本申請根據(jù)U.S.C.§119(e)要求2014年3月21日提交的美國申請序號14/222,453的部分繼續(xù)申請、2013年9月20日提交的美國申請序號14/033,300的部分繼續(xù)申請的優(yōu)先權(quán)，其根據(jù)35U.S.C.§119(e)要求2012年9月21日提交的美國臨時申請序號61/704,408的優(yōu)先權(quán)權(quán)益，每篇申請在此以引用的方式整體并入，包括所有表、圖及權(quán)利要求。序列表的合并在所附序列表中的材料在此以引用的方式并入本申請中。所附的序列表文本文件被命名為SGI1660_3WO_Sequence_Listing.txt，于2015年3月20日創(chuàng)建，且為191KB?？墒褂迷诓捎肳indowsOS的計算機上的MicrosoftWord評價該文件。發(fā)明背景近年來，已投入日益增多的精力來鑒定使用可再生原料生產(chǎn)有機化學(xué)品的新型和有效方式。在眾多的下游化學(xué)加工技術(shù)中，生物質(zhì)衍生的糖向高附加值化學(xué)品的轉(zhuǎn)化被認為是十分重要的。具體說來，六種含碳的糖類，即己糖，如果糖和葡萄糖，是廣為人知的在自然界中存在的最大量的單糖，因此可適當?shù)厍医?jīng)濟地用作化學(xué)原料。由糖生產(chǎn)呋喃和呋喃衍生物已在化學(xué)和催化研究中吸引了越來越多的關(guān)注，且據(jù)信具有提供實現(xiàn)可持續(xù)性供能和化學(xué)品生產(chǎn)的一條主要路線的潛能。實際上，在用整合生物質(zhì)轉(zhuǎn)化工藝的生物精煉內(nèi)可獲得的糖的脫水和/或氧化可產(chǎn)生一大家族產(chǎn)物，包括各種各樣的呋喃和呋喃衍生物。在具有最大商業(yè)價值的呋喃中，呋喃-2，5-二甲酸(也稱為2，5-呋喃二甲酸，在下文中縮寫為FDCA)是在包括藥物、殺蟲劑、抗細菌劑、香料、農(nóng)業(yè)化學(xué)品的若干產(chǎn)業(yè)以及廣泛范圍的聚合物材料(例如，生物塑料樹脂)的制造應(yīng)用中具有多種用途的有價值的中間體。因此，F(xiàn)DCA被認為是對苯二甲酸(TPA)的綠色替代品，即一種石油基單體，其是全世界每年生產(chǎn)的最大體積的石化產(chǎn)品之一。實際上，美國能源部已將FDCA鑒定為最佳的12種優(yōu)先級化合物之一，這些化合物都是由糖制成為高附加值的化學(xué)品用于確立未來的“綠色”化學(xué)，且因此，其已被命名為可再生的中間體化學(xué)品的“沉睡的巨人”之一(Werpy和Petersen，TopValueAddedChemicalsfromBiomass.USDepartmentofEnergy，Biomass，第1卷，2004)。雖然已提出各種方法用于大規(guī)模生產(chǎn)FDCA(關(guān)于綜述，參見，例如Tong等人，Appl.CatalysisA：General，385，1-13，2010)，但FDCA的主要工業(yè)合成當前依賴于己糖如葡萄糖或果糖的化學(xué)脫水為中間體5-羥甲基糠醛(5-HMF)，然后化學(xué)氧化為FDCA。然而，據(jù)報道當前經(jīng)由脫水的FDCA生產(chǎn)過程一般是非選擇性的，除非其剛形成，不穩(wěn)定的中間產(chǎn)物便立即轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定的材料。因此，在FDCA的生產(chǎn)和使用中的主要技術(shù)壁壘是開發(fā)有效的和選擇性的生物質(zhì)衍生的糖的脫水工藝。因此，需要開發(fā)通過替代手段生產(chǎn)這種十分重要的化合物以及許多其他化學(xué)品和代謝物的方法，這種手段不僅對于石油基原料是可再生的替代品，而且使用能源更少和資本密集型技術(shù)。具體說來，糖脫水的選擇性控制可以是一項非常強大的技術(shù)，產(chǎn)生廣泛多種額外的便宜的結(jié)構(gòu)單元。