一種對乙醇耐受性顯著提高的集胞藻pcc6803藻株及其構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種對乙醇耐受性顯著提高的集胞藻PCC6803藻株及其構(gòu)建方法，屬于工業(yè)微生物領(lǐng)域。本發(fā)明通過同源重組的方法對集胞藻PCC6803中的sll0687基因進行敲除，得到一種對乙醇耐受性顯著提高的集胞藻PCC6803藻株ISm5。在1.5％(v/v)的乙醇脅迫下，該藻株的生長狀態(tài)明顯優(yōu)于野生型藻株。本發(fā)明得到的乙醇耐受性藻株對構(gòu)建生產(chǎn)燃料乙醇的基因工程菌具有重要的理論和實際意義，具有廣泛的應(yīng)用前景。
【專利說明】
一種對乙醇耐受性顯著提高的集胞藻PCC6803藻株及其構(gòu)建 方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于工業(yè)微生物領(lǐng)域，具體涉及一種對乙醇耐受性顯著提高的集胞藻 PCC6803藻株及其構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 為了應(yīng)對日益嚴重的能源危機，作為生物燃料的乙醇成為替代石油燃料的選擇之 一。由于異養(yǎng)發(fā)酵產(chǎn)生乙醇需要糧食農(nóng)作物作為燃料，乙醇需求的增加會加劇糧食短缺問 題。利用可以進行光合作用的藍藻作為生物反應(yīng)器將C0 2轉(zhuǎn)化成乙醇，是解決此問題的重要 方案。集胞藻PCC6803易于進行轉(zhuǎn)基因操作，是進行該研究良好的基因工程菌。例如將 Zymomonas mobilis中的丙酮酸脫羧酶(pdc)基因和乙醇脫氫酶Il(adh)基因?qū)爰?PCC6803中，并以psbAII啟動子驅(qū)動這兩個基因表達，可以使集胞藻PCC6803產(chǎn)生低濃度的 乙醇。
[0003] 但是目前轉(zhuǎn)基因集胞藻PCC6803產(chǎn)生的乙醇含量還不能滿足乙醇工業(yè)化生產(chǎn)的要 求，其中的一個關(guān)鍵因素就是集胞藻PCC6803對乙醇的耐受能力差。在含有1.5% (v/v)乙醇 的培養(yǎng)基中，集胞藻PCC6803細胞會發(fā)生聚集，生長速率降低50%以上。因此，開發(fā)對乙醇耐 受性更好的集胞藻PCC6803基因工程菌是利用光合作用工業(yè)化生產(chǎn)乙醇的關(guān)鍵。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種對乙醇耐受性 顯著提高的集胞藻PCC6803藻株。該藻株可用于構(gòu)建生產(chǎn)燃料乙醇的基因工程菌。
[0005] 本發(fā)明的另一目的是提供一種對乙醇耐受性顯著提高的集胞藻PCC6803藻株的構(gòu) 建方法。
[0006] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0007] -種對乙醇耐受性顯著提高的集胞藻PCC6803藻株的構(gòu)建方法，包括如下步驟：
[0008] (1)以序列表中SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2為上、下游引物，以野生型集胞藻 PCC6803基因組為模板，通過PCR擴增得到S110687基因上游序列sigl-up，如序列表中SEQ ID N0:7所示；以SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4為上、下游引物，以野生型集胞藻PCC6803基因 組為模板，通過PCR擴增得到S110687基因下游序列sigl-down，如SEQ ID N0:8所示；以SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6為上、下游引物，以p⑶rouet-1質(zhì)粒為模板，通過PCR擴增得到包含 鏈霉素基因及其上下游部分序列Snf，如SEQ ID NO:9所示；
[0009] (2)以限制性內(nèi)切酶EcoRI和ΚρηΙ處理PUC118載體和步驟（1)得到的sigl-up片段， 將sigl-up插入到pUC118上得到pUC118-up質(zhì)粒；以限制性內(nèi)切酶BamHI和Hindlll處理 pUC118_up 和步驟（1)得到的sigl-down 片段，將sigl-down 插入到 pUCl 18_up 上得到 pUC118_ up-down質(zhì)粒；以限制性內(nèi)切酶BamHI和ΚρηΙ處理pUCl 18-up-down和步驟（1)得到的Sm11片 段，將Snf插入到pUCl 18-up-down上得到pUCl 18-up-down-Snf同源雙交換質(zhì)粒；
