RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒合成cDNA第一鏈。
[0017] 1.4引物設計合成 根據(jù)豬帶絳蟲全基因組注釋信息及轉(zhuǎn)錄組分析數(shù)據(jù)，并結(jié)合GeneDB數(shù)據(jù)庫公布的豬帶 絳蟲PKA-C的開放閱讀框(ORF)序列，利用軟件Primer 5.0和Oligo 6.0軟件設計一對特異 性引物，上游引物加入BamH I酶切位點，下游引物加入Hind ΙΠ 酶切位點： 上游引物:5'-CGGGATCCATGGCGCAAGCGGAGTTC-3' ； 下游引物：5 ' -CCCAAGCTTGGTAAAATTCTGCAAATTCTGCC-3 '。
[0018]引物送江蘇金唯智生物技術有限公司合成。
[0019] 1.5基因克隆和轉(zhuǎn)化 以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA第一鏈為模板，用設計合成的TsPKA-C特異性引物進行PCR，擴增 體系如下：cDNA模板I yL，5XPS Buffer 10yL，dNTP Mix 4yL，上游引物 1 μ!Χ0·3 μπιο1/μ L)，下游引物 1 μLΧ0·25 μπιο?/μυ，補充 ddH20 至 50 yL。擴增程序如下：95 °C 5 min;94 °C 40 s，62.5 °C 40 s，72 °C I min，30個循環(huán);72 °C 10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電 泳回收并純化后克隆入pMD-19-T simple載體，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5a感受態(tài)細胞。經(jīng)菌液 PCR和酶切鑒定為陽性的克隆送江蘇金唯智生物技術有限公司測序。該擴增產(chǎn)物的核苷酸 序列為： ATGGCGCAAGCGGAGTTCGAAAAGATTCTCGAAGCCAAGTCCCGAGGGTTTTTTGAGGTCTTCAATTCGCCGC CCAAGAACACTGCTACTTGGGATGATTTTACACGCATTCGAACCCTTGGACGGGGCGCATTTGGCCGGGTTTTGTTG GTTCGCTATCGAGATACGGAGAGGTACTACGCAATGAAGGTTCTTTCCAAGTTGGAAGTGGTAAAATCACGACAAAT TGACAACGCCATAATGGAAAAACGCATCCTAGCAGCATGCAATGTCAACCAAATCATCAAATTAGCCTATAGTTTTA AGGACAACAGCTATCTTTACATGGTAATGGAATTTGTAGTGGGAGGAGAGATGTTCGCTCTGTTGCGAAACATGCGT CGCTTTCCTGAGGGTATGGTAAAGTTTTACGCTGCTCAGGTCCTGCTGGCGTTTGAATACCTCCACTACCTCACCAT CACTTACCGAGATTTAAAACCTGAGAATTTGCTCATAACCGGTGAGGGCTTTATCAAAGTTGCAGATCTTGGATTTG CGAAACTTCTGCCCAAGGATAAGCGCACGTGGACTCTGTGTGGAACTCCGGACTACATGGCGCCAGAGATTATCATG AACAAGGGATACGCCCATGCAGTGGATTGGTGGGCTTATGGAGTGCTTCTCTACGAAATGACCACAGGCTTTCCTCC CTTCATGCACCAGGAGCAGATGAAGACTTTTGAGCACATCATTTCGGGCAAAATAAAGTTTACTAACCAATTTAGTC CAGATCTAAAAGATCTCATCAAGAATCTCATTCAAACTGACCTCTCGAGGCGCTTTGGGAACCTCCGTAATGGCATT ATGGATATCAAGGGACACGCCTACTTCAGTGACGTCGATTTTATGGCCATCTTCAACCAGAGTGTACGACCGCCGTA