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明提供用于生產(chǎn)一個或多個酶促途徑的產(chǎn)物的方法。本發(fā)明方法中所用的途徑包括一個或多個轉(zhuǎn)化步驟，例如像古羅糖醛酸酶促轉(zhuǎn)化為D-葡糖二酸(步驟7)；5-酮葡糖酸(5-KGA)酶促轉(zhuǎn)化為L-艾杜糖醛酸(步驟15)；L-艾杜糖醛酸酶促轉(zhuǎn)化為艾杜糖二酸步驟7b)；以及5-酮葡糖酸酶促轉(zhuǎn)化為4，6-二羥基2，5-二酮己酸(2，5-DDH)(步驟16)；1，5-葡糖酸內(nèi)酯酶促轉(zhuǎn)化為古羅糖醛酸-內(nèi)酯(步驟19)。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法生產(chǎn)2，5-呋喃二甲酸(FDCA)作為產(chǎn)物。所述方法可包括酶促和化學(xué)轉(zhuǎn)化兩者作為步驟。還提供各種途徑用于將葡萄糖或果糖或蔗糖或半乳糖轉(zhuǎn)化為5-脫氫-4-脫氧-葡糖二酸(DDG)，并且將相同的糖轉(zhuǎn)化為FDCA。所述方法還可包括以高特異性和效率進行反應(yīng)的工程化酶的用途。第一方面，本發(fā)明提供一種用于從起始底物生產(chǎn)酶促或化學(xué)途徑的產(chǎn)物的方法。所述途徑可含有任何一個或多個以下轉(zhuǎn)化步驟：古羅糖醛酸酶促轉(zhuǎn)化為D-葡糖二酸(步驟7)；5-酮葡糖酸(5-KGA)酶促轉(zhuǎn)化為L-艾杜糖醛酸(步驟15)；L-艾杜糖醛酸酶促轉(zhuǎn)化為艾杜糖二酸(步驟7b)；以及5-酮葡糖酸酶促轉(zhuǎn)化為4，6-二羥基2，5-二酮己酸(2，5-DDH)(步驟16)；1，5-葡糖酸內(nèi)酯酶促轉(zhuǎn)化為古羅糖醛酸-內(nèi)酯(步驟19)。在一個實施方案中，酶促途徑的產(chǎn)物是5-脫氫-4-脫氧-葡糖二酸(DDG)。在不同實施方案中，方法的底物可為葡萄糖，并且產(chǎn)物可為5-脫氫-4-脫氧-葡糖二酸(DDG)。所述方法可包括以下步驟：D-葡萄糖酶促轉(zhuǎn)化為1，5-葡糖酸內(nèi)酯(步驟1)；1，5-葡糖酸內(nèi)酯酶促轉(zhuǎn)化為古羅糖醛酸-內(nèi)酯(步驟19)；古羅糖醛酸-內(nèi)酯酶促轉(zhuǎn)化為古羅糖醛酸(步驟1B)；古羅糖醛酸酶促轉(zhuǎn)化為D-葡糖二酸(步驟7)；以及D-葡糖二酸酶促轉(zhuǎn)化為5-脫氫-4-脫氧-葡糖二酸(DDG)(步驟8)。在本發(fā)明的另一方法中，底物是葡萄糖且產(chǎn)物是DDG，并且所述方法包括以下步驟：D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為1，5-葡糖酸內(nèi)酯(步驟1)；1，5-葡糖酸內(nèi)酯轉(zhuǎn)化為葡糖酸(步驟1a)；葡糖酸轉(zhuǎn)化為5-酮葡糖酸(5-KGA)(步驟14)；5-酮葡糖酸(5-KGA)轉(zhuǎn)化為L-艾杜糖醛酸(步驟15)；L-艾杜糖醛酸轉(zhuǎn)化為艾杜糖二酸(步驟7b)；以及艾杜糖二酸轉(zhuǎn)化為DDG(步驟8a)。在本發(fā)明的另一方法中，底物是葡萄糖且產(chǎn)物是DDG，并且所述方法包括以下步驟：D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為1，5-葡糖酸內(nèi)酯(步驟1)；1，5-葡糖酸內(nèi)酯轉(zhuǎn)化為葡糖酸(步驟1a)；葡糖酸轉(zhuǎn)化為5-酮葡糖酸(5-KGA)(步驟14)；5-酮葡糖酸(5-KGA)轉(zhuǎn)化為4，6-二羥基2，5-二酮己酸(2，5-DDH)(步驟16)；4，6-二羥基2，5-二酮己酸(2，5-DDH)轉(zhuǎn)化為4-脫氧-5-蘇型-己酮糖糖醛酸(DTHU)(步驟4)；以及4-脫氧-5-蘇型-己酮糖糖醛酸(DTHU)轉(zhuǎn)化為DDG(步驟5)。