[0010] (3)將pUC118-up-down-Snf質(zhì)粒以自然轉(zhuǎn)化的方式轉(zhuǎn)入集胞藻PCC6803中，得到的 轉(zhuǎn)化子以不同濃度的鏈霉素進行篩選，并在DNA水平上進行鑒定，最終得到S110687基因完 全敲除的單克隆藻株，即對乙醇耐受性顯著提高的集胞藻PCC6803藻株，命名為ISm5。
[0011] 一種對乙醇耐受性顯著提高的集胞藻PCC6803藻株，通過上述構(gòu)建方法構(gòu)建得到。 [0012]所述的對乙醇耐受性顯著提高的集胞藻PCC6803藻株ISm5,在含1.5%(v/v)乙醇 的BG11培養(yǎng)基中的生長狀態(tài)明顯優(yōu)于野生型藻株。
[0013] 所述的對乙醇耐受性顯著提高的集胞藻PCC6803藻株可用于構(gòu)建生產(chǎn)燃料乙醇的 基因工程菌。
[0014] 本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點及效果：
[0015] 本發(fā)明通過同源重組的方法對集胞藻PCC6803中的S110687基因進行敲除，得到一 種對乙醇耐受性顯著提高的集胞藻PCC6803藻株ISm5。在1.5%(v/v)的乙醇脅迫下，該藻株 的生長狀態(tài)明顯優(yōu)于野生型藻株。本發(fā)明得到的乙醇耐受性藻株對構(gòu)建生產(chǎn)燃料乙醇的基 因工程菌具有重要的理論和實際意義，具有廣泛的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0016] 圖1是pUC118-up-down-Snf質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0017] 圖2是以SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:3為引物對ISm5藻株進行PCR鑒定的瓊脂糖電 泳圖；圖中泳道1是以野生型基因組為模板，泳道2是以ISm5基因組為模板，Μ為marker，箭頭 指向的位置為2042bp。
[0018] 圖3是集胞藻PCC6803野生型WT和ISm5藻株在1.5%(v/v)乙醇脅迫下的生長曲線 圖，圖中E代表乙醇。
[0019] 圖4是集胞藻PCC6803野生型WT和ISm5藻株在1.5% (v/v)乙醇脅迫下的藻液的顏 色，圖中藻為生長曲線中第4天的狀態(tài)。
[0020] 圖5是集胞藻PCC6803野生型WT和ISm5藻株在1.5% (v/v)乙醇脅迫下的全細胞吸 收圖;A圖為野生型WT，B圖為ISm5和野生型WT乙醇脅迫下的全細胞吸收圖。
【具體實施方式】
[0021] 下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限 于此。
[0022] 本發(fā)明實施例中使用的集胞藻PCC6803野生型藻株從ATCC27184中分離純化得到， ATCC是美國菌種保藏中心的簡稱，27184是菌株編號。質(zhì)粒pUC118購自Takara公司， pCDFDuet-1 購自 Novagen 公司。
[0023] 實施例1
[0024] 同源重組雙交換質(zhì)粒pUC118-up-down-Snf的構(gòu)建：
[0025] (1)插入片段的擴增：
[0026] 以序列表中SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2為上、下游引物，以野生型集胞藻PCC6803 基因組為模板，通過PCR擴增得到S110687基因上游序列sigl-up，如序列表中SEQ ID N0:7 所示；以SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4為上、下游引物，以野生型集胞藻PCC6803基因組為模 板，通過PCR擴增得到S110687基因下游序列sigl-down，如SEQ ID N0:8所示；以SEQ ID N0: 5和SEQ ID NO: 6為上、下游引物，以pCDFDuet-1質(zhì)粒為模板，通過PCR擴增得到包含鏈霉素 基因及其上下游部分序列Snf，如SEQ ID N0:9所示。本發(fā)明中集胞藻PCC6803的基因組提取 采用植物基因組DNA快速提取試劑盒(廣州東勝生物科技有限公司，貨號N1191 )，質(zhì)粒提取 采用高純度質(zhì)粒小量提取試劑盒(廣州東勝生物科技有限公司，貨號N1011)。