TGTGCCGAAGGTGAAGAGTCCCGGTGATGCAAGCAACTTTGAGAAGTGGGATGAGGAGAAACTAAAAATTGCTGACA GGGAGAAATTTAAGGCAGAATTTGCAGAATTTTAG 1.6 TsPKA-C基因的生物信息學分析 利用ProtParam(http : //www · expasy · org/tools/protparam· html)在線軟件預測 TsPKA-C蛋白的理論分子質(zhì)量、氨基酸組成等；ProtScal (http: //www · expasy · org/tool s/ protscale.html)分析其氨基酸的親疏水性。利用SignaIP 4. I Server(http:// www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測其信號肽。用在線軟件（http:// www. imtech.res. in/raghava/bcepred/bcepred_submission.html11(? 位。MotiScan (http: //myhits · isb-sib · ch/cgi_bin/motif_scan)預測其糖基化位點、磷 酸化位點和模體及結(jié)構(gòu)域。利用在線軟件SWISS_MODEL(http: //swissmodel · expasy · org/) 預測其三級結(jié)構(gòu)。
[0020] 1.7 TsPKA-C蛋白的序列比對及系統(tǒng)進化分析 用BlastP軟件在GenBank中搜索與TsPKA-C氨基酸序列同源的其他物種PKA-C序列，利 用Clustal XI.83及Mega 6.0軟件對獲得的序列進行比對，并計算遺傳距離。然后用 Paup4.0程序中的鄰接法(Neighbor-joining method, NJ)繪制種系發(fā)育樹。
[0021] 1.8重組表達載體構(gòu)建及表達 將鑒定正確的pMD19-T-TsPKA-C質(zhì)粒及原核表達載體pET-30a分別用BamH I+ Hind ΙΠ 進行雙酶切。酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，純化回收目的片段。利用T4 DNA連接酶將目的 片段與pET-30a連接，并轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)感受態(tài)細胞，提取質(zhì)粒后進行酶切鑒定，陽性克隆進 行測序驗證。
[0022] 取測序正確的陽性克隆菌液1:100(v/v)接種于100 mL LB(含卡那抗性100 mg/ mL)液體培養(yǎng)基中，37 °C 220 r/min振蕩培養(yǎng)至菌液吸光度A6qq=O. 6~0.8時，加入100 yL 500 mmol/L的IPTG，37 °C 220 r/min振蕩培養(yǎng)6 h。收集誘導表達的菌液進行SDS-PAGE分 析。同時設置誘導前和pET-30a轉(zhuǎn)化菌液的誘導表達產(chǎn)物作為對照。
[0023] 1.9重組蛋白的純化及Western-blot分析 取50 mL誘導表達的菌液，8000 r/min離心15 min，棄上清，加等體積的PBS溶液重懸菌 體沉淀(反復重懸3-5次）。然后將其放入-80 °C冰箱冷凍I h，取出后溶解，如此反復凍融3 次。利用超聲波破碎儀處理菌體懸液，直至溶液澄清透亮。菌體裂解物4 °C，12000 r/min離 心10 min，分別收集上清和沉淀，進行SDS-PAGE凝膠電泳。利用鎳NTA瓊脂糖凝膠FF在不同 咪唑梯度下對目的蛋白進行純化，純化后的蛋白以豬囊尾蝴陽性血清為第一抗體，HRP標記 的兔抗豬IgG為第二抗體進行Western-blotting分析，用DAB顯色后觀察結(jié)果。