本發(fā)明屬于一種新型蟾蜍毒素衍生物的抗體藥物偶聯(lián)物及其在抗腫瘤作用的方面。蟾蜍毒素衍生物為一類強心劑，后來發(fā)現(xiàn)其具有較好的抗癌作用，但是其強細胞毒性限制了其應(yīng)用。利用現(xiàn)代發(fā)展的adc技術(shù),將其與接頭以及靶向肽連接后，能夠降低其對正常細胞毒性，選擇性的到達癌細胞或組織，達到治療癌癥的目的。
背景技術(shù)：
化療依然是包括手術(shù)、放療、以及靶向療法在內(nèi)的最重要的抗癌手段之一。盡管高效細胞毒素很多,但癌細胞和健康細胞之間微小的差別限制了這些抗癌化合物在臨床上的應(yīng)用。抗體藥物偶聯(lián)物把單克隆抗體和高效細胞毒素完美地結(jié)合到一起,充分利用了前者靶向、選擇性強,后者活性高的特點，同時又消除了前者療效偏低和后者副作用偏大等缺陷。其中抗體是adc的制導(dǎo)系統(tǒng)，能夠靶向性地把效應(yīng)分子輸送到腫瘤細胞，有效地提高了抗體本身對癌細胞的殺傷力。
抗體藥物偶聯(lián)物的概念可以追溯到100年前，adc真正意義上的概念誕生于1958年,但技術(shù)上卻困難重重。第一個現(xiàn)代版的adc直到1975年才被報道，直到上世紀八十年代,adc的開發(fā)隨著非免疫性，尤其是人源化單克隆抗體的開發(fā)才出現(xiàn)重大突破。kadcyla是美國fda批準的治療固體腫瘤的第一個抗體藥物偶聯(lián)物,也是個體化治療的一大突破。
bf211是一種高效細胞毒素，現(xiàn)有技術(shù)中還未有bf211抗體藥物偶聯(lián)物的相關(guān)報道。bf211具有較好的抗肝癌的效果，但是其極大的毒副作用限制了其在抗腫瘤方面的應(yīng)用。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明提出了一種式(b)所示蟾蜍毒素衍生物的抗體藥物偶聯(lián)物及其制備方法，在蟾蜍毒素衍生物bf211上連接一個二肽接頭val‐cit，合成化合物mc‐val‐cit‐pabc‐bf211；然后在mc‐val‐cit‐pabc‐bf211上連接一個具有靶向腫瘤細胞的十三肽，得到式(b)所示化合物；所述蟾蜍毒素衍生物的抗體藥物偶聯(lián)物能夠定向輸送到腫瘤細胞或腫瘤組織，并釋放出藥物bf211，達到定向殺死腫瘤細胞的作用。
本發(fā)明提出的蟾蜍毒素衍生物的抗體藥物偶聯(lián)物為c‐a54‐mc‐val‐cit‐pabc‐bf211:c111h170n22o33s，結(jié)構(gòu)如式(b)所示，
本發(fā)明還提出了一種蟾蜍毒素衍生物的抗體藥物偶聯(lián)物的制備方法，包括：(1)在蟾蜍毒素衍生物bf211上連接一個二肽接頭val‐cit，合成式(a)化合物mc‐val‐cit‐pabc‐bf211：c59h82n8o13，如反應(yīng)式(1)所示：
(2)在式(a)化合物mc-val-cit-pabc-bf211上連接一個具有靶向腫瘤細胞的十三肽，合成式(b)所示的蟾蜍毒素衍生物的抗體藥物偶聯(lián)物c-a54-mc-val-cit-pabc-bf211:c111h170n22o33s，如反應(yīng)式(2)所示：
具體地，所述蟾蜍毒素衍生物的抗體藥物偶聯(lián)物的制備方法為：
