一種酶活提高的乙醇脫氫酶突變體及其制備方法與應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種酶活提高的乙醇脫氫酶突變體及其制備方法與應用，屬于生物醫(yī)藥及化工領域。本發(fā)明通過優(yōu)化乙醇脫氫酶活性位點附近氨基酸序列，得到乙醇脫氫酶突變體，其活性最高可提高36％。應用這種酶活提高的乙醇脫氫酶突變體時，可以大幅度降低轉化過程中酶的用量，從而在大規(guī)模制備S?N?叔丁氧羰基?3?羥基哌啶時可有效降低生產成本，產生顯著的經濟效益。
【專利說明】
一種酶活提高的乙醇脫氫酶突變體及其制備方法與應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及一種酶活提高的乙醇脫氫酶突變體及其制備方法與應用，屬于生物醫(yī) 藥及化工領域。
【背景技術】
[0002] 乙醇脫氛酶（alcohol dehydrogenase，ADH，E·C. 1 · 1 · 1 · 1)也稱酬還原酶（keto-reductase)，廣泛存在于植物組織、微生物、人和哺乳動物中，以NAD+、NADP+或PQQ為輔酶，可 逆的催化氧化短鏈醇、芳香醇等為相應的醛類或酮類，是一類重要的氧化還原酶。目前已對 多種微生物例如超高溫好氧古細菌（Hyperthermophilic)、梭菌屬（Clostridium beijerincki)、硫化葉菌屬（Sulfolobus solfataricus)、假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa)、酉昔菌屬（Acetobacter pasteurianus)、乳酉愛菌（Lactobacillus brevis)、紅 球菌屬(Rhodococcus ruber)來源的乙醇脫氫酶進行了深入研究。研究發(fā)現，與其他來源的 乙醇脫氫酶相比，來源于R.ruber DSM 44541的乙醇脫氫酶具有較強的耐有機溶劑尤其是 丙酮及異丙醇的特性，這種特性使得底物溶解性有較大的提高。并且，丙酮及異丙醇可作為 乙醇脫氫酶催化的醛酮互變的共底物用于輔因子的再生。
[0003] 很多哌啶類衍生物具有抗菌、麻醉、抗腫瘤、治療老年癡呆癥、糖尿病及病毒感染 (包括AIDS)等多種藥理活性，其中S-I-叔丁氧羰基-3-羥基哌啶是一種具有手性結構的重 要中間體，被廣泛應用于鎮(zhèn)痛、抗精神病和抗腫瘤等藥物的合成。該化合物作為關鍵中間體 用于合成選擇性抑制布魯頓酪氨酸激酶(BTK)的抑制劑依魯替尼（Ibrutinib)。目前合成S-1-叔丁氧羰基-3-羥基哌啶的方法分為化學轉化法和生物催化法?；瘜W轉化法包括消旋體 的拆分及全合成兩種方法，但是都存在價格昂貴，收率低等缺點，因此現在制備(S)-I-叔丁 氧羰基-3-羥基哌啶的方法普遍采用生物催化的方法。生物催化法則需要高活力的酶。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明要解決的一個技術問題是提供一種酶活提高的乙醇脫氫酶突變體，是對氨 基酸序列如SEQ ID NO. 1所示的乙醇脫氫酶的第54位的酪氨酸，或者第286位的苯丙氨酸， 或者第294位的酪氨酸中的一個或者多個進行突變。
[0005] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述突變體是將第54位的酪氨酸突變?yōu)樯彼醀。
[0006] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述突變體是將第286位的苯丙氨酸突變?yōu)榱涟彼?L0
[0007] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述突變體是將294位的酪氨酸突變?yōu)楸奖彼酕。
[0008] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述突變體的氨基酸序列分別如SEQ ID NO. 3、4、5 所示。
[0009] 本發(fā)明要解決的另一個技術問題是提供獲得上述乙醇脫氫酶突變體的方法，包括 如下步驟：