在本發(fā)明的另一方法中，底物是葡萄糖且產(chǎn)物是DDG，并且所述方法包括以下步驟：D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為1，5-葡糖酸內(nèi)酯(步驟1)；1，5-葡糖酸內(nèi)酯轉(zhuǎn)化為葡糖酸(步驟1a)；葡糖酸轉(zhuǎn)化為5-酮葡糖酸(5-KGA)(步驟14)；5-酮葡糖酸(5-KGA)轉(zhuǎn)化為L-艾杜糖醛酸(步驟15)；L-艾杜糖醛酸轉(zhuǎn)化為4-脫氧-5-蘇型-己酮糖糖醛酸(DTHU)(步驟7B)；以及4-脫氧-5-蘇型-己酮糖糖醛酸(DTHU)轉(zhuǎn)化為DDG(步驟5)。本文所公開的任何方法可進一步包括DDG轉(zhuǎn)化為2，5-呋喃-二甲酸(FDCA)的步驟。在任何方法中DDG轉(zhuǎn)化為FDCA可包括將DDG與無機酸接觸以使DDG轉(zhuǎn)化為FDCA。另一方面，本發(fā)明提供一種用于合成衍生化(酯化)的FDCA的方法。所述方法包括將DDG與醇、無機酸在超過60C的溫度下接觸以形成衍生化的FDCA。在不同實施方案中，所述醇是甲醇、丁醇或乙醇。另一方面，本發(fā)明提供一種用于合成FDCA的衍生物的方法。所述方法包括將DDG與醇、無機酸及助溶劑接觸以產(chǎn)生DDG的衍生物；任選地純化DDG的衍生物；并且將DDG的衍生物與無機酸接觸以產(chǎn)生FDCA的衍生物。無機酸可為硫酸且醇可為乙醇或丁醇。在不同實施方案中，助溶劑可為以下任一種：THF、丙酮、乙腈、醚、乙酸丁酯、二噁烷、氯仿、二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、己烷、甲苯及二甲苯。在一個實施方案中，DDG的衍生物是二乙基DDG且FDCA的衍生物是二乙基FDCA，并且在另一實施方案中，DDG的衍生物是二丁基DDG且FDCA的衍生物是二丁基FDCA。另一方面，本發(fā)明提供一種用于合成FDCA的方法。所述方法包括將DDG與無機酸在氣相中接觸。另一方面，本發(fā)明提供一種用于合成FDCA的方法。所述方法包括將DDG與無機酸在超過120C的溫度下接觸。另一方面，本發(fā)明提供一種用于合成FDCA的方法。所述方法包括將DDG與無機酸在無水反應(yīng)條件下接觸。附圖簡述圖1是蛋白474、475及476的粗裂解物和純化酶的電泳凝膠。圖2A-2H分別是路線1、2、2A、2C、2D、2E、2F的途徑的示意圖。圖3A-3c分別示出了路線3、4及5的途徑的示意圖。圖4是用葡糖酸脫水酶對葡糖酸脫水以通過pSGI-359產(chǎn)生DHG的HPCL-MS分析。圖5是用于測量葡糖酸脫水酶活性的氨基脲(semicarbizide)測定繪圖的曲線圖。圖6A-6B提供用本發(fā)明的三種酶進行的葡糖醛酸和艾杜糖醛酸的氧化的Lineweaver-Burk繪圖。圖7A示出了使用EC5.3.1.17家族中的酶DTHU異構(gòu)酶對5KGA和艾杜糖醛酸進行異構(gòu)化的時間點的HPLC分析的結(jié)果。對照：死的酶是與熱滅活酶的對照。MedB1是指沒有添加異構(gòu)酶的反應(yīng)。時間點，x軸1＝0.5h；2＝1；3＝2h；4＝16h。圖7b示出了使用EC5.3.1.17家族中的酶對5KGA和艾杜糖醛酸進行異構(gòu)化的時間點的HPLC分析。對照：死的酶是與熱滅活酶的對照。；MedB1：是指沒有添加異構(gòu)酶的反應(yīng)。時間點，X軸：1＝0h；2＝1h；3＝2h；4＝17h。圖8示出了用EC5.3.1.nl家族中的酶對5KGA和艾杜糖醛酸進行異構(gòu)化的產(chǎn)物形成。從酶測定中獲得數(shù)據(jù)。圖9：2，5-DDH形成的HPLC分析及5KGA濃度隨時間的降低。示出了2，5-DDH的總離子計數(shù)。圖10是顯示由1，5-葡糖酸內(nèi)酯產(chǎn)生古羅糖醛酸內(nèi)酯的HPLC-MS色譜圖。示出了真正的古羅糖醛酸的跡線的重疊。圖11是方案6反應(yīng)途徑的示意圖。圖12A-12B分別是示出了5-KGA和DDG反應(yīng)產(chǎn)物的LC-MS色譜圖。