[0027] PCR反應(yīng)采用20yL體系：模板lyL，10 XPCR Buffer(Mg2+plus)2yL，dNTP Mixture (各2 · 5mM) 1 · 6yL，上游引物lyL(1 ΟμΜ)，下游引物lyL(1 ΟμΜ)，rTaq酶0 · 2yL，ddH20 13 · 2yL。 向PCR管中加入各反應(yīng)組分，短暫離心后，置于PCR儀上進行擴增反應(yīng)。擴增程序為:預(yù)變性， 94°C，3min;變性，98°C，10s;退火，溫度一般比引物Tm值低5~10°C，時間為15s;延伸，72°C， 每擴增lkb DNA需lmin;循環(huán)，變性-退火-延伸的循環(huán)38個;72°C，5min;16°C，10min。
[0028] PCR產(chǎn)物大小經(jīng)瓊脂糖電泳驗證，與理論長度一致。在進行后續(xù)實驗前，各PCR產(chǎn)物 還需膠回收純化。
[0029] (2)插入片段與質(zhì)粒的酶切連接
[0030] 以限制性內(nèi)切酶EcoRI和ΚρηΙ對步驟（1)得到的sigl-up片段和pUC118載體進行雙 酶切。插入片段的雙酶切采用30yL體系：DNA 10yL，10XBuffer 3yL，兩種快速酶切酶各1μ L，ddH20 15yL。質(zhì)粒的雙酶切采用20yL體系：DNAlOyL，10 X Buffer 2yL，兩種快速酶切酶各 lyL，ddH20 6yL。酶切反應(yīng)溫度為37°C，時間為lh。反應(yīng)結(jié)束后，80°C溫浴5min，滅活酶。酶切 產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，以T4DNA連接酶進行連接反應(yīng)。連接反應(yīng)采用20yL體系:插入片段DNA 12yL，質(zhì)粒DNA 5yL，10 X Buf f er 2yL，酶lyL。連接反應(yīng)溫度為16 °C，反應(yīng)8h后，將連接產(chǎn)物 轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a中。對長出的轉(zhuǎn)化子進行鑒定是否連接成功，連接成功的質(zhì)粒經(jīng) Sanger測序確認，從而得到質(zhì)粒pUCl 18-up。以相同的酶切反應(yīng)和連接反應(yīng)條件，將sigl-down片段和pUCl 18-up質(zhì)粒連接，酶切位點為BamHI和HindllI。對連接成功的質(zhì)粒進行驗 證，從而得到pUCl 18-up-down質(zhì)粒。最后，將Snf片段和pUCl 18-up-down質(zhì)粒連接，酶切位點 為BamHI和ΚρηΙ，最終得到同源重組雙交換質(zhì)粒pUC118-up-down-Snf。
[0031 ] 得到同源重組雙交換質(zhì)粒pUC118-up-down-Snf中sigI-up、sigI_down和Snf的連接 順序如圖1所示。
[0032] 實施例2
[0033]對乙醇耐受性顯著提高的集胞藻PCC6803藻株的獲得：
[0034] (1)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化
[0035] 將pUC118-up-down-Snf質(zhì)粒用0 · 22μηι的微孔濾膜過濾除菌后，裝入2mL無菌離心 管中。向其中加入一定量BG11培養(yǎng)基（已加入HEPES緩沖液），使質(zhì)粒終濃度約為lOng/yL。取 30mL處于對數(shù)期的野生型PCC6803，6000rpm離心7min，去上清。用20mL新鮮BG11培養(yǎng)基重懸 藻泥，6000rpm離心7min，去上清。用含質(zhì)粒的培養(yǎng)基把藻泥重懸。將重懸的藻液在29°C， 150rpm，1400Lux連續(xù)光照培養(yǎng)6h。將藻液涂于鋪有混合纖維濾膜的固體培養(yǎng)基中光照培養(yǎng) 1天(正置培養(yǎng))后，將膜轉(zhuǎn)移至含有l(wèi)〇yg/mL鏈霉素的固體培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)數(shù)天至膜表 面長出單藻落。最后，將長出的藻落轉(zhuǎn)移至含有相同濃度鏈霉素的20mL BG11小瓶培養(yǎng)基中 培養(yǎng)，待長至對數(shù)期后轉(zhuǎn)接。
[0036] (2)藻株篩選
