黃脂菌素b及其制備方法和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及新抗生素制備領(lǐng)域，具體涉及一種黃脂菌素類似物一一黃脂菌素B的 制備方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 黃脂菌素（Xantholipin)是2003年從中國渤海灣的沙土中分離得到的灰黃鏈霉 菌（Streptomycesflavogriesus)的發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)的。黃脂菌素及其類似物為一種占噸酮 (xanthone)類抗生素。占噸酮類抗生素是一類具有特定結(jié)構(gòu)的微生物次級代謝產(chǎn)物，此類 抗生素生物活性包括抑制細菌，真菌及細胞毒性，其活性位點主要作用于細胞壁，能夠與合 成細胞壁的前體物質(zhì)產(chǎn)生競爭性抑制，從而干擾細胞壁的合成。
[0003] 研究證實黃脂菌素對革蘭氏陽性菌具有較廣泛的抑制作用，同時實驗表明其可抑 制肝纖維化，腎小球腎炎，腎間職腎炎等病癥中熱休克蛋白HSP47的大量表達，從而可作為 此類病癥的潛力藥物。
[0004] 絨毛鏈霉菌（Streptomycesflocculus)CGMCC4. 1223此前已被證實可作為鏈黑 菌素的產(chǎn)生菌。我們利用分子生物學(xué)原理與技術(shù)，從這株鏈霉菌中獲得了鏈黑菌素生物合 成基因簇，并在基因水平對鏈黑菌素的生物合成基因簇進行選擇性失活獲得相應(yīng)的突變菌 株，并對該突變菌株進行發(fā)酵，首次從其代謝產(chǎn)物中分離到黃脂菌素和黃脂菌素B。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明的目的提供一種新的黃脂菌素類似物一黃脂菌 素B及其制備方法和在制備抗腫瘤和抗菌藥物中的應(yīng)用。絨毛鏈霉菌（Streptomyces fl〇CCUlUS)CGMCC4. 1223此前已被證實可作為鏈黑菌素的產(chǎn)生菌。本發(fā)明利用分子生物學(xué) 原理與技術(shù)，從這株鏈霉菌中獲得了鏈黑菌素生物合成基因簇，并在基因水平對鏈黑菌素 的生物合成基因簇進行選擇性失活獲得相應(yīng)的突變菌株，并對該突變菌株進行發(fā)酵，首次 從其代謝產(chǎn)物中分離得到了黃脂菌素及其類似物一黃脂菌素B。
[0006] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0007] 本發(fā)明提供了一種黃脂菌素B，其結(jié)構(gòu)式如式（I)所示：
[0008]
[0009]本發(fā)明還提供了一種黃脂菌素B的制備方法，所述制備方法包括構(gòu)建突變株ΔstnR的步驟和對所述突變株△stnR發(fā)酵產(chǎn)生含黃脂菌素B發(fā)酵液的步驟。
[0010] 優(yōu)選地，所述構(gòu)建突變株ΔstnR的步驟具體如下：
[0011] 以絨毛鏈霉菌（Streptomycesflocculus)CGMCC4. 1223作為出發(fā)菌株，克隆得到 鏈黑菌素生物合成基因簇；
[0012] 針對所述鏈黑菌素生物合成基因簇中的stnR基因設(shè)計失活引物、進行選擇性失 活，并獲得PCR產(chǎn)物；所述失活引物如SEQIDNo. 1、SEQIDNo. 2所示；
[0013] 將所述PCR產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coliBW25113/pIJ790/pLS1153中，抽提 得突變質(zhì)粒PLS1154;
[0014] 用所述突變質(zhì)粒pLS1154轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliET12567/pUZ8002中，構(gòu)建大腸桿 菌E.coliET12567/pUZ8002/pLS1154 ;
[0015] 接合轉(zhuǎn)移平板共培養(yǎng)所述大腸桿菌E.coliET12567/pUZ8002/pLS1154和絨毛鏈 霉菌（Streptomycesflocculus)CGMCC4. 1223,即得突變株ΔstnR。
[0016] 優(yōu)選地，步驟C中，所述發(fā)酵液分離純化具體為：將發(fā)酵液萃取分離獲得黃脂菌素 B粗提物，再經(jīng)純化制得黃脂菌素B純品。
[0017] 優(yōu)選地，所述發(fā)酵的過程具體包括：先將所述突變株AstnR接種于種子培養(yǎng)基中 培養(yǎng)，然后再轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵，最后向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入大孔樹脂繼續(xù)發(fā)酵，即 得含所述黃脂菌素B的發(fā)酵液。
[0018] 優(yōu)選地，所述接種于種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)的條件為30°C、220rpm、2天；所述轉(zhuǎn)接入 發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵的條件為：30°C、220rmp、2天；所述向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入大孔樹脂繼 續(xù)發(fā)酵的條件為：30°C、220rmp、5天。
[0019] 優(yōu)選地，所述種子培養(yǎng)基（TSBY培養(yǎng)基）為：0xide胰胨豆湯粉30g，酵母粉5g， 10. 3%鹿糖，蒸餾水1000ml。
