本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明描述了具有胞外組蛋白毒性抑制作用的多肽A--人源性白蛋白多肽，以及該多肽的氨基酸序列。本發(fā)明還涉及此多肽的制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

組蛋白是真核生物細(xì)胞中染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)蛋白，包括H1、H2A、H2B、H3和H4。其中H2A、H2B、H3、H4作為核心組蛋白與DNA結(jié)合形成核小體，H1則結(jié)合在核小體之間的DNA上。組蛋白一旦由胞內(nèi)異位至胞外則成為胞外組蛋白。組蛋白作為一種普遍存在的核蛋白可以在多種病理情況下通過主動和被動運輸方式被釋放到胞外。胞外組蛋白主要來自如下兩方面：一是由死亡的實質(zhì)組織細(xì)胞釋放。此時，染色質(zhì)降解，細(xì)胞膜破裂、細(xì)胞溶解，大量核內(nèi)組蛋白釋至胞外；二是由白細(xì)胞、特別是中性粒細(xì)胞釋放。在急性期反應(yīng)中性粒細(xì)胞大量急劇增加而形成中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（NETs）時，組蛋白隨DNA和高遷移率族蛋白B（HMGB1）等一起釋放至細(xì)胞外。對組蛋白的研究涉及多種臨床疾病，包括癌癥、炎癥性疾病、缺血性發(fā)作、自身免疫性疾病等，主要用于疾病的診斷分期、預(yù)后及監(jiān)測判斷療效等方面。早在1958年James的研究中就指出組蛋白的毒性作用。越來越多的研究表明胞外組蛋白對機(jī)體的不利主要在于誘導(dǎo)組織細(xì)胞尤其是血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、激活白細(xì)胞和血小板、促進(jìn)異常凝血過程與血栓形成、直接或間接造成炎癥反應(yīng)與免疫反應(yīng)，導(dǎo)致彌散性血管內(nèi)凝血、急性呼吸窘迫綜合征甚至多器官功能障礙綜合征。因此，以組蛋白為靶點進(jìn)行干預(yù)對于胞外組蛋白相關(guān)疾病的預(yù)防與治療具有重要的臨床應(yīng)用價值。

白蛋白是肝實質(zhì)細(xì)胞合成的血漿中含量最多的蛋白質(zhì)，占總蛋白的40~60%。本發(fā)明建立在白蛋白可抑制胞外組蛋白誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞死亡的發(fā)現(xiàn)之上。此外，本發(fā)明根據(jù)該白蛋白序列信息，鑒定并化學(xué)合成一條多肽，即多肽A，研究了其對胞外組蛋白毒性的抑制作用，提出了利用多肽A進(jìn)行人類組蛋白相關(guān)疾病例如敗血癥診治的藥用價值及臨床應(yīng)用價值。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個目的在于公開一種可抑制胞外組蛋白細(xì)胞毒性的人類血清白蛋白來源的多肽A。

所述的多肽A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，具體為：Lys-Phe-Gln-Asn-Ala-Leu-Leu-Val-Arg-Tyr。

本發(fā)明的第二個目的在于提供一種所述人源性多肽A的制備方法。

它包括如下步驟：（1）多肽合成順序是從C端到N端。將2-Chlorotrityl Chloride Resin放入反應(yīng)管中，加15 ml/g（毫升/克）DCM（二氯甲烷），震蕩30分鐘。

（2）接第一個氨基酸。通過沙芯抽濾掉溶劑，加入3倍摩爾過量的Fmoc-Thr(tBu)-OH氨基酸，加入DMF（二甲基甲酰胺）溶解，再加入10倍摩爾過量的DIEA（N,N-二異丙基乙胺），震蕩60分鐘。用甲醇封閉。

（3）脫保護(hù)。去掉DMF，加15 ml/g 20%哌啶DMF溶液，洗滌5分鐘后，去掉，再在15 ml/g 20%哌啶DMF溶液，洗滌15分鐘。

（4）檢測。抽調(diào)哌啶溶液，取十幾粒樹脂，用乙醇洗滌三次，加入檢測試劑檢測。105oC-110oC加熱5分鐘，顏色變?yōu)樯钏{(lán)色即為陽性反應(yīng)。

（5）沖洗樹脂。分別依次用DMF（10 ml/g），DCM（10 ml/g），DMF（10 ml/g）沖洗樹脂兩次。

（6）縮合。保護(hù)氨基酸三倍過量，HBTU（苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯）三倍過量，均用少量DMF溶解，加入反應(yīng)管，立刻加入DIEA十倍過量，反應(yīng)30分鐘。