[0010] 通過PCR或基因合成的方法獲得編碼野生型乙醇脫氫酶的基因的全序列，以全序 列為模板，通過定點突變對乙醇脫氫酶野生型基因進行突變，獲得乙醇脫氫酶突變體。 [0011]本發(fā)明要解決的另一個技術問題是應用SEQ ID NO.3至5任一所述的乙醇脫氫酶 突變體或含有SEQ ID NO.3至5任一所述的乙醇脫氫酶突變體的細胞制備S-N-叔丁氧羰基-3-羥基哌啶的方法，包括如下步驟：
[0012] 以SEQ ID NO.3至5任一所述乙醇脫氫酶突變體為催化劑，以N-叔丁氧羰基-3-哌 啶酮為底物，在輔因子及氫供體的存在下制備S-N-叔丁氧羰基-3-羥基哌啶。
[0013] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述輔因子是NADP或NAD。
[0014] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述氫供體是異丙醇。
[0015] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述制備反應在pH7.0~9.0的水相緩沖液中進行， 溫度為25°C~45°C。
[0016] 本發(fā)明的有益效果:通過優(yōu)化乙醇脫氫酶活性位點附近氨基酸序列，得到SEQ ID NO.3至5所示乙醇脫氫酶突變體，其活性最高比野生型提高了 36%。應用這種酶活提高的乙 醇脫氫酶突變體時，可以大幅度降低轉化過程中酶的用量，從而在大規(guī)模制備S-N-叔丁氧 羰基-3-羥基哌啶時可有效降低生產成本，產生顯著的經濟效益。
【附圖說明】
[0017] 圖1為野生型乙醇脫氫酶結構；
[0018] 圖2為實施例3中野生型乙醇脫氫酶反應22小時后得到產物HPLC圖；
[0019] 圖3為實施例3中乙醇脫氫酶突變體KRED(ADH)_F286L反應22小時后得到產物HPLC 圖；
[0020] 圖4為實施例3中乙醇脫氫酶突變體反應22小時后得到產物轉化率比較圖；
[0021] 圖5為實施例4產物HNMR圖。
【具體實施方式】
[0022]產物HPLC定量檢測方法、條件：
[0023]表 A
[0028]實施例1野生型乙醇脫氫酶的獲得
[0029] 全基因合成SEQ ID NO.2所示野生型乙醇脫氫酶基因，并根據全基因序列設計以 下引物：
[0030] PCR 上游引物：CTTTAAGAAGGAGATATACATATGAAAGCCGTCCAGTACACC
[0031] PCR下游引物:GGCTTTGTTAGCAGCCGGATCTCA TCAGGGAACCACCACGCC
[0032] 表1PCR反應體系
[0034] PCR反應條件如下：
[0035] 98Γ?π?η，98Γ?〇8、55Γ58、72Γ58/1Λρ，3(^7(3?θ8，16Γ。
[0036] PCR擴增野生型乙醇脫氫酶基因序列；
[0037] 同時對pET21a載體片段進行PCR處理：
[0038] PCR上游引物：ATGTATATCTCCTTCTTAAAG
[0039] PCR下游引物：TGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGG [0040] PCR體系同表1; PCR反應條件如下：
[0041 ] 98〇Clmin,98〇C10s^55〇C5s^72〇C5s/kbp,30cyclesa6°C
[0042]膠回收PCR獲得的帶突變位點的基因片段及pET2 Ia載體片段，測定濃度后按照基 因片段比載體片段1:1質量比共轉化DH5a菌株。使其在菌體細胞內完成同源重組從而將帶 野生型乙醇脫氫酶基因的核酸片段插入pET-21a載體中得到pET-21a-KRED。涂板挑取陽性 菌落，在試管中過夜培養(yǎng)，提取質粒保存并取樣送測序。
[0043]將測序正確的質粒轉化BL21(DE3)T1R菌株，挑取轉化正確的菌落測試表達和保存 作為生產菌種。
[0044] 培養(yǎng)基：
[0045] LB 培養(yǎng)基:酵母粉 5g/L、胰蛋白胨 10g/L、NaCl 10g/L、pH7.0。
[0046]固體培養(yǎng)基在此基礎上添加2 %瓊脂粉。