該純化后的 重組蛋白的氨基酸序列為： MAQAEFEKILEAKSRGFFEVFNSPPKNTATWDDFTRIRTLGRGAFGRVLLVRYRDTERYYAMKVLSKLEVVKS RQIDNAIMEKRILAACNVNQIIKLAYSFKDNSYLYMVMEFVVGGEMFALLRNMRRFPEGMVKFYAAQVLLAFEYLHY LTITYRDLKPENLLITGEGFIKVADLGFAKLLPKDKRTWTLCGTPDYMAPEIIMNKGYAHAVDffffAYGVLLYEMTTG FPPFMHQEQMKTFEHIISGKIKFTNQFSPDLKDLIKNLIQTDLSRRFGNLRNGIMDIKGHAYFSDVDFMAIFNQSVR PPYVPKVKSPGDASNFEKWDEEKLKIADREKFKAEFAEF 2結(jié)果 2.1 TsPKA-C基因的PCR擴增 以提取的豬帶絳蟲總RNA為模板，經(jīng)RT-PCR擴增，獲得大小為10 3 2bp左右的片段，與預 期結(jié)果一致(圖1)。
[0024] 2.2豬帶絳蟲TsPKA-C蛋白的生物信息學分析 TsPKA-C基因完整ORF為1032bp，編碼343個氨基酸殘基，其理論分子質(zhì)量為40.0 kDa。TsPKA-C蛋白不含有信號肽序列，可能為非分泌型蛋白。PredictProtein預測表明，在 該蛋白二級結(jié)構(gòu)中α螺旋占40.52%，β折疊13.99%，其余為無規(guī)卷曲。綜合分析表明，TsPKA-C 蛋白的抗原表位可能主要位于氨基酸序列的第8~14、19~26、97~103、124~130、156~162、180 ~186、265~274、307~313、329~335位。]?〇衍€5。311分析表明，了8?1^-(：的第34-290位氨基酸可 能為蛋白激酶A的結(jié)構(gòu)域，并具有蛋白激酶A特征性活性位點：ATP結(jié)合位點 (40LGRGAFGRVLLVRYRDTERYYAMK)和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶激活位點 (153ITYRDLKPENLLI)。三級結(jié)構(gòu)預測顯示，TsPKA-C蛋白含有12個α螺旋和9個β折疊，其余為 無規(guī)卷曲（圖2)。
[0025] 2.3系統(tǒng)發(fā)育進化分析 同源序列相似性比對表明，豬帶絳蟲TsPKA-C與其他物種PKA-C氨基酸的相似性高達 71.7%，與豬的一致性和相似性分別達51.6%和72%;與細粒棘球蝴的一致性和相似性分別達 78.7%和79.7%，表明PKA-C在絳蟲種間非常保守。TsPKA-C與其他生物的PKA-C-樣，擁有 cAMP依賴性蛋白激酶催化亞基特征性結(jié)構(gòu)域和活性位點（圖3所示）。表明TsPKA-C為豬帶絳 蟲cAMP依賴性蛋白激酶催化亞基。
[0026] 在圖3中， 紅色下劃線表示PKA-C激酶結(jié)構(gòu)域;黑色方框表示PKA-C特征性活性位點，I: ATP活性位 點（GTGSFGRV) ; 2: Ser/Thr激活位點（RDLKPEN) ; 3:保守的磷酸化位點（188T) ; 4: PKA調(diào)節(jié)亞 基結(jié)合位點（LCGTPEY); E·multilocularis(CDJ04331)，E·granulosus(CDS23692)，H·sapiens(P17612)， S.mansoni(GQ168377),S. japonicum(GU130533),C.eIegans(NP_493605), D.melanogaster(NP_476977)，M. musculus(P05132)，Pig(P36887) 用Mega 6.0軟件對獲得的序列進行比對，并計算遺傳距離。然后用Paup4.0程序中的鄰 接法(Neighbor-joining method, NJ)繪制種系發(fā)育樹。結(jié)果表明，TsPKA-C與帶科絳蟲的 PKA-C位于同一分支，親緣關系最近，而與其他物種的親緣關系較遠。結(jié)果如圖4。
[0027] 2.4重組菌株的表達與分析 重組質(zhì)粒pET-30a-TsPKA-C經(jīng)PCR和酶切鑒定均得到約1032bp的片段（圖5)，說明成功 構(gòu)建了攜帶TsPKA-C基因的原核表達載體。用IPTG對pET-30a-TsPKA-C重組菌誘導表達，并 經(jīng)SDS-PAGE檢測分析，在預期的42kDa附近出現(xiàn)目的條帶。經(jīng)超聲波破碎處理的菌體SDS-PAGE分析結(jié)果表明，目的蛋白主要以包涵體形式存在（圖6)。