[0020] 優(yōu)選地，所述發(fā)酵培養(yǎng)基為：葡萄糖25g，黃豆餅粉15g，NaCl5g，KC1 0. 5g， MgS04 · 7H20 0· 25g，K2HP043g，Na2HP04 · 12H20 3g，pH7· 2。
[0021] 優(yōu)選地，所述發(fā)酵后還包括將獲得的發(fā)酵液萃取分離獲得黃脂菌素B粗提物，再 經(jīng)純化制得黃脂菌素B純品的步驟。
[0022] 優(yōu)選地，所述發(fā)酵液萃取分離獲得黃脂菌素B粗提物的具體操作為：將滅菌后的 大孔樹脂加入到發(fā)酵液中，發(fā)酵培養(yǎng)后，分離出大孔樹脂，大孔樹脂經(jīng)中等極性有機溶劑A 洗脫，獲得黃脂菌素B粗提物；所述中等極性有機溶劑A為乙酸乙酯、乙醚、氯仿、二氯甲烷 或者丙酮中的一種。
[0023] 優(yōu)選地，所述的大孔樹脂選取XAD-16型號。
[0024] 優(yōu)選地，所述純化的具體步驟為：
[0025] 將黃脂菌素B粗提物用正相硅膠進行柱層析，用中等極性有機溶劑B與甲醇混合 得到的混合溶液作為流動相梯度洗脫，經(jīng)HPLC分析檢測，收集含有黃脂菌素類似化合物的 餾分，濃縮干燥得到粗分離物A;
[0026] 將粗分離物A經(jīng)反向硅膠（YMOGEL0DS-A球形填料，120A孔徑，50μm粒徑）層 析，用體積濃度為50 %~100 %甲醇水溶液梯度洗脫，經(jīng)HPLC檢測后合并餾分，濃縮干燥得 到分離物B;
[0027] 將分離物B經(jīng)凝膠柱分離，流動相選取甲醇，經(jīng)HPLC檢測后合并，濃縮干燥，即得 純化后的黃脂菌素B;
[0028] 所述中等極性有機溶劑B和甲醇按體積比為100:1~10:1混合；所述中等極性有 機溶劑B為乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷或丙酮中的一種。
[0029] 本發(fā)明還提供了一種可發(fā)酵生產(chǎn)黃曲菌素B的突變株ΔstnR，所述突變株ΔstnR 的構(gòu)建步驟具體如下：
[0030] 以絨毛鏈霉菌（Streptomycesflocculus)CGMCC4. 1223作為出發(fā)菌株，克隆得到 鏈黑菌素生物合成基因簇；
[0031] 針對所述鏈黑菌素生物合成基因簇中的stnR基因設(shè)計失活引物、進行選擇性失 活，并獲得PCR產(chǎn)物；所述失活引物如SEQIDNo. 1、SEQIDNo. 2所示；
[0032] 將所述PCR產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coliBW25113/pIJ790/pLS1153中，抽提 得突變質(zhì)粒PLS1154;
[0033] 用所述突變質(zhì)粒pLS1154轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coliET12567/pUZ8002中，構(gòu)建大腸桿 菌E.coliET12567/pUZ8002/pLS1154 ;
[0034] 接合轉(zhuǎn)移平板共培養(yǎng)所述大腸桿菌E.coliET12567/pUZ8002/pLS1154和絨毛鏈 霉菌（Streptomycesflocculus)CGMCC4. 1223,即得突變株ΔstnR。
[0035] 本發(fā)明還提供了一種黃脂菌素B在制備抗腫瘤和抗菌藥物中的用途。
[0036] 所述黃脂菌素B對耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌Mu50菌株的最低抑菌活性達到 0. 025微克/毫升，比萬古霉素高40倍；對人口腔上皮癌細胞株KB的IC50達到0. 037微 克/毫升，對人原髓細胞白血病細胞HL-60的IC50達到0. 009微克/毫升，對人胃腺癌細 胞（低分化）BGC-803的IC50達到0. 03微克/毫升，人非小細胞肺癌細胞A549的IC50達 到0. 08微克/毫升，人乳腺癌細胞MCF-7的IC50達到0. 09微克/毫升。
[0037] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：
[0038] 1、本發(fā)明從絨毛鏈霉菌（Streptomycesflocculus)CGMCC4. 1223的突變株中首次 分離得到了黃脂菌素以及其類似物一黃脂菌素B。豐富了黃脂菌素類化合物的結(jié)構(gòu)多樣 性，也為黃脂菌素及其類似物黃脂菌素B的制備和應(yīng)用研究提供了新的材料和新技術(shù)。
[0039] 2、本發(fā)明所述黃脂菌素B具有良好的抗腫瘤活性和優(yōu)良的抗菌活性特別是多藥 耐藥陽性細菌，因此黃脂菌素B可以開發(fā)成為新的抗腫瘤藥物或抗菌藥物。
【附圖說明】
[0040] 通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發(fā)明的其它特征、 目的和優(yōu)點將會變得更明顯：
[0041] 圖1為本發(fā)明的黃脂菌素B的化學(xué)結(jié)構(gòu)示意圖；
[0042] 圖2為stnR基因敲除突變株ΔstnR的構(gòu)建示意圖；
[0043] 圖3為stnR基因敲除突變株ΔstnR的基因型驗證圖；其中泳道1為lkb DNAmarker;泳道2為陽性對照（陽性質(zhì)粒pLSl154)的PCR產(chǎn)物；泳道3為陰性對照 (StreptomycesflocculusCGMCC4. 1223 的總DNA)的PCR產(chǎn)物；泳道 4 為stnR基因敲除 中發(fā)生單交換突變株P(guān)CR產(chǎn)物；泳道5-8為stnR基因敲除中發(fā)生雙交換突變株P(guān)CR產(chǎn)物；
[0044] 圖4為突變株ΔstnR發(fā)酵提取物和野生型絨毛鏈霉菌（Streptomycesflocculus) CGMCC4. 1223發(fā)酵提取物的HPLC檢測圖譜；其中，線a為突變株ΔstnR