(1)以四氫呋喃和n-甲基吡咯烷酮做混合溶劑，加入1當量bf211·hcl和1.1-2.0當量mc-val-cit-pabc-pnp，用1.1-2.0當量diea做堿，室溫反應(yīng)8-10小時，制備得到所述式(a)化合物mc-val-cit-pabc-bf211；
(2)以n,n-二甲基甲酰胺和水做混合溶劑，加入1當量的mc-val-cit-pabc-bf211和1.2-2.5當量的c-a54，反應(yīng)后得到式(b)蟾蜍毒素衍生物的抗體藥物偶聯(lián)物。
所述步驟(1)中，所述bf211·hcl、mc-val-cit-pabc-pnp、diea的摩爾比為1:1.1:1.1-1:2.0:2.0；優(yōu)選地，為1:1.5:1.5。
所述步驟(1)中，所述反應(yīng)的溫度為20℃-35℃；優(yōu)選地，為25℃。
其中，所述步驟(1)中，所述反應(yīng)的時間為8-10小時；優(yōu)選地，為8小時。
所述步驟(2)中，所述mc-val-cit-pabc-bf211、c-a54的摩爾比為1:1.2-1:2.5當量；優(yōu)選地，為1:1.5。
所述步驟(2)中，所述反應(yīng)的溫度為35℃-45℃；優(yōu)選地，為40℃。
所述步驟(2)中，所述反應(yīng)的時間為8-10小時；優(yōu)選地，為10小時。
所述步驟(2)中，所述具有靶向腫瘤細胞的十三肽為cagkgtpslettp，其結(jié)構(gòu)如式(c)所示，
所述制備方法中，步驟(1)結(jié)束后還包括采用制備分離技術(shù)分離純化式(a)化合物的步驟。
所述制備方法中，步驟(2)結(jié)束后還包括采用制備分離技術(shù)分離純化式(b)化合物的步驟。
本發(fā)明的制備分離技術(shù)是指利用不同極性化合物在制備儀上制備柱中吸附性的不同，利用流動相進行洗脫分離的過程。
更具體地，所述式(b)蟾蜍毒素衍生物的抗體藥物偶聯(lián)物的制備方法，包括：
(1)首先合成化合物mc‐val‐cit‐pabc‐bf211：c59h82n8o13，結(jié)構(gòu)如式(a)所示：
化合物mc-val-cit-pabc-bf211在蟾蜍毒素衍生物bf211上連接了一個二肽接頭val-cit，使其具有與蟾蜍毒素衍生物具有相近的抗腫瘤作用。
(2)合成式(b)所示的蟾蜍毒素衍生物的抗體藥物偶聯(lián)物，c-a54-mc-val-cit-pabc-bf211:c111h170n22o33s，
化合物c-a54-mc-val-cit-pabc-bf211是在化合物式(a)mc-val-cit-pabc-bf211的基礎(chǔ)上連接一個具有靶向腫瘤細胞的十三肽，解決了其水溶性差的問題。其抗腫瘤作用相對于式(a)化合物mc-val-cit-pabc-bf211有了一定的提高。
具體地，所述蟾蜍毒素衍生物的抗體藥物偶聯(lián)物的制備方法包括：
(1)式(a)化合物mc-val-cit-pabc-bf211的制備:以四氫呋喃和n-甲基吡咯烷酮做混合溶劑，加入1當量bf211·hcl和1.5當量mc-val-cit-pabc-pnp，用1.5當量diea做堿，25℃反應(yīng)8個小時，制備得到所述式(a)化合物mc-val-cit-pabc-bf211，分離純化后用于下一步反應(yīng)。
(2)式(b)蟾蜍毒素衍生物的抗體藥物偶聯(lián)物c-a54-mc-val-cit-pabc-bf211的制備：以n,n-二甲基甲酰胺和水做混合溶劑，加入1當量的mc-val-cit-pabc-bf211和1.5當量的c-a54，40℃反應(yīng)10小時，得到所述蟾蜍毒素衍生物的抗體藥物偶聯(lián)物c-a54-mc-val-cit-pabc-bf211。