（7）檢測。取十幾粒樹脂，用乙醇洗滌三次，加入檢測試劑檢測，105oC-110oC加熱5分鐘，無色即為陰性反應(yīng)。

（8）沖洗樹脂。分別依次用DMF（10 ml/g），DCM（10 ml/g），DMF（10 ml/g）沖洗樹脂兩次。

（9）重復(fù)（3）至（6）操作，從右到左依次連接序列中的氨基酸。

（10）抽干，并按照下列方法洗樹脂：DMF（10 ml/g）兩次，甲醇（10 ml/g）兩次，DMF（10 ml/g）兩次，DCM（10 ml/g）兩次，抽干10分鐘。

（11）從樹脂上切割多肽。所用切割液成分為：95% TFA（三氟乙酸）,1%水，2% EDT（巰基乙醇），2%TIS（三異丙基硅烷）；切割時間為：120分鐘。

（12）吹干洗滌。將裂解液用氮氣吹干，乙醚洗滌六次，然后放置常溫?fù)]發(fā)。

（13）分析提純凍干。用高效液相色譜提純多肽粗品；收集多肽溶液放入凍干機(jī)中進(jìn)行濃縮，并凍干制成白色粉末。

本發(fā)明的第三個目的在于提供所述人源性多肽A在胞外組蛋白毒性抑制中的應(yīng)用。多肽A可以直接抑制胞外組蛋白誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞死亡及HUVEC細(xì)胞膜損傷，因而可用于研制多肽相關(guān)藥物，從而防治胞外組蛋白相關(guān)的炎癥、缺血、免疫、腫瘤等疾病（如膿毒癥、敗血癥等）。另外，由于多肽A是人體血清白蛋白的小分子片段，沒有一般化學(xué)藥物的毒副作用，卻具有化學(xué)藥物不可取代的生物相容性和血液相容性。多肽A可以有效抑制HUVEC細(xì)胞中炎癥通路的激活，從而發(fā)揮其對胞外組蛋白毒性的抑制作用，提高胞外組蛋白相關(guān)疾病的長期療效與安全性。因此，多肽A具有較大的藥用價值和廣泛的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1是本發(fā)明檢測細(xì)胞存活率的結(jié)果圖。###表示與空白組相比，p<0.001，有顯著性差異；*表示與200 μg/ml組蛋白處理組相比，p<0.05，有顯著性差異；**表示與200 μg/ml組蛋白處理組相比，p<0.01，有顯著性差異。

圖2是本發(fā)明掃描電鏡下觀察細(xì)胞膜損傷的結(jié)果圖。

圖3是本發(fā)明的Western Blot方法檢測IκB、p38、及磷酸化p38（p-p38）的蛋白表達(dá)水平。

圖4是本發(fā)明的ELISA方法檢測炎癥因子TNFα、IL-6的表達(dá)水平。##表示與空白組相比，p<0.01，有顯著性差異；###表示與空白組相比，p<0.001，有顯著性差異；*表示與200 μg/ml組蛋白處理組相比，p<0.05，有顯著性差異；**表示與200 μg/ml組蛋白處理組相比，p<0.01，有顯著性差異。

序列表為多肽A序列。

具體實施方式

以下結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。

實施例1：多肽A的固相合成。

1.多肽合成順序是從C端到N端。將2-Chlorotrityl Chloride Resin放入反應(yīng)管中，加15 ml/g（毫升/克）DCM（二氯甲烷），震蕩30分鐘。

2.接第一個氨基酸。通過沙芯抽濾掉溶劑，加入3倍摩爾過量的Fmoc-Thr(tBu)-OH氨基酸，加入DMF（二甲基甲酰胺）溶解，再加入10倍摩爾過量的DIEA（N,N-二異丙基乙胺），震蕩60分鐘。用甲醇封閉。

3.脫保護(hù)。去掉DMF，加15 ml/g 20%哌啶DMF溶液，洗滌5分鐘后，去掉，再在15 ml/g 20%哌啶DMF溶液，洗滌15分鐘。

4.檢測。抽調(diào)哌啶溶液，取十幾粒樹脂，用乙醇洗滌三次，加入檢測試劑檢測。105oC-110oC加熱5分鐘，顏色變?yōu)樯钏{(lán)色即為陽性反應(yīng)。

5.沖洗樹脂。分別依次使用DMF（10 ml/g）兩次，DCM（10 ml/g）兩次，DMF（10 ml/g）沖洗樹脂兩次。

6.縮合。保護(hù)氨基酸三倍過量，HBTU（苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯）三倍過量，均用少量DMF溶解，加入反應(yīng)管，立刻加入DIEA十倍過量，反應(yīng)30分鐘。