[0028] 2 · 5 目的蛋白的Western-blot 6 mol/L尿素溶解包涵體沉淀后，用Ni-NTA Purification System進行純化。SDS-PAGE分析表明，目的蛋白獲得較好的純化效果(如圖7)。以純化的TsPKA-C重組蛋白為抗原， 進行Western-blot分析。結(jié)果顯示，TsPKA-C蛋白可與豬囊尾蝴陽性血清特異性反應，而與 陰性血清不反應。說明TsPKA-C蛋白具有良好的免疫反應性(圖8 )。
[0029] 3 討論 cAMP依賴性蛋白激酶信號轉(zhuǎn)導主要通過對靶細胞內(nèi)cAMP濃度的改變和激活蛋白激酶A 來調(diào)控機體的生命活動。PKA是一種由四聚體(R2C2)組成的異構(gòu)酶，其中R是調(diào)節(jié)亞基，C是催 化亞基。每個調(diào)節(jié)亞基R上有2個cAMP結(jié)合位點，催化亞基具有催化底物蛋白質(zhì)特定絲氨酸/ 蘇氨酸殘基磷酸化的功能。PKA以兩個催化亞基結(jié)合兩個調(diào)節(jié)亞基的全酶的形式存在時， 呈非活性狀態(tài)。當2個調(diào)節(jié)亞基結(jié)合4分子的cAMP后，引起調(diào)節(jié)亞基的構(gòu)象改變，釋放出具有 活性的催化亞基，通過使底物蛋白質(zhì)特定絲/蘇氨酸殘基磷酸化，從而調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的物質(zhì)代 謝和基因表達。PKA-C在進化過程中非常保守，具有一些特征性結(jié)構(gòu)域，例ATP結(jié)合位點 (Gly-X-Gly-X-X-Gly-X-Val)和絲/蘇氨酸激酶活性位點（Arg-Asp-Leu-Lys-x-x-Asn)。同 源序列比對顯示，TsPKA-C具有cAMP依賴性蛋白激酶催化亞基特征性保守結(jié)構(gòu)域:ATP結(jié)合 位點(GTGSFGRV)、Ser/Thr激活位點（RDLKPEN)、保守的磷酸化位點（188T)和PKA調(diào)節(jié)亞基結(jié) 合位點（LCGTPEY)。其中，188T是影響催化亞基活性關鍵性磷酸化位點。進化分析表明， TsPKA-C與帶科絳蟲的PKA-C位于同一分支，親緣關系較近，說明本發(fā)明獲得的序列即為豬 帶絳蟲PKA-C基因。
[0030] 本發(fā)明在原核表達系統(tǒng)中高效表達了豬帶絳蟲的PKA-C基因，融合蛋白主要以包 涵體形式存在。利用豬囊尾蝴陽性血清進行的Western-blotting實驗證明，重組TsPKA-C具 有良好的免疫反應原性，有望用于豬囊尾蝴病的血清學診斷。ELISA檢測試驗表明，重組 TsPKA-C具有良好的特異性，與細頸囊尾蝴、豬旋毛蟲和豬弓形蟲陽性血清無交叉反應。所 以，以TsPKA-C為抗原的診斷方法將可能解決豬囊尾蝴血清樣品診斷中細頸囊尾蝴感染導 致的交叉反應問題。此外，抗原表位預測表明，TsPKA-C蛋白具有9個潛在的線性B細胞表位， 說明TsPKA-C還可能成為新型疫苗研發(fā)的候選分子。
[0031 ]蛋白激酶A的催化亞基是目前研究的熱點，尤其在治療癌癥、炎癥和其他免疫調(diào)控 紊亂等復雜疾病和寄生蟲病防控方面是潛在的藥物設計靶點。曼氏血吸蟲、瘧原蟲蛋白激 酶A催化亞基的研究表明，cAMP依賴性蛋白激酶在寄生蠕蟲等多種生物的生長發(fā)育和代謝 調(diào)控中也起著重要作用，有望成為抗寄生蟲藥的藥物靶標。利用RNAi干擾技術和PKA的抑制 劑處理血吸蟲毛蝴和成蟲，發(fā)現(xiàn)毛蝴失去運動活力，成蟲的產(chǎn)卵量顯著下降，這一結(jié)果表明 cAMP依賴性蛋白激酶有望作為血吸蟲病治療的祀標。Nathalie Wurtz等在惡性皰原蟲上研 究表明，cAMP依賴性蛋白激酶在調(diào)控寄生蟲發(fā)育的過程中起著關鍵作用，體外酶抑制試驗 表明，cAMP依賴性蛋白激酶是一種潛在的治療惡性瘧原蟲的新型藥靶。以上研究表明，開展 TsPKA相關研究，篩選TsPKA抑制劑來干預其活性或抑制TsPKA的表達，從而控制cAMP介導的 信號通路，阻斷豬囊尾蝴或豬帶絳蟲的正常發(fā)育，開發(fā)基于TsPKA-C的新型藥物，對有效防 控豬囊尾蝴病都具有重要意義。