本發(fā)明還提出了式(b)所示蟾蜍毒素衍生物的抗體藥物偶聯(lián)物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提出了式(b)所示蟾蜍毒素衍生物的抗體藥物偶聯(lián)物在制備抗肝癌、胃癌、人原髓細胞白血病藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提出了式(b)所示蟾蜍毒素衍生物的抗體藥物偶聯(lián)物在制備抗bel-7402肝癌細胞、mgc-803胃癌細胞、hl60人原髓細胞白血病細胞藥物中的應(yīng)用。
其中，所述的蟾蜍毒素衍生物的抗體藥物偶聯(lián)物的有效劑量為幾十納摩爾級別即可發(fā)揮對肝癌、胃癌及白血病細胞的殺傷作用。
本發(fā)明還提出了一種藥物組合物，其包括式(b)所示蟾蜍毒素衍生物的抗體藥物偶聯(lián)物和藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明藥物組合物中以式(b)所示蟾蜍毒素衍生物的抗體藥物偶聯(lián)物作為活性成分。根據(jù)本發(fā)明可以將治療有效量的式(b)所示蟾蜍毒素衍生物的抗體藥物偶聯(lián)物和藥學(xué)上允許的任意一種輔料制成藥物組合物，也可以添加其他與式(b)所示蟾蜍毒素衍生物的抗體藥物偶聯(lián)物沒有拮抗作用的抗腫瘤新生藥物。其制劑可以是藥學(xué)上的任意一種劑型，包括但不限于滴劑、片劑、凝膠劑、顆粒劑、膠囊劑、乳劑、丸劑、水劑、口服液、注射液、脂質(zhì)體、栓劑等。
本發(fā)明藥物組合物中可含有常規(guī)藥學(xué)上可接受的輔助物質(zhì)、穩(wěn)定劑、濕潤劑或其它常用的添加劑，例如，乳糖、檸檬酸、酒石酸、硬脂酸、硬脂酸鎂、石膏粉、蔗糖、玉米淀粉、滑石粉、明膠、瓊脂、果膠、花生油、橄欖油、可可脂、乙二醇、抗壞血酸、甘露醇等。
式(b)所示蟾蜍毒素衍生物的抗體藥物偶聯(lián)物可通過口服、腸胃外、吸入式噴霧或通過植入式貯存器給藥?！澳c胃外”包括皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、動脈內(nèi)、滑膜腔內(nèi)、胸骨內(nèi)、鞘內(nèi)、病灶內(nèi)或輸入技術(shù)。
口服可用固體或液體狀的劑量單位，如末劑、散劑、片劑、糖衣劑、膠囊劑、顆粒劑、懸浮劑、溶液劑、糖漿劑、滴劑、舌下含片等劑型進行給藥。
末劑是將本發(fā)明式(b)所示蟾蜍毒素衍生物的抗體藥物偶聯(lián)物磨成適當額細度而制成。散劑是將本發(fā)明式(b)所示蟾蜍毒素衍生物的抗體藥物偶聯(lián)物磨成適當?shù)募毝?，然后與同樣細度的藥用載體(如載體、甘露糖醇之類可食性碳水化合物等)混合制成。根據(jù)需要，也可混入矯味劑、防腐劑、分散劑、著色劑、香料等物質(zhì)。
膠囊劑是將如上所述制成粉末狀的末劑或片劑部分所述的顆?；奈镔|(zhì)填充到明膠膠囊外殼中而制成。也可以將潤滑劑和助流劑等混合到粉末狀物質(zhì)中，然后在膠囊中進行填充操作。若添加助溶劑和崩解劑等，如聚乙二醇，碳酸鈉，可改善膠囊攝取時的藥效。
本發(fā)明還提出了一種化合物mc-val-cit-pabc-bf211其結(jié)構(gòu)如式(a)所示；
