-脂肪酸脫氫酶基因的新用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域和遺傳工程領(lǐng)域，涉及一種從圓紅冬孢酵母ΥΜ25235分離的Δ12-脂肪酸脫氫酶基因序列(GenBank登錄號(hào):KJ502671.1)在生產(chǎn)α-亞麻酸中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids，PUFAs)是指含有兩個(gè)或兩個(gè)以上雙鍵、碳原子數(shù)為18?22的直鏈脂肪酸。很多研宄表明，諸如花生四烯酸AA (Arachidonic acid ARA，20: 4n_6)、二十碳五稀酸 EPA (Eicosapentaenoic acid，C20: 5n_3)和二十二碳六稀酸DHA (Docosahexaenoic acid，22: 6n_3)等長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸是細(xì)胞膜的重要組成成分，同時(shí)也是動(dòng)物和人體中激素類(Hormone-like)生物活性物質(zhì)的前體，在細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能調(diào)節(jié)、抗腫瘤抗炎、促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、防止心腦血管疾病、有利于大腦視網(wǎng)膜形成、免疫調(diào)節(jié)和基因表達(dá)等很多重要的生理調(diào)節(jié)功能。
[0003]PUFAs廣泛存在于各種生物中，其合成是從18C的飽和脂肪酸合成途徑上擴(kuò)展的，在真核生物中飽和的硬脂酸(Stearic acid)經(jīng)過Δ9-脂肪酸脫氫酶的催化轉(zhuǎn)化成油酸(Oleic acid，0A)，然后經(jīng)Δ 12-脂肪酸脫氫酶的催化進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成亞油酸(Linoleic acid，LA)，后者進(jìn)一步進(jìn)入η_3和η_6途徑在不同脂肪酸脫氫酶(Fatty aciddesaturease)和延長(zhǎng)酶(Elongase)交替催化下，合成各種不同的PUFAs，因此Δ 12-脂肪酸脫氫酶催化合成LA是PUFAs合成關(guān)鍵步驟。
[0004]Δ 12-脂肪酸脫氫酶(Δ 12-fatty acid desaturases)又稱油酸脫氫酶(oleatedesaturases)屬于一類膜整合酶，由于分離和鑒定膜結(jié)合蛋白的難度很大，因此很難得到包括Λ12-脂肪酸脫氫酶在內(nèi)的各種膜結(jié)合蛋白性質(zhì)脫氫酶高級(jí)機(jī)構(gòu)，而只能通過對(duì)酶的核苷酸序列進(jìn)行初步研宄，或者在異源的受體內(nèi)表達(dá)來研宄酶的活性。序列對(duì)比的結(jié)果表明，編碼Λ 12-脂肪酸脫氫酶的核苷酸序列具有共同的機(jī)構(gòu)特性:存在三個(gè)組氨酸保守區(qū)，形成四次跨膜的結(jié)構(gòu)，這些都是維持脫氫酶所必須的。
[0005]自首次從耐冷的藍(lán)細(xì)菌(Synechocystis sp.)PCC6803中克隆到Δ12-脂肪酸脫氫酶基因以來，已經(jīng)從不同植物、動(dòng)物和微生物中分離到很多類似的功能基因序列，功能分析結(jié)果表明Λ12-脂肪酸脫氫酶主要功能是在含有I個(gè)雙鍵油酸(Λ 9)的第12和13位碳原子之間插入一個(gè)雙鍵，形成含有2個(gè)雙鍵的亞油酸(Δ 9，12)。但是，近年來對(duì)一些真菌和原生動(dòng)物來源的Λ12-脂肪酸脫氫酶體外功能驗(yàn)證結(jié)果表明，該酶具有多功能特點(diǎn)。比如線蟲(Caenorhabditis elegans) Δ 12-脂肪酸脫氫酶CeFAT-2具有雙功能的Δ 12/Δ 15-脂肪酸脫氫酶活性，其可以催化油酸同時(shí)形成亞油酸和α-亞麻酸；高山被孢霉(Mortierellaalpina) IS-4中的ω 3_脂肪酸脫氫酶(MAW3)也被證明具有三功能的Δ 12/Λ 15/ω 3_脂肪酸脫氫酶活性。這些表明，某些生物可以利用同一個(gè)脫氫酶就可以合成多種PUFAs，屬于適應(yīng)性進(jìn)化。
[0006]目前由于PUFAs在人類健康中的重要作用，其市場(chǎng)需求也迅速增長(zhǎng)。盡管有些PUFAs的生產(chǎn)已經(jīng)產(chǎn)業(yè)化，還有許多也在加緊開發(fā)利用之中，但是除了 LA外，現(xiàn)有來源在產(chǎn)量和質(zhì)量上都不能滿足日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求。因此，從不同生物中克隆PUFAs合成相關(guān)的脂肪酸脫氫酶基因，再與不同表達(dá)載體連接后轉(zhuǎn)入不同的宿主細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，利用宿主產(chǎn)生各種特定PUFAs具有極大應(yīng)用前景。發(fā)掘PUFAs合成的高效、特異性新基因，也為新一代轉(zhuǎn)基因脂肪酸產(chǎn)品的品質(zhì)改良奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種Λ12-脂肪酸脫氫酶基因的新用途，即利用圓紅冬孢酵母YM25235 Δ12-脂肪酸脫氫酶基因生產(chǎn)α -亞麻酸的應(yīng)用，該基因在GenBank登錄號(hào)為KJ502671.1o
