，用體積濃度為40~100%甲醇水溶液梯度洗脫，經(jīng)HPLC檢測后合并餾 分，獲得粗分離物B;粗分離物B經(jīng)過凝膠柱，使用純甲醇體系洗脫，經(jīng)HPLC檢測后合并，濃 縮干燥，得純化后的黃脂菌素B。
[0077] 黃脂菌素B:黃色晶體，由高分辨質(zhì)譜HR-ESI-MS(m/z536. 0713, [M+H]+)得到其分 子式為C27H1S09NC1。推得黃脂菌素B結(jié)構(gòu)如圖1所示。其1HNMR(600MHz，DMS0-d6)以及13C NMR(150MHz，DMS0-d6)見表1。表1所列核磁數(shù)據(jù)證實(shí)了黃脂菌素B的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
[0078] 表1黃脂菌素B的1Η和3CNMR及必要的2DNMR數(shù)據(jù)
[0079]
[0081] 由上各實(shí)施例可知，本發(fā)明是對絨毛鏈霉菌（StreptomycesflocculusCGM CC4. 1223)中克隆得到的鏈黑菌素生物合成基因簇進(jìn)行選擇性敲除，獲得氨基轉(zhuǎn)移酶stnR 敲除的基因突變株AstnR。對該突變菌株進(jìn)行發(fā)酵，并對其代謝產(chǎn)物采用正相硅膠、反向硅 膠、凝膠等柱層析方法以及HPLC等色譜技術(shù)操作，從突變株△stnR中分離得到黃脂菌素以 及一個(gè)新的黃脂菌素類似物一黃脂菌素B。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一個(gè)具有優(yōu)良的抗腫瘤和抗菌活 性的天然化合物，為抗腫瘤和抗菌藥物篩選提供候選藥物資源。
[0082]實(shí)施例4、昔脂菌素B的藥效驗(yàn)證試驗(yàn)
[0083] 1)抗菌活性測試
[0084] 以96孔板法測黃脂菌素B抗菌活性。用DMS0溶解黃脂菌素B，并配置12. 8mg/ml 的母液。取少量母液，用發(fā)酵培養(yǎng)基將黃脂菌素B濃度稀釋至6. 4μg/ml作為起始濃度。取 100μ1黃脂菌素B濃度為6. 4μg/ml的培養(yǎng)基加入第一個(gè)孔中，依次以二分法的形式梯度 稀釋至0. 003125μg/ml，并設(shè)置一組不含黃脂菌素B的空白試驗(yàn)。每孔加入5μ1耐甲氧西 林的金黃色葡萄球菌Mu50種子液，在37°C搖床中培養(yǎng)16小時(shí)后用酶標(biāo)儀測其旋光度，記錄 結(jié)果。
[0085] 結(jié)果顯示黃脂菌素B對耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌Mu50菌株的最低抑菌活性 達(dá)到0. 025微克/毫升，比萬古霉素高40倍。
[0086] 2)抗腫瘤活性測試
[0087] 以MTT法分別測定了黃脂菌素B對人口腔上皮癌細(xì)胞株KB、人原髓細(xì)胞白血病 細(xì)胞HL-60、人胃腺癌細(xì)胞（低分化）BGC-803、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的抗腫瘤活性。具體步驟如下：
[0088] 將1.Omg黃脂菌素B溶解于1mlDMS0中，得到濃度為lmg/ml的母液。再用磷酸緩 沖液作梯度稀釋，得到濃度分別為 1〇〇μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、(λ1μg/ml、0· 01μg/ml、 0.001yg/ml的稀釋樣品；取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，胰酶消化、收集、離心后重懸，調(diào)節(jié)細(xì) 胞懸浮液密度約為IX105細(xì)胞/ml。在96孔板中，設(shè)置陰性對照孔，受試藥孔。每孔加入 90μ1細(xì)胞，于37°C、5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6小時(shí)。將稀釋好的黃脂菌素B加入相應(yīng)的 平底96孔板中，每孔10μ1，陰性對照孔不加，繼續(xù)于37 °C、5 %C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48h 后，每孔中加入1〇μ1 5mg/mlMTT溶液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中保溫4小時(shí)。每孔加入100μΙ溶 解液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中保溫過夜，使生成的甲臢晶體充分溶解。測定570nm光吸收值。最后 通過軟件計(jì)算樣品對各腫瘤細(xì)胞的IC5。。