圖13是示出了FDCA和FDCA二丁酯衍生反應(yīng)產(chǎn)物的LC-MS色譜圖。圖14A是來自DDG與乙醇的反應(yīng)的二乙基FDCA合成的粗反應(yīng)樣品的GC-MS分析。單峰對應(yīng)于二乙基-FDCA。圖14B是來自DDG與乙醇的反應(yīng)的主要產(chǎn)物的MS片段。圖15A是來自DDG與乙醇的反應(yīng)的二乙基FDCA合成的粗反應(yīng)樣品的GC-MS分析。單峰對應(yīng)于二乙基-FDCA。圖15B是來自DDG與乙醇的反應(yīng)的主要產(chǎn)物的MS片段。圖16是由DTHU合成FDCA及其衍生物的示意圖。圖17是方案1的示意圖。由葡萄糖開始的DDG的無細胞酶促合成。酶是ST-1：葡萄糖氧化酶；ST-1A：水解-化學(xué)品；ST-14：葡糖酸脫氫酶(pSGI-504)；ST-15：5-脫氫-4-脫氧-D-葡糖醛酸異構(gòu)酶(DTHUIS，pSGI-434)；ST-7B：糖醛酸脫氫酶(UroDH，pSGI-476))；ST-8A：葡糖二酸脫水酶(GlucDH，pSGI-353)；ST-A：NAD(P)H氧化酶(NADH_OX，pSGI-431)；ST-B：過氧化氫酶。圖17b示出了如通過HPLC所分析的反應(yīng)中間體在頭3h內(nèi)的濃度。在兩個反應(yīng)中都顯示了DDG的形成。具體實施方式本發(fā)明提供用于生產(chǎn)酶促途徑的產(chǎn)物的方法。所述方法可包括底物酶促轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物。通過利用本發(fā)明的酶促及化學(xué)途徑，有可能以高效和經(jīng)濟的方式合成廣泛多種產(chǎn)物。可通過本發(fā)明的方法和途徑產(chǎn)生的一種產(chǎn)物是2，5-呋喃基二甲酸(FDCA)，其可根據(jù)本發(fā)明以工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)。所述方法可包括一個或多個本文所公開的酶促和/或化學(xué)的底物向產(chǎn)物轉(zhuǎn)化步驟。在一些實施方案中，利用的酶使用對于所述酶未知的活性進行酶促轉(zhuǎn)化步驟。因此，可在本發(fā)明中使用這些新型活性以進行轉(zhuǎn)化步驟和底物向產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化作為酶促和/或化學(xué)途徑的一部分。本文所公開的任何途徑的任何產(chǎn)物(例如DDG、艾杜糖醛酸、艾杜糖二酸、葡糖二酸、FDCA等)都可如本文所公開在單個生物反應(yīng)器或反應(yīng)容器中以工業(yè)規(guī)模，即至少1克或至少10克或至少100克或至少1kg的量生產(chǎn)。本發(fā)明的途徑包含本文所公開的任何一個或多個步驟。應(yīng)當理解，本發(fā)明的途徑的步驟可包括正反應(yīng)或逆反應(yīng)，即底物A被轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物B，而在逆反應(yīng)中底物B被轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物A。在方法中，除非另作說明，正反應(yīng)和逆反應(yīng)都被描述為步驟。所述方法包括生產(chǎn)途徑的產(chǎn)物，該途徑可為酶促途徑。所述方法包括一個或多個酶促和/或化學(xué)轉(zhuǎn)化步驟，這些步驟將底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物?？砂ㄔ诜椒ㄖ械牟襟E包括例如以下任何一個或多個：古羅糖醛酸酶促轉(zhuǎn)化為D-葡糖二酸(步驟7)；L-艾杜糖醛酸酶促轉(zhuǎn)化為4-脫氧-5-蘇型-己酮糖糖醛酸(DTHU)(17)；5-酮葡糖酸(5-KGA)酶促轉(zhuǎn)化為L-艾杜糖醛酸(步驟15)；L-艾杜糖醛酸酶促轉(zhuǎn)化為艾杜糖二酸步驟7B)；以及5-酮葡糖酸酶促轉(zhuǎn)化為4，6-二羥基2，5-二酮己酸(2，5-DDH)(步驟16)；1，5-葡糖酸內(nèi)酯酶促轉(zhuǎn)化為古羅糖醛酸-內(nèi)酯(步驟19)。