[0008]可用本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法來構(gòu)建含編碼圓紅冬孢酵母ΥΜ25235 Δ 12-脂肪酸脫氫酶的核苷酸序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯調(diào)控元件的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等[Sambroook, et al, Molecular Cloning, aLaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989]。所述的編碼圓紅冬孢酵母YM25235 Δ 12-脂肪酸脫氫酶的核苷酸序列可有效連接到表達(dá)載體的恰當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。這些啟動(dòng)子的代表性例子有:大腸桿菌的Iac或trp啟動(dòng)子；λ噬菌體的PL啟動(dòng)子；真核啟動(dòng)子包括CMV早期啟動(dòng)子、HSV胸苷激酶啟動(dòng)子、早期和晚期SV40啟動(dòng)子、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞或其病毒中表達(dá)的啟動(dòng)子。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子等。在載體中插入增強(qiáng)子序列將會(huì)使其在高等真核細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄得到增強(qiáng)。增強(qiáng)子是DNA表達(dá)的順式作用因子，通常大約有10_300bp，作用于啟動(dòng)子以增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄。如腺病毒增強(qiáng)子。
[0009]本發(fā)明提供一種含有Λ 12-脂肪酸脫氫酶基因或上述重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，該細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞、植物細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞，或這些宿主細(xì)胞的后代，宿主細(xì)胞的代表性例子有:大腸桿菌；真菌細(xì)胞或酵母；植物細(xì)胞如油菜、煙草、大豆；昆蟲細(xì)胞如果蠅S2或Sf9 ;動(dòng)物細(xì)胞如CH0、COS或Bowes黑素瘤細(xì)胞等。
[0010]本發(fā)明所述應(yīng)用中還包括將圓紅冬孢酵母YM25235 Δ 12-脂肪酸脫氫酶基因與載體連接后轉(zhuǎn)化至微生物細(xì)胞體內(nèi)生產(chǎn)α -亞麻酸和其他多不飽和脂肪酸，具有產(chǎn)物特異性高、生產(chǎn)周期短、生產(chǎn)不受場(chǎng)地、氣候、季節(jié)的影響及利用不同的菌種和培養(yǎng)基適合開發(fā)功能油脂等優(yōu)點(diǎn)，可以用于商業(yè)化生產(chǎn)，直接改善油脂品質(zhì)，更加具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明應(yīng)用基因工程技術(shù)構(gòu)建特異性生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的轉(zhuǎn)基因酵母細(xì)胞生產(chǎn)不飽和脂肪酸，具有操作簡(jiǎn)單、成本低、可行性高等優(yōu)點(diǎn)，為新一代轉(zhuǎn)基因脂肪酸產(chǎn)品的品質(zhì)改良奠定基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0011]圖1為本發(fā)明所構(gòu)建的釀酒酵母表達(dá)載體PY3RKD12 ；
圖2為本發(fā)明含PYES3/CT空載體的轉(zhuǎn)基因酵母的氣相色譜圖；
圖3為本發(fā)明含重組質(zhì)粒PY3RKD12的轉(zhuǎn)基因酵母的氣相色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0012]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明保護(hù)范圍不局限于所述內(nèi)容，實(shí)施例中使用的試劑和方法，如無特殊說明，均采用常規(guī)試劑和使用常規(guī)方法。
[0013]實(shí)施例1:參考酵