[0047]獲得工程菌株后，接種100mL三角搖瓶過夜培養(yǎng)，然后按照1:50接種1000 ml培養(yǎng) 瓶，37°C220rpm培養(yǎng)至0D_約為0.8,降溫至16°C，添加 IPTG(最終濃度為ImM)，培養(yǎng)10h，離 心洗滌收集菌體。
[0048]實施例2乙醇脫氫酶突變體的獲得
[0049] 根據乙醇脫氫酶的三維結構（PDB: 2XAA)，乙醇脫氫酶活性中心附近氨基酸包括 ?43、]\147、051、厶53、￥54、1^119、厶273小281、卩282小286、￥294、￥295。由于活性中心附近的氨基 酸改變可能會顯著影響酶活性，以051^53、￥54^273、？286、￥294氨基酸位點為例對野生型 乙醇脫氫酶進行了定點突變。根據突變位點設計如表2所列引物。
[0050] 表2定點突變引物序列
L〇〇54J PCR反應條件如下：
[0055] 98〇Clmin,98〇C10s^55〇C5s^72 〇C5s/kbp,30cyclesa6°C,
[0056] 以pET-21 a-KRED為模板，PCR擴增表4、5所列5 '端(a)及3 '端(b)兩片段：
[0057] 表 4a 片段 PCR
[0059]表 5b 片段 PCR
[0061] 膠回收5'端及3'端片段。
[0062] 以5'端及3'端片段為模板，PCR擴增表6所列帶突變位點的基因片段： [0063]表6帶突變位點的基因片段
[0067] PCR反應條件如下：
[0068] 98Γ?π?η;98Γ?〇8、55Γ58、72Γ58/1Λρ，3(^7(3?θ8 ;16Γ。
[0069] 同時對pET21a載體片段進行PCR處理：
[0070] PCR上游引物：ATGTATATCTCCTTCTTAAAG
[0071] PCR下游引物：TGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGG [0072] PCR體系同表2; PCR反應條件如下：
[0073] 98Γ?π?η，98Γ?〇8、55Γ58、72Γ58/1Λρ，3(^7(3?θ8，16Γ。
[0074] 膠回收PCR獲得的帶突變位點的基因片段及pET2 Ia載體片段，測定濃度后按照基 因片段比載體片段1:1質量比共轉化DH5a菌株。使其在菌體細胞內完成同源重組從而將帶 突變位點的核酸片段插入pET-21a載體中。涂板挑取陽性菌落，在試管中過夜培養(yǎng)，提取質 粒保存并取樣送測序。
[0075]將測序正確的質粒轉化BL21(DE3)T1R菌株，挑取轉化正確的菌落測試表達和保存 作為生產菌種。
[0076] 培養(yǎng)基：
[0077] LB 培養(yǎng)基:酵母粉 5g/L、胰蛋白胨 10g/L、NaCl 10g/L、pH7.0。
[0078]固體培養(yǎng)基在此基礎上添加 2 %瓊脂粉。
[0079]獲得工程菌株后，接種100mL三角搖瓶過夜培養(yǎng)，然后按照1:50接種1000 ml培養(yǎng) 瓶，37°C220rpm培養(yǎng)至0D_約為0.8,降溫至16°C，添加 IPTG(最終濃度為ImM)，培養(yǎng)10h，離 心洗滌收集菌體。
[0080]實施例3乙醇脫氫酶的活性測試
[00811將上述收集菌體用50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)重懸至3.5g/L，使用高壓勻漿細胞 破碎儀15000Ps i冰水浴高壓勻漿破碎2次，得到細胞裂解液。
[0082] 酶反應活性體系(5ml反應體系)包括:N-叔丁氧羰基-哌啶酮0. lg/ml，異丙醇10% (v/v)，Na2HP〇4· 12H2〇 24mg/ml，NaH2P〇4*2H2〇 6.6mg/ml，MgCl2lmg/ml，輔酶0.4mg/ml，細 胞裂解液30%(v/v)。
[0083] 置于恒溫搖床30°C200rpm反應;反應15h后，補異丙醇0.5ml;繼續(xù)反應至總反應時 間為22h。反應結束后取樣加入2倍體積乙腈抽提，離心20min取上清，0.45μπι濾膜過濾，HPLC 檢測，計算轉化率。酶活性定義為30攝氏度反應22h后HPLC檢測產物N-叔丁氧羰基-哌啶酮 的峰面積占底物峰面積的百分比。突變后的乙醇脫氫酶活性比野生型提高了 36%，光學純 度e.e%為 100%。