[0037]將（1)中得到的藻液進行轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為29°C，150rpm，1400Lux連續(xù)光照。 轉(zhuǎn)接時，將BG11培養(yǎng)基中抗生素濃度提高到20yg/mL。待長至對數(shù)期再進行轉(zhuǎn)接，以后每次 轉(zhuǎn)接培養(yǎng)基中抗生素的濃度提高l〇yg/mL。當培養(yǎng)基中的抗生素濃度達到50yg/mL時，將藻 液平板劃線。待平板上長出單藻落后，挑取單藻落至含有相應(yīng)抗生素濃度的BG11培養(yǎng)基中 培養(yǎng)。當藻長至對數(shù)期后，提取該藻的基因組。以此基因組為模板，以SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:3為引物進行PCR，同時以野生型基因組作為對照。本發(fā)明中PCR反應(yīng)體系和程序與實施 例1中相同。將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳，鑒定該藻基因組中的S110687基因是否完全被Snf 替換掉。以SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:3為引物，在野生型中擴增得到的片段是S110687基因 及其上下游序列，長度為2042bp;在目標藻株中，擴增得到的片段是Snf基因及S110687基因 的上下游序列，長度為2787bp。若完全替換，藻株篩選完成。否則，繼續(xù)提高抗生素濃度進行 篩選鑒定。篩選得到的S110687基因完全被Snf替換掉的藻株即為對乙醇耐受性顯著提高的 集胞藻PCC6803藻株，命名為ISm5。
[0038] 圖2是以SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:3為引物對ISm5藻株進行PCR鑒定的瓊脂糖電 泳圖，圖中泳道1是以野生型基因組為模板，泳道2是以ISm5基因組為模板。從圖中可以看 出，野生型的片段在2000bp左右，與理論計算的2042bp長度接近；ISm5的擴增片段長度比野 生型的大，位置與理論計算的2787bp的位置接近，同時在2042bp處沒有條帶。除此之外，野 生型和I Sm5的PCR產(chǎn)物的序列均已Sanger測序驗證，與理論一致。這說明，I Sm5中的s 110687 基因已被Snf替換掉。
[0039] 本發(fā)明中所用BG11培養(yǎng)基配方：1L培養(yǎng)基中含有NaN03 1.5g，K2HP〇4 0.04g， MgS〇4.7H20 0.075g，EDTA 0.001g，CaCl2.2H20 0.036g，檸檬酸0.006g，檸檬酸鐵銨 0.006g，Na2C〇3 0.02g，H3B03 0.00286g，MnCl2.4H20 0.00181g，ZnS〇4*7H20 0.000222g， Na2Mo〇4 · 2H20 0.00039g，CuS〇4 · 5H20 0.000079g，Co(N03)2 · 6H2O 0.0000494g。使用時，每 50mL培養(yǎng)基中加入lmL lmo 1/L的HEPES緩沖液(pH=7.5)。配制固體培養(yǎng)基時，再加入2 %的 瓊脂。
[0040] 實施例3
[00411 ISm5藻株在乙醇脅迫下的生長狀態(tài)分析：
[0042] 測定集胞藻PCC6803野生型和實施例2中得到的ISm5藻株在1.5%(v/v)乙醇脅迫 下的生長曲線:將生長至對數(shù)期的藻作為種子液，接種至含有50mL BG11培養(yǎng)基中，每瓶藻 的起始0D73Q = 0.1。連續(xù)培養(yǎng)4天，每天取樣測0D73Q值，繪制生長曲線。培養(yǎng)條件為29°C， 150rpm，1400Lux連續(xù)光照。開始培養(yǎng)時，在野生型和ISm5實驗組的培養(yǎng)基中加入乙醇至終 濃度為1.5% (v/v)。實驗組和對照組各三個平行。
[0043] 集胞藻PCC6803野生型和ISm5藻株在1.5%(v/v)乙醇脅迫下的全細胞吸收光譜測 定:取2mL生長曲線測定中培養(yǎng)至第4天的藻液，用UV-2300紫外分光光度計進行波長掃描， 掃描范圍為400~800nm，掃描速度為400nm/min。測量前，先用BG11培養(yǎng)基進行基線校正。以 波長為橫坐標，以對應(yīng)的0D值為縱坐標作圖繪制全細胞吸收光譜圖。各樣品的全細胞吸收 光譜圖以730nm處的0D值進行歸一化處理。
