本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種大腸桿菌高效表達(dá)凝血酶激活的纖溶抑制物(TAFI)重組抗原及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

隨著社會的不斷發(fā)展以及人口老齡化的進(jìn)程，血栓性疾病已經(jīng)成為發(fā)病率和死亡率均較高的一種疾病，它嚴(yán)重威脅了患者的健康與生命，現(xiàn)已受到研究人員的廣泛關(guān)注，成為國內(nèi)外醫(yī)學(xué)的研究重點。血栓性疾病的發(fā)生主要與機(jī)體內(nèi)凝血和纖溶系統(tǒng)的失衡有關(guān)。

凝血酶激活的纖溶抑制物(thrombin activated fibrinolysis inhibitor，TAFI)是體內(nèi)纖溶系統(tǒng)的重要組成成分，它是由肝臟合成，含有423個氨基酸殘基，分子量約為56kD的單鏈糖蛋白。在血液中，TAFI以沒有活性的酶原形式存在，當(dāng)出現(xiàn)凝血后，TAFI被凝血酶調(diào)節(jié)蛋白、纖溶酶和蛋白酶等激活成有活性的TAFIa。TAFIa在血液凝固和纖維蛋白溶解的平衡中發(fā)揮著重要作用，它可以切除纖維蛋白羧基端Arg或Lys，抑制纖溶蛋白酶原的激活，從而降低纖溶酶的激活，具有下調(diào)纖溶系統(tǒng)的功能。

天然來源的TAFI資源有限，DNA重組技術(shù)為TAFI的商品化生產(chǎn)提供了一種經(jīng)濟(jì)有效的方式，DNA重組技術(shù)是將外源基因與載體在體外進(jìn)行拼接重組，然后轉(zhuǎn)入受體內(nèi)，使之按照人們的意愿穩(wěn)定遺傳并表達(dá)出新產(chǎn)物或新性狀的分子克隆技術(shù)。目前許多蛋白已經(jīng)通過基因重組技術(shù)在多種異源宿主中成功表達(dá)。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是表達(dá)異源重組蛋白應(yīng)用最為廣泛的系統(tǒng)，與其他表達(dá)系統(tǒng)如酵母表達(dá)系統(tǒng)等相比，其具有能在較短的時間內(nèi)高水平地表達(dá)多種蛋白、發(fā)酵條件易掌控和表達(dá)成本低等優(yōu)勢。

天然TAFI序列直接轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，會產(chǎn)生無活性的包涵體形式。包涵體的形成具有有利的一面，也有不利的一面。有利的一面是包涵體的形成去除了幾乎全部的細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)。同時，因包涵體形成避免了蛋白水解酶對表達(dá)產(chǎn)物的降解而大大提高產(chǎn)率。不利的一面是溶解包涵體進(jìn)行復(fù)性折疊的過程中需要加變性劑和去垢劑，而引起蛋白質(zhì)的不可逆修飾以及性質(zhì)改變，這些試劑價格昂貴，且復(fù)性的操作過程不好控制；另一方面復(fù)性過程常伴有蛋白質(zhì)水解和沉淀，有些還形成異構(gòu)體。因此，通過基因工程方法將目 的蛋白通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)直接表達(dá)成有活性的可溶性蛋白是非常必要的。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種大腸桿菌高效表達(dá)凝血酶激活的纖溶抑制物(TAFI)重組抗原及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術(shù)方案為：

一種大腸桿菌高效表達(dá)凝血酶激活的纖溶抑制物(TAFI)重組抗原，重組抗原氨基酸如序列表Seq ID No.1中所示。

所述重組抗原堿基如序列表Seq ID No.2中所示。

一種大腸桿菌高效表達(dá)凝血酶激活的纖溶抑制物(TAFI)重組抗原的制備方法：

步驟(1)在經(jīng)密碼子優(yōu)化的Seq ID No.2所示基因序列兩端設(shè)計酶切位點，分別為BamH I和Xho I，將該基因連接在pET-41a(+)載體上，得到重組載體(pET41a-p.MD-TAFI)；

步驟(2)將步驟(1)所得構(gòu)建成功的重組表達(dá)載體pET41a-p.MD-TAFI轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建得到重組大腸桿菌，將所得重組大腸桿菌經(jīng)培養(yǎng)純化，得重組抗原。

進(jìn)一步，

(1)種子培養(yǎng)：將所述重組產(chǎn)凝血酶激活的纖溶抑制物(TAFI)的重組大腸桿菌接種于種子培養(yǎng)基中，于30～37℃振蕩培養(yǎng)8～12h，搖床轉(zhuǎn)速150～200r/min；