任何一個或多個上述步驟都可包括在本發(fā)明的方法或途徑中。酶促步驟或途徑是在反應(yīng)中需要酶作為催化劑以使步驟進行的步驟或途徑。化學(xué)步驟可在反應(yīng)中沒有酶作為催化劑的情況下進行。在方法中所列舉的任何一個或多個步驟都可為酶促步驟。在一些實施方案中，途徑的每個步驟都是酶促步驟，而在其他實施方案中，途徑中的一個或多個步驟是化學(xué)步驟。在一些實施方案中，任何所述方法都可包括涉及將反應(yīng)的底物添加到含有執(zhí)行轉(zhuǎn)化的酶的反應(yīng)混合物中的步驟。因此，古羅糖醛酸轉(zhuǎn)化為D-葡糖二酸(步驟7)的方法可包括將古羅糖醛酸作為起始底物添加到反應(yīng)混合物中；L-艾杜糖醛酸酶促轉(zhuǎn)化為艾杜糖二酸(7B)可包括將L-艾杜糖醛酸作為起始底物添加到反應(yīng)混合物中；L-艾杜糖醛酸酶促轉(zhuǎn)化為4-脫氧-5-蘇型-己酮糖糖醛酸(DTHU)(17)可包括將L-艾杜糖醛酸作為起始底物添加到反應(yīng)混合物中。任何所述方法都可包括將葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖或甘露糖或另一單糖或二糖添加到反應(yīng)混合物中的步驟?？砂ㄔ谌魏畏椒ㄖ械牧硪徊襟E是從反應(yīng)混合物中純化反應(yīng)產(chǎn)物的步驟。因此，純化葡糖二酸/D-葡糖二酸或L-艾杜糖醛酸/艾杜糖醛酸、或艾杜糖二酸、或2，5-二酮己二酸/DKHA的步驟可包括在本文所述的任何方法中。所公開的任何方法都可包括從反應(yīng)混合物中分離或純化DDG或FDCA的步驟。并且任何方法都可包括添加酶到反應(yīng)混合物中的步驟，所述酶執(zhí)行本文所述的任何一個或多個步驟。反應(yīng)混合物是至少一種底物和至少一種酶的混合物并且包括至少一種底物轉(zhuǎn)化為至少一種酶產(chǎn)物。任何所述方法都可包括將分離的酶添加到反應(yīng)混合物中的步驟，執(zhí)行本發(fā)明途徑的底物向產(chǎn)物轉(zhuǎn)化步驟的酶，并且分離的酶是至少10％純化或至少20％純化或至少25％純化或至少50％純化或至少70％純化或至少80％純化或至少90％純化的，所有都是w/w。由于許多糖可轉(zhuǎn)化為其他糖，所以本發(fā)明的任何方法或途徑都可涉及葡萄糖、蔗糖、果糖或半乳糖用作起始底物。因此，在其中葡萄糖是起始底物的本文所公開的任何途徑或反應(yīng)中，應(yīng)當理解果糖或蔗糖或半乳糖或甘露糖或另一起始底物也可以是那個途徑或反應(yīng)的起始底物。在一些實施方案中，糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖，葡萄糖隨后進入途徑，但在其他實施方案中，途徑是從果糖或蔗糖或半乳糖或甘露糖或另一單糖或二糖開始。本發(fā)明的反應(yīng)可在含有一種或多種執(zhí)行酶促轉(zhuǎn)化的酶的細胞裂解物或無細胞的裂解物中發(fā)生，但也可在含有組分的反應(yīng)混合物中發(fā)生，所述組分是由用戶添加以形成反應(yīng)混合物，或可含有從細胞裂解物中純化的組分，或可包含在全細胞生物催化劑中。反應(yīng)也可在由已經(jīng)合并的純化組分制成的混合物中發(fā)生，如在其中底物與酶已合并形成反應(yīng)混合物的混合物中。反應(yīng)可在體外反應(yīng)中發(fā)生或可在重組細胞中發(fā)生，且因此，一種或多種產(chǎn)物可通過溶解細胞或通過從培養(yǎng)基處收集來收獲。反應(yīng)可在以下實驗室容器或反應(yīng)容器中發(fā)生，例如像離心管、試管、小瓶、燒杯或玻璃或金屬或塑料容器或反應(yīng)器、發(fā)酵罐或發(fā)酵容器或生物反應(yīng)器、藻池、可以是小規(guī)模或大規(guī)模的任何容器。