7.檢測。取十幾粒樹脂，用乙醇洗滌三次，加入檢測試劑檢測，105oC-110oC加熱5分鐘，無色即為陰性反應(yīng)。

8.沖洗樹脂。分別依次使用DMF（10 ml/g），DCM（10 ml/g），DMF（10 ml/g）沖洗樹脂兩次。

9.重復(fù)（3）至（6）操作，從右到左依次連接序列中的氨基酸。

10.抽干，并按照下列方法洗樹脂：DMF（10 ml/g）兩次，甲醇（10 ml/g）兩次，DMF（10 ml/g）兩次，DCM（10 ml/g）。兩次，抽干10分鐘。

11.從樹脂上切割多肽。所用切割液成分為：95% TFA（三氟乙酸），1%水，2% EDT（巰基乙醇），2%TIS（三異丙基硅烷）；切割時間為：120分鐘。

12.吹干洗滌。將裂解液用氮氣吹干，乙醚洗滌六次，然后放置常溫?fù)]發(fā)。

13.分析提純凍干。用高效液相色譜提純多肽粗品；收集多肽溶液放入凍干機(jī)中進(jìn)行濃縮，并凍干制成白色粉末。

實施例2：多肽A抑制胞外組蛋白對HUVEC細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。

1.原代人內(nèi)皮細(xì)胞HUVECs購自ATCC，培養(yǎng)于LSGS-M200培養(yǎng)基。實驗組為接受5 mg/ml或10 mg/ml多肽A及200 μg/ml小牛胸腺組蛋白處理的HUVECs細(xì)胞；對照組為分別接受5 mg/ml或10 mg/ml多肽A、100 μg/ml或200 μg/ml小牛胸腺組蛋白處理的HUVECs細(xì)胞，接受1小時處理后，通過統(tǒng)計細(xì)胞存活率，發(fā)現(xiàn)組蛋白處理導(dǎo)致HUVECs細(xì)胞存活率顯著下降，并呈現(xiàn)濃度依賴性效應(yīng)，而接受多肽A處理后能抑制胞外組蛋白導(dǎo)致的細(xì)胞存活率下降現(xiàn)象。

2.原代人內(nèi)皮細(xì)胞HUVECs購自ATCC，培養(yǎng)于LSGS-M200培養(yǎng)基。實驗組為接受10 mg/ml多肽A和200 μg/ml小牛胸腺組蛋白處理的HUVECs細(xì)胞；對照組為分別接受200 μg/ml小牛胸腺組蛋白或200 μg/ml小牛胸腺組蛋白聯(lián)合20 mg/ml白蛋白處理的HUVECs細(xì)胞，接受1小時處理后，經(jīng)掃描電鏡的觀察發(fā)現(xiàn)，組蛋白處理導(dǎo)致HUVECs細(xì)胞膜的嚴(yán)重?fù)p傷，而接受白蛋白或白蛋白來源的多肽A處理后均能抑制組蛋白導(dǎo)致的細(xì)胞膜損傷現(xiàn)象。

以上數(shù)據(jù)（見圖1，圖2）顯示了多肽A作為組蛋白毒性抑制劑的潛力。

3.針對步驟1中各組HUVECs細(xì)胞，進(jìn)一步提取總蛋白，并進(jìn)行Western Blot驗證外源給予多肽A對胞外組蛋白誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的影響。實驗結(jié)果表明，胞外組蛋白可導(dǎo)致IκB的表達(dá)量下降，p38磷酸化水平升高，而外源給予多肽A可顯著降低胞外組蛋白誘導(dǎo)的NF-κB/p38炎癥信號通路的激活（圖3）；胞外組蛋白可誘導(dǎo)下游炎癥因子TNF-α和IL-6的表達(dá)，而外源給予多肽A可顯著抑制胞外組蛋白的這種作用（圖4）。

4.針對步驟1中各組HUVECs細(xì)胞血清培養(yǎng)基，進(jìn)行ELISA檢測進(jìn)一步驗證步驟3中的外源給予多肽A對組蛋白誘導(dǎo)的炎癥因子TNF-α和IL-6釋放的影響。實驗結(jié)果表明，胞外組蛋白可誘導(dǎo)炎癥因子TNF-α和IL-6的釋放，而外源給予多肽A可顯著抑制胞外組蛋白的這種作用。

綜合以上結(jié)果說明，外源性給予合成的多肽A可明顯抑制胞外蛋白對HUVEC細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用，包括組蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞損傷及炎癥反應(yīng)，用于臨床治療胞外組蛋白相關(guān)疾病具有良好的臨床應(yīng)用前景。

[0001]

<110> 上海懿貝瑞生物醫(yī)藥科技有限公司

<120> 一種具有胞外組蛋白毒性抑制作用的多肽制備方法及用途

<130> 2016

<160> 1

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr

1 5 10