(2)液體培養(yǎng)：將經(jīng)過步驟(1)培養(yǎng)所得活化種子液按體積百分比3～10％的接種量接種至表達(dá)培養(yǎng)基，于30～37℃振蕩培養(yǎng)4～6h小時，搖床轉(zhuǎn)速150～200r/min；而后再于20～30℃振蕩誘導(dǎo)培養(yǎng)14～22h，搖床轉(zhuǎn)速150～200r/min表達(dá)完畢；

(3)粗提重組抗原：將步驟(2)所得表達(dá)液離心；收集上清液，即為胞外粗提重組抗原；收集菌體細(xì)胞沉淀并超聲破碎，將所得超聲破碎液離心，取上清，即為胞內(nèi)粗提重組抗原。

所述表達(dá)培養(yǎng)基成分按克/升計為：蛋白胨9～11g，酵母粉5～24g，MgCl₂ 0～0.83g，KCl 0～0.186g，ZnCl₂ 0～0.186g，50％的甘油0～20％，50％的蔗糖0～20％，50％的葡萄糖0～20％，其余成分為0.25mol/L Tris-HCl。

所述種子培養(yǎng)基成分按克/升計為：蛋白胨9～11g，酵母粉4～6g，NaCl 9～11g，其余成分為水。

所述步驟(2)活化種子液經(jīng)表達(dá)培養(yǎng)基，于30～37℃振蕩培養(yǎng)后，向培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)劑，進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)；其中，誘導(dǎo)劑的添加量為每升所述表達(dá)培養(yǎng)基0～5g。

一種高效表達(dá)凝血酶激活的纖溶抑制物(TAFI)重組抗原的工程菌，將所述重組載(pET41a-p.MD-TAFI)轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，即獲得高效表達(dá)凝血酶激活的纖溶抑制物(TAFI)重組抗原的工程菌。

所述工程菌經(jīng)高效表達(dá)獲得凝血酶激活的纖溶抑制物(TAFI)重組抗原。

本發(fā)明所具有的優(yōu)點：

本發(fā)明通過基因工程方法將凝血酶激活的纖溶抑制物(TAFI)氨基酸序列進(jìn)行合理化改變，并將該序列進(jìn)行優(yōu)化后通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)凝血酶激活的纖溶抑制物(TAFI)重組抗原。

其中，采用的重組質(zhì)粒所獲得的凝血酶激活的纖溶抑制物(TAFI)重組抗原顯示出較高的活性，為在工業(yè)水平生產(chǎn)出高活性的凝血酶激活的纖溶抑制物(TAFI)奠定了基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1為野生凝血酶激活的纖溶抑制物(TAFI)和優(yōu)化凝血酶激活的纖溶抑制物(TAFI)基因的比對圖。

圖2為優(yōu)化后與優(yōu)化前蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測圖，a為優(yōu)化后預(yù)測圖，b為優(yōu)化前預(yù)測圖。

圖3為培養(yǎng)皿陽性克隆。白色圈注為符合要求的陽性克隆菌株。

圖4為優(yōu)化后與優(yōu)化前表達(dá)產(chǎn)物電泳對比圖，其中，M為蛋白標(biāo)準(zhǔn)，1-2為優(yōu)化氨基酸后的TAFI表達(dá)沉淀和上清液，3-4為優(yōu)化前的沉淀和上清液。

圖5為重組菌所表達(dá)的凝血酶激活的纖溶抑制物(TAFI)的純化結(jié)果圖，其中，M為蛋白標(biāo)準(zhǔn)；1為純化的凝血酶激活的纖溶抑制物(TAFI)；2為誘導(dǎo)的12h上清液。

具體實施方式

下述說明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段，并可依照說明書的內(nèi)容予以實施，以下以本發(fā)明的較佳實施例詳細(xì)說明如后。

本發(fā)明根據(jù)大腸桿菌密碼子的偏好性，優(yōu)化凝血酶激活的纖溶抑制物(TAFI)基因，連接到表達(dá)載體上，并在大腸桿菌中實現(xiàn)了表達(dá)。其步驟為：A、優(yōu)化氨基酸：根據(jù)經(jīng)驗，將目的蛋白部分氨基酸序列進(jìn)行優(yōu)化；B、密碼子優(yōu)化：根據(jù)大腸桿菌密碼子的偏好性，優(yōu)化凝血酶激活的纖溶抑制物(TAFI)基因并合成該序列；C、凝血酶激活的纖溶抑制物(TAFI)基因的制備：由公司根據(jù)優(yōu)化序列合成目的基因。D、重組質(zhì)粒的構(gòu)建：經(jīng)BamH I和Xho I酶切得大小為1203bp的凝血酶激活的纖溶抑制物(TAFI)片段，將其克隆到高拷貝質(zhì)粒pET-41a(+)上，得到重組質(zhì)粒pET41a-p.MD-TAFI；E、工程 菌的構(gòu)建：用轉(zhuǎn)化方法將質(zhì)粒pET41a-p.MD-TAFI導(dǎo)入到E.coilBL21(DE3)，進(jìn)行表達(dá)。