本文所述的任何生物體都可用作宿主細胞以產(chǎn)生本發(fā)明的步驟或途徑的產(chǎn)物。生物體也可用于產(chǎn)生本發(fā)明的一種或多種酶以用于本發(fā)明的方法中?？墒褂酶鞣N類型的生物體。實例包括：醋桿菌科的細菌(例如醋桿菌屬、嗜酸菌屬、葡糖桿菌屬、葡糖酸醋酸桿菌屬的細菌)、或假單胞菌科的細菌(例如固氮菌屬、假單胞菌屬)、或腸桿菌科的細菌(例如埃希氏桿菌屬(例如大腸桿菌)、克雷伯氏桿菌屬)。酵母也可用于這些目的，如酵母菌屬、阿舒囊霉屬、克魯維酵母屬、Lachancea、接合酵母屬、念珠菌屬、畢赤氏酵母屬、Arxula或毛孢子菌屬或Blastobotry的酵母。也可使用藍藻細菌，如藍絲菌屬(例如藍桿藻菌株ATCC51142、PCC7424、PCC7425、PCC7822、PCC8801、PCC8802)、或微胞藻屬或聚球藻屬(例如細長菌株P(guān)CC7942、PCC7002、PCC6301、CC9311、CC9605、CC9902、JA-2-3B’a(2-13)、JA-3-3Ab、RCC307、WH7803、WH8102)或集胞藻屬或嗜熱聚球藻。因此，本發(fā)明提供重組宿主細胞，其包含SEQIDNO：4-6、20-32、36-38、47-54、56、62-66、69-70、72及79-84中的一個或多個的重組核酸或SEQIDNO：1-84中的任一個的密碼子優(yōu)化序列。宿主細胞還可含有本文所述的本發(fā)明的載體?！懊艽a子優(yōu)化”序列是指序列密碼子變化成在具體的生物體中優(yōu)先使用的那些以使得所編碼的蛋白質(zhì)在攜帶該序列的生物體中有效地表達。重組核酸序列可包含在如本文所公開的載體上。在不同實施方案中，本發(fā)明的方法是以下方法：葡萄糖或果糖或蔗糖或半乳糖轉(zhuǎn)化為DDG，或者葡萄糖或果糖或蔗糖或半乳糖轉(zhuǎn)化為FDCA，或者葡萄糖或果糖或蔗糖或半乳糖轉(zhuǎn)化為DTHU或DEHU，或者DDG轉(zhuǎn)化為FDCA。所述方法可包括將在方法中的起始底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物。起始底物是被視為開始該方法的化學(xué)實體且產(chǎn)物是被視為方法的最終產(chǎn)物的化學(xué)實體。中間體是在方法中生成(暫時地或永久地)且在起始底物與產(chǎn)物之間的反應(yīng)途徑中存在的那些化學(xué)實體。在不同實施方案中，本發(fā)明的方法和途徑具有約四個或約五個中間體或4-5個中間體、或約3個中間體、或3-5個中間體、或小于6或小于7或小于8或小于9或小于10或小于15或小于20個中間體，意味著這些值沒有將起始底物或最終產(chǎn)物算在內(nèi)。本發(fā)明提供從葡萄糖或果糖或蔗糖或半乳糖生產(chǎn)FDCA和/或DDG的方法，其具有高產(chǎn)率。理論產(chǎn)率是如果反應(yīng)在理想條件下完成的話將形成的產(chǎn)物的量。在不同實施方案中，本發(fā)明的方法從葡萄糖、果糖或半乳糖生產(chǎn)DDG，其理論產(chǎn)率為至少50摩爾％、或至少60摩爾％或至少70摩爾％、或至少80摩爾％、至少90摩爾％或至少95摩爾％或至少97摩爾％或至少98摩爾％或至少99摩爾％，或理論產(chǎn)率為100摩爾％。本發(fā)明的方法還可提供具有以下碳保存率的產(chǎn)物：至少80％或至少90％或至少95％或至少97％或至少98％或至少99％或100％，意味著在初始底物中存在的具體碳原子以所列舉的百分比存在于方法的最終產(chǎn)物中。在一些實施方案中，所述方法經(jīng)由脫水反應(yīng)從葡萄糖或果糖或蔗糖或半乳糖生產(chǎn)DDG和/或FDCA。示例性合成途徑本發(fā)明還提供用于合成和產(chǎn)生所需產(chǎn)物的特定途徑。任何以下所述路線或途徑都可從葡萄糖或果糖或蔗糖或半乳糖或甘露糖開始并且向所需產(chǎn)物移動。在一些實施方案中，D-葡萄糖是起始底物并且朝向途徑的中間體或最終產(chǎn)物的途徑方向被認為是下游方向，而朝向葡萄糖的相反方向被認為是上游方向。