本發(fā)明的有益效果包括：本發(fā)明提出的蟾蜍毒素衍生物的抗體藥物偶聯(lián)物，通過將bf211與接頭和靶向肽連接后，能夠定向輸送到腫瘤細胞或腫瘤組織，并釋放出藥物bf211，達到定向殺死腫瘤細胞的作用，具有水溶性好、抗腫瘤效果好的特點。
本發(fā)明蟾蜍毒素衍生物的抗體藥物偶聯(lián)物的制備方法具有收率高、反應(yīng)完成性好、易操作等優(yōu)點，為類似化合物合成提供有效方法。
本發(fā)明中選用的十三肽具有特異性靶向肝癌組織的作用，其屬于小分子化合物，對腫瘤組織的粘附性強，對腫瘤細胞膜的通透性好，克服了現(xiàn)有技術(shù)中使用的單克隆抗體分子量大、通透性差的缺點；選用的二肽接頭val‐cit在正常組織處很穩(wěn)定，而在腫瘤細胞或組織中易被組織蛋白酶b切斷，從而釋放出藥物分子，達到治療癌癥的目的，克服了普通接頭在血液循環(huán)中穩(wěn)定性差、在腫瘤組織中不易被酶剪切的缺點。因此，本發(fā)明制備的化合物蟾蜍毒素衍生物的抗體藥物偶聯(lián)物c‐a54‐mc‐val‐cit‐pabc‐bf211具有較高的意義。
在合成mc‐val‐cit‐pabc‐bf211時，利用mc‐val‐cit‐pabc‐pnp作為原料，其反應(yīng)活性高，使反應(yīng)進行快，且反應(yīng)徹底，和其他合成方法相比收率有了顯著提高；在靶向肽連接過程中，后處理選用制備分離技術(shù)，克服了產(chǎn)物極性大、難分離的弊端，使得到的產(chǎn)物純度高。
具體實施方式
結(jié)合以下具體實施例，對本發(fā)明作進一步的詳細說明。實施本發(fā)明的過程、條件、實驗方法等，除以下專門提及的內(nèi)容之外，均為本領(lǐng)域的普遍知識和公知常識，本發(fā)明沒有特別限制內(nèi)容。
實施例1：mc-val-cit-pabc-bf211的合成
合成反應(yīng):在燒瓶內(nèi)加入260mgmc-val-cit-pabc-pnp和80mgbf211·hcl，用9.6ml四氫呋喃和1.6mln-甲基吡咯烷酮溶解，再加入415.2μldiea,25℃反應(yīng)8個小時。制備分離提純，凍干機干燥，得108.6mg白色固體mc-val-cit-pabc-bf211，收率65.1％。
1hnmr(400mhz,dmso)δ9.94(s,2h),7.97(d,j＝68.7hz,3h),7.87–7.71(m,2h),7.64–7.38(m,4h),7.38–6.96(m,5h),6.78(d,j＝128.0hz,3h),6.23(d,j＝9.3hz,2h),5.92(s,2h),5.31(d,j＝39.7hz,3h),4.83(d,j＝27.8hz,3h),4.82(d,j＝38.0hz,5h),5.11–4.35(m,6h),5.11–4.10(m,9h),5.11–3.44(m,14h),5.11–3.41(m,15h),5.11–2.90(m,65h),5.11–2.56(m,70h),5.11–2.97(m,64h),5.11–2.17(m,83h),5.11–1.98(m,87h),5.11–2.12(m,84h),5.11–2.18(m,83h),5.11–1.55(m,101h),5.11–1.45(m,107h),5.11–0.40(m,158h),0.53(s,5h),0.53(s,5h),-0.03(d,j＝27.8hz,3h),-0.11–-0.60(m,2h).