實施例1

凝血酶激活的纖溶抑制物(TAFI)基因密碼子的優(yōu)化

1)根據(jù)大腸桿菌密碼子的偏好性表和經(jīng)驗，對凝血酶激活的纖溶抑制物(TAFI)基因密碼子的優(yōu)化，優(yōu)化堿基序列為Seq ID No.2所示(優(yōu)化的凝血酶激活的纖溶抑制物(TAFI)由生物技術(shù)有限公司合成)，結(jié)果如圖2所示。

Seq ID No.1

(a)序列特征：

*長度：401aa

*類型：氨基酸

*鏈型：單鏈

*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)：直鏈狀

(b)分子類型：蛋白

(c)假設(shè)：否

(d)反義：否

(e)最初來源：人工設(shè)計

Seq ID No.2

(a)序列特征：

*長度：1206bp

*類型：核苷酸

*鏈型：單鏈

*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)：直鏈狀

(b)分子類型：基因

(c)假設(shè)：否

(d)反義：否

(e)最初來源：人工設(shè)計

2)在該基因的兩端設(shè)計酶切位點，分別為BamH I和Xho I，將該基因連接在pET-41a(+)載體上。將構(gòu)建成功的重組表達(dá)載體pET41a-p.MD-TAFI轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)BL21(DE3)中，在培養(yǎng)平板上篩選陽性克隆(參見3)。

將上述鑒定正確的重組陽性克隆接種于種子培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12h小時。將上述培養(yǎng)所得活化種子液按體積百分比6％的接種量接種至表達(dá)培養(yǎng)基，于30℃振蕩培養(yǎng)4～6h小時，搖床轉(zhuǎn)速180r/min；培養(yǎng)至OD₆₀₀＝0.6～0.8，再添加1mM的誘導(dǎo)劑IPTG，于20℃振蕩誘導(dǎo)培養(yǎng)18h，搖床轉(zhuǎn)速160r/min表達(dá)完畢；8000r/min離心5min收集菌體，稱重后加入濕菌種(g)×20倍的PBS緩沖液，進(jìn)行超聲破碎；12000r/min、4℃離心10min，收集上清而后純化(參見圖4)。

上述，種子培養(yǎng)基成分按克/升計為：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，其余成分為水。

表達(dá)培養(yǎng)基成分按克/升計為：蛋白胨20g，酵母粉5g，NaCl0.5g，MgCl₂0.39g，KCl 0.186g，50％的甘油2％，半胱氨酸80mM，其余成分為0.25mol/L Tris-HCl。

實施例2蛋白純化及濃度測定

將上述上清液進(jìn)行純化，方法如下：

(1)配置buffer，配方如下表：

(2)Ni-NTA Column準(zhǔn)備

①溫和顛倒瓶中的Ni-NTA Agarose數(shù)次；

②吸取2mL的樹脂加入15mL離心管中，使樹脂在重力作用下自然沉降，輕柔的吸出上清；

③加入5mL的無菌蒸餾水，溫和的顛倒柱子3min，500xg離心5min，輕柔的吸出上清。

④用bingding buffer重復(fù)上面的步驟。

⑤在Ni柱中加入等體積的bingding buffer，制成50％的勻漿。

(3)樣品與Ni柱結(jié)合

按照每1mL 50％的勻漿y中加入4mL的樣品，室溫下孵育1h。

(4)洗滌和洗脫

①500xg離心5min，輕柔的吸出上清。

②用1mL bingding buffer洗滌柱子，在搖床上溫和震蕩2min，然后500xg離心5min，小心吸出上清。

③用0.5mL elution buffer洗脫柱子，重復(fù)4次，分管收集4次洗脫液，存放4℃。

(5)采用BSA方法測定蛋白濃度為6mg/mL。

實施例3檢測重組凝血酶激活的纖溶抑制物(TAFI)

采用TAFI生化試劑盒(免疫比濁法)在全自動生化分析儀上分別檢測相同濃度的重組凝血酶激活的纖溶抑制物(TAFI)和某公司的重組TAFI,對比反應(yīng)度。

(1)稀釋兩種蛋白至10、15、20μg/mL；

(2)用全自動生化分析儀進(jìn)行檢測，查看反應(yīng)度(表1)；

表1

結(jié)論：從表1可以看出，自產(chǎn)重組蛋白三個濃度的反應(yīng)度均高于某公司，說明在相同條件下自產(chǎn)重組凝血酶激活的纖溶抑制物(TAFI)與某公司相比，活性高。