應(yīng)該認識到，路線或途徑可以下游或上游方向移動。雖然葡萄糖被用作本文所述的途徑的示例性起始底物，但還應(yīng)理解的是蔗糖、果糖、半乳糖或甘露糖或在任何途徑中的任何中間體也可以是本發(fā)明任何方法中的起始底物，并且DDG、DTHU、FDCA或本發(fā)明的任何路線或途徑中的任何中間體都可以是本發(fā)明方法的最終產(chǎn)物。因此，所公開的方法包括本發(fā)明的任何路線或途徑中所公開的任何一個或多個步驟，使用所公開的路線或途徑中的一個或多個步驟將任何起始底物或中間體轉(zhuǎn)化為所公開的路線或途徑中的任何最終產(chǎn)物或中間體。因此，舉例來說，所述方法可以是以下方法：用于將葡萄糖或果糖或蔗糖或半乳糖或甘露糖轉(zhuǎn)化為DDG、或轉(zhuǎn)化為古羅糖醛酸、或轉(zhuǎn)化為半乳糖酸、或轉(zhuǎn)化為DTHU、或轉(zhuǎn)化為DEHU、或轉(zhuǎn)化為古羅糖醛酸、或轉(zhuǎn)化為艾杜糖醛酸、或轉(zhuǎn)化為艾杜糖二酸、或轉(zhuǎn)化為葡糖二酸；或者用于將半乳糖酸轉(zhuǎn)化為DDG；或用于將古羅糖醛酸轉(zhuǎn)化為D-葡糖二酸；或用于將5-KGA轉(zhuǎn)化為L-艾杜糖醛酸；或用于將L-艾杜糖醛酸轉(zhuǎn)化為艾杜糖二酸；或用于將5-KGA轉(zhuǎn)化為2，5-DDH或DTHU；或用于將DHG轉(zhuǎn)化為DEHU。在這些實施方案中，所述方法利用本發(fā)明的方法和途徑中所公開的步驟，從起始底物到相關(guān)最終產(chǎn)物。這些步驟中的一個或多個也可在方法中使用，以來自本文所公開的途徑的“逆向”或上游方向移動。路線1示于圖2a中。路線1經(jīng)由一系列所示步驟經(jīng)由酶促途徑將D-葡萄糖(或途徑中的任何中間體)轉(zhuǎn)化為5-脫氫-4-脫氧-葡糖二酸(DDG)。路線1經(jīng)由具有以下的途徑將D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為DDG：具有1，5-葡糖酸內(nèi)酯、葡糖酸、3-脫氫-葡糖酸(DHG)、4，6-二羥基2，5-二酮己酸(2，5-DDH)及4-脫氧-L-蘇型-己酮糖糖醛酸(DTHU)作為中間體且DDG作為最終產(chǎn)物。對于任何途徑，也可存在未示出的額外中間體。這些步驟是D-葡萄糖酶促轉(zhuǎn)化為1，5-葡糖酸內(nèi)酯(步驟1)；1，5-葡糖酸內(nèi)酯酶促轉(zhuǎn)化為葡糖酸(步驟1A)；葡糖酸酶促轉(zhuǎn)化為3-脫氫-葡糖酸(DHG)(步驟2)；3-脫氫-葡糖酸(DHG)酶促轉(zhuǎn)化為4，6-二羥基2，5-二酮己酸(2，5-DDH)(步驟3)；4，6-二羥基2，5-二酮己酸(2，5-DDH)酶促轉(zhuǎn)化為4-脫氧-L-蘇型-己酮糖糖醛酸(DTHU)(步驟4)；以及4-脫氧-L-蘇型-己酮糖糖醛酸(DTHU)酶促轉(zhuǎn)化為5-脫氫-4-脫氧-葡糖二酸(DDG)(步驟5)。路線1還包括子路線，其中作為底物的葡萄糖或途徑中的任何中間體都被轉(zhuǎn)化為作為最終產(chǎn)物的任何其他下游中間體，并且每條底物至產(chǎn)物的子路線都被視是如同每個都在本文中詳細闡述一般公開。路線2示于圖2b中并且將D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為DDG。路線2途徑中的步驟是D-葡萄糖酶促轉(zhuǎn)化為1，5-葡糖酸內(nèi)酯(步驟1)；1，5-葡糖酸內(nèi)酯酶促轉(zhuǎn)化為葡糖酸(步驟1A)；葡糖酸酶促轉(zhuǎn)化為古羅糖醛酸(步驟6)；古羅糖醛酸酶促轉(zhuǎn)化為D-葡糖二酸(步驟7)；D-葡糖二酸酶促轉(zhuǎn)化為DDG(步驟8)。路線2還包括子路線，其中作為底物的葡萄糖或途徑中的任何中間體都被轉(zhuǎn)化為任何其他下游中間體作為最終產(chǎn)物，并且每條子路線都被視為如同每個都在本文中詳細闡述一般公開。