[0084]實施例4應用乙醇脫氫酶突變體轉化N-叔丁氧羰基-哌啶酮
[0085] 將KRED(ADH)-F286L突變菌體用50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)重懸至50g/L，使用高 壓勻漿細胞破碎儀15000Psi冰水浴高壓勻漿破碎2次，得到細胞裂解液。
[0086] 將N-叔丁氧羰基-哌啶酮（5.0g、0.0 25mo 1)溶于5mL異丙醇30 °C靜置，稱取 Na2HPO4· 12H20( 1 · 2g，0 · 003moI)，NaH2PO4 · 2H20(0 · 33g，0 · 002mol)加入29ml水溶解，配成磷 酸緩沖液。量取15mL細胞裂解液酶液，加入50mg MgCl2.6H20，40mg NADP。將磷酸緩沖液，酶 液依次加入底物中，2N/L NaOH溶液調節(jié)pH至7-8，加熱至30°C左右，并每四小時監(jiān)測并調節(jié) pH。反應54KHPLC監(jiān)測N-叔丁氧羰基-哌啶酮小于0.5%。將反應液用硅藻土過濾，濾餅EA (25mLX3)洗三次，濾液同體積EA萃取三次。合并有機相，無水硫酸鈉干燥，旋干得黃色油狀 物4.5g，收率89.1 %。產物的結構鑒定數據為!1-匪1?(4001抱，0150):3 = 1.27-1.30[111，2!1，-CH2],1.40[s,9H,-(CH)3],1.61-1.82[m,2H,-CH2]2.64-2.78[m,2H,-CH2],3.37-3.39[m, lH，-CH]，3.59-3.77[m，2H，-CH2]，4.84-4.85[d，lH，-OH]。
[0087]雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范 圍應該以權利要求書所界定的為準。
【主權項】
1. 一種酶活提高的乙醇脫氫酶突變體，其特征在于，是將乙醇脫氫酶活性位點附近的 氨基酸突變得到的。2. 根據權利要求1所述的一種酶活提高的乙醇脫氫酶突變體，其特征在于，是對氨基酸 序列如SEQ ID NO. 1所示的乙醇脫氫酶的第54位的酪氨酸，或者第286位的苯丙氨酸，或者 第294位的酪氨酸中的一個或者多個進行突變。3. 根據權利要求1或2所述的一種酶活提高的乙醇脫氫酶突變體，其特征在于，所述突 變體是將第54位的酪氨酸突變?yōu)樯彼醀。4. 根據權利要求1或2所述的一種酶活提高的乙醇脫氫酶突變體，其特征在于，所述突 變體是將第286位的苯丙氨酸突變?yōu)榱涟彼酟。5. 根據權利要求1或2所述的一種酶活提高的乙醇脫氫酶突變體，其特征在于，所述突 變體是將294位的酪氨酸突變?yōu)楸奖彼酕。6. -種制備權利要求1或2所述乙醇脫氫酶突變體的方法，其特征在于，包括如下步驟： 通過PCR或基因合成的方法獲得編碼野生型乙醇脫氫酶的基因的全序列，以全序列為 模板，通過定點突變對乙醇脫氫酶野生型基因進行突變，獲得乙醇脫氫酶突變體。7. -種制備S-N-叔丁氧羰基-3-羥基哌啶的方法，其特征在于，以權利要求1或2所述乙 醇脫氫酶突變體或含有所述乙醇脫氫酶突變體的細胞為催化劑，以N-叔丁氧羰基-3-哌啶 酮為底物，在輔因子及氫供體的存在下制備S-N-叔丁氧羰基-3-羥基哌啶。8. 根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述輔因子是NADP或NAD。9. 根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述氫供體是異丙醇。10. 根據權利要求7所述的方法，其特征在于，制備反應在pH7.0~9.0的水相緩沖液中 進行，溫度為25°C~45°C。
【文檔編號】C12N9/04GK105861457SQ201610365158
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月26日
【發(fā)明人】吳家權, 張海軍, 高敏奇, 周平, 王峰, 歐陽瑩, 李莉, 詹建強
【申請人】無錫佰翱得生物科學有限公司