[0089]其中磷酸緩沖液的配方為：NaCl8g，KC1 0· 2g，Na2HP04L15g，ΚΗ2Ρ040 · 2g，溶于 1L 雙蒸水，121°C高壓消毒20min，4°C保存。MTT(AMRESCO)溶液配方：用磷酸緩沖液配成5mg/ ml溶液。溶解液配方：每100ml純水含SDS10g，異丁醇5ml，濃鹽酸0.1ml。
[0090] 測試結(jié)果如表2所示。
[0091] 表2樣品在體外對多種腫瘤細(xì)胞株的ICM(μg/ml)
[0092]
[0093] 從表2的結(jié)果可知，黃脂菌素B具有良好的抗腫瘤活性。
[0094] 以上對本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述 特定實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，這并不影 響本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種黃脂菌素B，其特征在于，其結(jié)構(gòu)式如式（I)所示：2. -種如權(quán)利要求1所述的黃脂菌素B的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括構(gòu) 建突變株A stnR的步驟和對所述突變株Δ stnR發(fā)酵產(chǎn)生含黃脂菌素B發(fā)酵液的步驟。3.如權(quán)利要求2所述的黃脂菌素B的制備方法，其特征在于，所述構(gòu)建突變株Δ stnR 的步驟具體如下： W絨毛鏈霉菌（Str巧tomycesflocculus)CGMCC4. 1223作為出發(fā)菌株，克隆得到鏈黑 菌素生物合成基因簇； 針對所述鏈黑菌素生物合成基因簇中的StnR基因設(shè)計(jì)失活引物用于進(jìn)行選擇性失 活，并獲得PCR產(chǎn)物；所述失活引物如SEQIDNo.1、SEQIDNo. 2所示； 將所述PCR產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入大腸桿菌E. coli BW25113/pIJ790/pLS1153中，抽提得突 變質(zhì)粒PLS1154 ; 用所述突變質(zhì)粒PLS1154轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coli ET12567/PUZ8002中，構(gòu)建接合轉(zhuǎn)移供 體大腸桿菌E. coli ET12567/pUZ8002/pLS1154 ; 接合轉(zhuǎn)移平板共培養(yǎng)所述大腸桿菌E. coli ET12567/pUZ8002/pLSl 154和絨毛鏈霉菌(Str巧tomyces flocculus) CGMCC4. 1223,即得突變株Δ stnR。4. 如權(quán)利要求2所述的黃脂菌素B的制備方法，其特征在于，所述發(fā)酵的過程具體包 括：先將所述突變株AstnR接種于種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后再轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā) 酵，最后向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入大孔樹脂繼續(xù)發(fā)酵，即得含所述黃脂菌素B的發(fā)酵液。5. 