實施例2蟾蜍毒素衍生物的抗體藥物偶聯(lián)物c-a54-mc-val-cit-pabc-bf211的合成
合成反應(yīng):在燒瓶內(nèi)加入65mgmc-val-cit-pabc-bf211和110.5mgc-a54，用6.5mln,n-二甲基甲酰胺和2.2ml水溶解，油浴控溫40℃反應(yīng)10個小時。制備分離提純，凍干機干燥，得到40.5mg白色固體c-a54-mc-val-cit-pabc-bf211，收率29.2％。
1hnmr(400mhz,dmso)δ9.94(d,j＝42.9hz,18h),8.43(s,3h),8.33(d,j＝52.4hz,5h),9.01–8.14(m,7h),8.18(dd,j＝109.5,56.9hz,9h),9.01–7.90(m,10h),8.02(ddd,j＝69.9,44.3,35.6hz,12h),9.01–7.68(m,13h),9.01–7.66(m,13h),7.66–7.51(m,2h),7.51–7.21(m,3h),6.29(d,j＝9.7hz,4h),7.66–4.06(m,28h),7.66–3.92(m,30h),7.66–3.76(m,33h),5.37(d,j＝39.0hz,3h),5.37(d,j＝39.0hz,2h),7.66–3.67(m,36h),4.94(s,3h),5.28–4.36(m,8h),4.30–3.45(m,18h),4.24–3.45(m,16h),7.66–1.72(m,88h),2.95(s,1h),2.77(s,1h),2.67(s,1h),2.50(s,12h),2.97–1.72(m,28h),2.73–1.90(m,19h),1.79(dd,j＝38.9,27.7hz,6h),1.59(d,j＝7.4hz,3h),1.50(s,3h),1.40–1.29(m,4h),1.23(s,4h),1.09(s,3h),1.00(d,j＝5.0hz,1h),0.90(ddd,j＝17.9,13.5,6.7hz,13h),0.60(s,5h),0.00(t,j＝25.1hz,5h).
實施例3
實施例1制備的式(a)化合物和實施例2制備的式(b)化合物的抗腫瘤細胞增殖效果：
儀器和試劑：細胞株：mgc-803、hl-60(atcc，美國)、bel-7402(中科院細胞庫，中國)，rpmi-1640培養(yǎng)基、imdm培養(yǎng)基(gibco，美國)，胎牛血清(hyclone，南美)，96孔培養(yǎng)板(thermo，美國)，酶標儀(spectramaxm5，moleculardevices)srb(sigma，中國)，tris(上海西巴斯生物技術(shù)開發(fā)有限公司，中國)
(1)bel-7402肝癌細胞株/mgc-803胃癌細胞株/hl60人原髓細胞白血病細胞制成單細胞懸液，180ul接種于96孔培養(yǎng)板中，co2培養(yǎng)箱(37℃,5％co2，95％空氣)過夜培養(yǎng)；
(2)化合物0.03–10um按濃度梯度加入細胞(20ul/孔)，對照組加入1‰dmso，co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h
(3)培養(yǎng)72h后傾去培養(yǎng)液，用10％冷tca固定細胞，4℃放置1小時后用蒸餾水洗滌5次，空氣中自然干燥。然后加入由1％冰醋酸配制的srb(sigma)4mg/ml溶液100ml/孔，室溫中染色15分鐘，去上清液，用1％醋酸洗滌5次，空氣干燥。
(4)最后加入150ml/孔的tris溶液,酶標儀560nm測各孔od值，數(shù)據(jù)處理采用graphpadprism5.
結(jié)果：如表1所示，式(a)化合物mc-val-cit-pabc-bf211對多種不同類型腫瘤細胞增殖有較好的抑制作用；式(b)化合物對于肝癌、胃癌、白血病等多種腫瘤細胞株都表現(xiàn)出了良好的細胞增殖抑制效果，可在極低濃度發(fā)揮殺傷作用。綜上可見，式(b)化合物較式(a)化合物活性高，對肝癌、胃癌、白血病細胞殺傷性更好。
表1
實施例3記載了化合物的抗腫瘤細胞增殖效果，式(a)和式(b)化合物都具有一定的抗腫瘤作用，但是式(b)化合物其肝癌細胞株bel-7402ic50＝0.089um，胃癌細胞株mgc-803ic50＝0.015um，白血病細胞hl-60ic50＝0.91um，抗癌效果明顯優(yōu)于式(a)化合物幾倍到幾十倍。
本發(fā)明的保護內(nèi)容不局限于以上實施例。在不背離發(fā)明構(gòu)思的精神和范圍下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的變化和優(yōu)點都被包括在本發(fā)明中，并且以所附的權(quán)利要求書為保護范圍。