[0044]圖3為集胞藻PCC6803野生型和ISm5藻株在1.5% (v/v)乙醇脅迫下的生長曲線圖， 圖中WT代表野生型，E代表乙醇。從圖中可以看出，在乙醇脅迫下ISm5的生長曲線明顯高于 野生型。
[0045]圖4為集胞藻PCC6803野生型和ISm5藻株在1.5%(v/v)乙醇脅迫下的藻液的顏色， 圖中藻為生長曲線中第4天的狀態(tài)。從圖中可以看出，乙醇脅迫的野生型顏色與正常培養(yǎng)的 野生型顏色差別較大，乙醇脅迫的野生型的藻的顏色發(fā)黃，顏色淡。而乙醇脅迫的ISm5的藻 顏色與沒有乙醇處理的ISm5藻的顏色接近，無明顯差別。
[0046] 圖5為集胞藻PCC6803野生型和ISm5藻株在1.5%(v/v)乙醇脅迫下的全細胞吸收 圖，A圖為野生型，B圖為ISm5，B圖中的點狀虛線為乙醇脅迫下的野生型。從A圖中可以看出， 在乙醇脅迫下，野生型的葉綠素峰和藻藍蛋白峰顯著降低。在B圖中，乙醇脅迫的ISm5的葉 綠素峰和藻藍蛋白峰與正常條件下的藻相比僅有細微的降低，而比乙醇脅迫下的野生型的 峰顯著高，說明乙醇對ISm5光合作用的影響比野生型小。
[0047] 綜合圖3、圖4和圖5的數(shù)據(jù)可以說明，ISm5對乙醇脅迫的耐受性明顯優(yōu)于野生型。
[0048]上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種對乙醇耐受性顯著提高的集胞藻PCC6803藻株的構(gòu)建方法，其特征在于包括如 下步驟： (1) 以序列表中SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2為上、下游引物，以野生型集胞藻PCC6803 基因組為模板，通過PCR擴增得到S110687基因上游序列sigl-up，如序列表中SEQ ID N0:7 所示；以SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4為上、下游引物，以野生型集胞藻PCC6803基因組為模 板，通過PCR擴增得到S110687基因下游序列sigl-down，如SEQ ID N0:8所示；以SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6為上、下游引物，以pCDFDuet-1質(zhì)粒為模板，通過PCR擴增得到包含鏈霉素 基因及其上下游部分序列Snf，如SEQ ID NO:9所示； (2) 以限制性內(nèi)切酶EcoRI和Κρη I處理pUC 118載體和步驟（1)得到的s i g I -up片段，將 sigl-up插入到pUC118上得到pUC118-up質(zhì)粒；以限制性內(nèi)切酶BamHI和Hindlll處理 pUC118_up 和步驟（1)得到的sigl-down 片段，將sigl-down 插入到 pUCl 18_up 上得到 pUC118_ up-down質(zhì)粒；以限制性內(nèi)切酶BamHI和ΚρηΙ處理pUCl 18-up-down和步驟（1)得到的Sm11片 段，將Snf插入到pUCl 18-up-down上得到pUCl 18-up-down-Snf同源雙交換質(zhì)粒； (3) 將pUCl 18-up-down-Snf質(zhì)粒以自然轉(zhuǎn)化的方式轉(zhuǎn)入集胞藻PCC6803中，得到的轉(zhuǎn)化 子以不同濃度的鏈霉素進行篩選，并在DNA水平上進行鑒定，最終得到S110687基因完全敲 除的單克隆藻株，即對乙醇耐受性顯著提高的集胞藻PCC6803藻株，命名為ISm5。2. -種對乙醇耐受性顯著提高的集胞藻PCC6803藻株，其特征在于通過權(quán)利要求1所述 的構(gòu)建方法構(gòu)建得到。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的對乙醇耐受性顯著提高的集胞藻PCC6803藻株，其特征在于： 所述的對乙醇耐受性顯著提高的集胞藻PCC6803藻株，在含1.5%v/v乙醇的BG11培養(yǎng)基中 的生長狀態(tài)明顯優(yōu)于野生型藻株。4. 權(quán)利要求2或3所述的對乙醇耐受性顯著提高的集胞藻PCC6803藻株的應(yīng)用，其特征 在于:所述的對乙醇耐受性顯著提高的集胞藻PCC6803藻株用于構(gòu)建生產(chǎn)燃料乙醇的基因 工程菌。
【文檔編號】C12N15/65GK106086055SQ201610478393
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月23日
【發(fā)明人】陳谷, 丁清龍
【申請人】華南理工大學