[0032] 實施例2基于重組抗原TsPKA-C的豬囊尾蝴病ELISA檢測 以純化的TsPKA-C Iyg于37°C包被酶標反應板lh，包被緩沖液為pH9.6的碳酸鹽緩沖 液，包被抗原濃度為l〇μg/ml，封閉液為1%BSA，用PBST充分洗滌后分別加入倍比稀釋的豬陰 性血清及豬囊尾蝴、豬細頸囊尾蝴、豬旋毛蟲和豬弓形蟲陽性血清，37 °C孵育Ih，PBST洗滌 三次后，加入1:5000倍稀釋的HRP標記的兔抗豬IgG，充分洗滌后再加入DAB顯色，用濃硫酸 終止反應后測定吸光度。檢測結(jié)果如表1所示。
[0033] 表1以TsPKA-C為包被抗原的ELISA檢測結(jié)果
從表1可以看出，TsPKA-C抗原僅與豬囊尾蝴陽性血清發(fā)生反應，100倍稀釋的豬囊尾蝴 陽性血清的平均OD值達1.08,而與豬陰性血清、豬細頸囊尾蝴陽性血清、豬旋毛蟲陽性血 清、豬弓形蟲陽性血清反應的OD值均在0.4以下，即P(陽性)/N(陰性)=2.7>2。說明以TsPKA-C為抗原的ELISA方法，具有很好的特異性，克服了現(xiàn)有血清學檢測方法易與豬細頸囊尾蝴 存在交叉反應的缺點，是理想的豬囊尾蝴病特異性檢測抗原。
[0034] 實施例3對豬帶絳蟲陽性血清的鑒定方法 應用實施例2中的試劑盒及檢測方法對待測血清進行檢測并分析檢測結(jié)果，當P(陽 性)/N(陰性)>2時，檢測結(jié)果可判為陽性，反之，則為陰性。
[0035] 最后應說明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明， 盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，對于本領域的技術人員來說，其依然可 以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換。 凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的 保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 重組TsPKA-C蛋白，所述重組TsPKA-C蛋白的氨基酸序列為序列表SEQ ID No.2。2. 重組TsPKA-C蛋白作為豬帶絳蟲/囊尾蝴檢測抗原的應用；所述重組TsPKA-C蛋白的 氨基酸序列為序列表SEQ ID No.2。3. 重組TsPKA-C蛋白在制備豬囊尾蝴病檢測試劑盒中的應用;所述重組TsPKA-C蛋白的 氨基酸序列為序列表SEQ ID No.2。4. 一種豬囊尾蝴病ELISA檢測試劑盒，其特征在于：所述試劑盒中包被抗原為重組 TsPKA-C蛋白，所述重組TsPKA-C蛋白的氨基酸序列為序列表SEQ ID No.2。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒中還包括HRP標記的兔抗豬 IgG〇6. -種豬帶絳蟲ELISA檢測方法，所述方法不以專利法規(guī)定的疾病的診斷和治療為目 的，其特征在于：以純化的重組TsH(A-C蛋白lyg于37°C包被酶標反應板lh，封閉液為1% BSA，用TOST充分洗滌后分別加入待測樣品和豬陰性血清，37 °C孵育lh，PBST洗滌三次后，加 入1:5000倍稀釋的HRP標記的兔抗豬IgG，充分洗滌后再加入DAB顯色，用濃硫酸終止反應后 測定吸光度，當P(陽性)/N(陰性)>2時，檢測結(jié)果可判為陽性，反之，則為陰性。
【文檔編號】C12N9/12GK105861461SQ201610248923
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月20日
【發(fā)明人】駱學農(nóng), 劉光學, 張少華, 郭愛疆, 鄭亞東, 梁盼紅, 侯俊玲, 才學鵬
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所