如權(quán)利要求4所述的黃脂菌素B的制備方法，其特征在于，所述接種于種子培養(yǎng) 基中培養(yǎng)的條件為3(TC、220rpm、2天；所述轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵的條件為：3(TC、 220rmp、2天；所述向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入大孔樹脂繼續(xù)發(fā)酵的條件為：30°C、220rmp、5天。6. 如權(quán)利要求2或4所述的黃脂菌素B的制備方法，其特征在于，所述發(fā)酵后還包括將 獲得的發(fā)酵液萃取分離獲得黃脂菌素B粗提物，再經(jīng)純化制得黃脂菌素B純品的步驟。7. 如權(quán)利要求6所述的黃脂菌素B的制備方法，其特征在于，所述發(fā)酵液萃取分離獲得 黃脂菌素B粗提物的具體操作為：將滅菌后的大孔樹脂加入到發(fā)酵液中，發(fā)酵培養(yǎng)后，分離 出大孔樹脂，大孔樹脂經(jīng)中等極性有機(jī)溶劑A洗脫，獲得黃脂菌素B粗提物；所述中等極性 有機(jī)溶劑A為乙酸乙醋、乙酸、氯仿、二氯甲燒或者丙酬中的一種。8. 如權(quán)利要求6所述的黃脂菌素B的制備方法，其特征在于，所述純化的具體步驟為： 將黃脂菌素B粗提物用正相硅膠進(jìn)行柱層析，用中等極性有機(jī)溶劑B與甲醇混合得到 的混合溶液作為流動相洗脫，濃縮干燥得到粗分離物A; 將粗分離物A經(jīng)反向硅膠層析，用甲醇水溶液洗脫，濃縮干燥得到粗分離物B; 將粗分離物B經(jīng)凝膠柱分離，流動相選取甲醇，濃縮干燥即得黃脂菌素B純品。 所述的中等極性有機(jī)溶劑B和甲醇按體積比為100:1~10:1混合；所述中等極性有機(jī) 溶劑B為乙酸乙醋、氯仿、二氯甲燒或丙酬中的一種。9. 一種可發(fā)酵生產(chǎn)如權(quán)利要求1所述的黃曲菌素B的突變株ΔstnR，其特征在于，所 述突變株ΔstnR的構(gòu)建步驟具體如下： W絨毛鏈霉菌（Str巧tomycesflocculus)CGMCC4. 1223作為出發(fā)菌株，克隆得到鏈黑 菌素生物合成基因簇； 針對所述鏈黑菌素生物合成基因簇中的StnR基因設(shè)計(jì)失活引物用于進(jìn)行選擇性失 活，并獲得PCR產(chǎn)物；所述失活引物如SEQIDNo. 1、SEQIDNo. 2所示； 將所述PCR產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coliBW25113/pIJ790/pLS1153中，抽提得突 變質(zhì)粒PLS1154 ; 用所述突變質(zhì)粒PLS1154轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliET12567/PUZ8002中，構(gòu)建大腸桿菌 E.coliET12567/pUZ8002/pLS1154 ； 接合轉(zhuǎn)移平板共培養(yǎng)所述大腸桿菌E.coliET12567/pUZ8002/pLSl154和絨毛鏈霉菌(Streptomycesflocculus)CGMCC4. 1223,即得突變株ΔstnR。10. -種如權(quán)利要求1所述的黃脂菌素B在制備抗腫瘤和抗菌藥物中的用途。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種黃脂菌素B及其制備方法和用途。該化合物的結(jié)構(gòu)式如下所示：所述制備方法包括構(gòu)建突變株ΔstnR的步驟和對所述突變株ΔstnR發(fā)酵產(chǎn)生含黃脂菌素B發(fā)酵液的步驟，首次制得一種新的黃脂菌素類似物--黃脂菌素B。所述黃脂菌素B具有良好的生物活性，可用于制備抗腫瘤和抗菌藥物，且本發(fā)明首次從鏈黑菌素產(chǎn)生菌中分離得到黃脂菌素類化合物，為黃脂菌素類化合物的制備和藥用研究提供了新材料,為抗腫瘤和抗菌藥物篩選提供藥物資源。
【IPC分類】C12N15/03, C12P17/18, A61P31/04, C12R1/465, A61P35/00, C07D491/16
【公開號】CN105237544
【申請?zhí)枴緾N201510653794
【發(fā)明人】林雙君, 鄧子新, 吳思凡, 沃靜
【申請人】上海交通大學(xué)
【公開日】2016年1月13日
【申請日】2015年10月10日