舉例來說，在一些實施方案中，所述方法包括使用路線2中所述的一個或多個步驟將作為底物的葡萄糖或葡糖酸轉(zhuǎn)化為作為產(chǎn)物的古羅糖醛酸或D-葡糖二酸的步驟。路線2A示于圖2c中。途徑2A中的步驟是D-葡萄糖酶促轉(zhuǎn)化為1，5-葡糖酸內(nèi)酯(步驟1)；1，5-葡糖酸內(nèi)酯酶促轉(zhuǎn)化為古羅糖醛酸內(nèi)酯(步驟19)；古羅糖醛酸內(nèi)酯酶促轉(zhuǎn)化為古羅糖醛酸(步驟1B)；古羅糖醛酸酶促轉(zhuǎn)化為D-葡糖二酸(步驟7)；D-葡糖二酸酶促轉(zhuǎn)化為5-脫氫-4-脫氧-葡糖二酸(DDG)(步驟8)。路線2A還包括子路線，其中作為起始底物的葡萄糖或途徑中的任何中間體都被轉(zhuǎn)化為任何其他下游中間體作為最終產(chǎn)物，并且每條子路線都被視為如同每個都在本文中詳細闡述一般公開。舉例來說，在一些實施方案中，所述方法包括使用路線2A中所述的一個或多個步驟將作為底物的葡萄糖或古羅糖醛酸內(nèi)酯轉(zhuǎn)化為作為產(chǎn)物的葡糖二酸或DDG的步驟。路線2B示于圖2d中。路線2B中的步驟是D-葡萄糖酶促轉(zhuǎn)化為葡糖酸(步驟1和1A)；葡糖酸酶促轉(zhuǎn)化為5-酮葡糖酸(5-KGA)(步驟14)；5-KGA酶促轉(zhuǎn)化為L-艾杜糖醛酸(步驟15)；L-艾杜糖醛酸酶促轉(zhuǎn)化為艾杜糖二酸(步驟7B)；艾杜糖二酸酶促轉(zhuǎn)化為DDG(步驟8A)。路線2B還包括子路線，其中作為起始底物的葡萄糖或途徑中的任何中間體都被轉(zhuǎn)化為任何其他下游中間體作為最終產(chǎn)物，并且每條子路線都被視為如同每個都在本文中詳細闡述一般公開。舉例來說，在一些實施方案中，所述方法包括使用路線2B中所述的一個或多個步驟將作為底物的葡萄糖或5-KGA轉(zhuǎn)化為作為產(chǎn)物的艾杜糖醛酸或艾杜糖二酸的步驟。路線2C示于圖2e中。路線2C中的步驟是D-葡萄糖酶促轉(zhuǎn)化為葡糖酸(步驟1和1A)；葡糖酸酶促轉(zhuǎn)化為5-酮葡糖酸(5-KGA)(步驟14)；5-KGA酶促轉(zhuǎn)化為4，6-二羥基2，5-二酮己酸(2，5-DDH)(步驟16)；4，6-二羥基2，5-二酮己酸(2，5-DDH)酶促轉(zhuǎn)化為4-脫氧-5-蘇型-己酮糖糖醛酸(DTHU)(步驟4)；DTHU酶促轉(zhuǎn)化為DDG(步驟5)。路線2C還包括子路線，其中作為起始底物的葡萄糖或途徑中的任何中間體都被轉(zhuǎn)化為任何其他下游中間體作為最終產(chǎn)物，并且每條子路線都被視為如同每個都在本文中詳細闡述一般公開。舉例來說，在一些實施方案中，所述方法包括使用路線2C中所述的一個或多個步驟將作為底物的葡萄糖或葡糖酸轉(zhuǎn)化為2，5-DDH或DTHU的步驟。路線2D示于圖2f中。路線2D中的步驟是D-葡萄糖酶促轉(zhuǎn)化為葡糖酸(步驟1和1A)；葡糖酸酶促轉(zhuǎn)化為5-酮葡糖酸(5-KGA)(步驟14)；5-KGA酶促轉(zhuǎn)化為艾杜糖醛酸(步驟15)；L-艾杜糖醛酸酶促轉(zhuǎn)化為DTHU(步驟17)；DTHU酶促轉(zhuǎn)化為DDG(步驟5)。路線2D還包括子路線，其中作為起始底物的葡萄糖或途徑中的任何中間體都被轉(zhuǎn)化為任何其他下游中間體作為最終產(chǎn)物，并且每條子路線都被視為如同每個都在本文中詳細闡述一般公開。舉例來說，在一些實施方案中，所述方法包括使用路線2D中所述的一個或多個步驟將作為底物的葡萄糖或5-KGA轉(zhuǎn)化為L-艾杜糖醛酸或DTHU的步驟。路線2E示于圖2g中。路線2D中的步驟是D-葡萄糖酶促轉(zhuǎn)化為1，5-葡糖酸內(nèi)酯(步驟1)；1，5-葡糖酸內(nèi)酯酶促轉(zhuǎn)化為古羅糖醛酸內(nèi)酯(步驟19)；古羅糖醛酸內(nèi)酯酶促轉(zhuǎn)化為古羅糖醛酸(步驟1B)；古羅糖醛酸酶促轉(zhuǎn)化為4-脫氧-赤型-己酮糖糖醛酸(DEHU)(步驟17A)；DEHU酶促轉(zhuǎn)化為3-脫氧-D-赤型-2-己酮糖二酸(DDH)(步驟7A)。路線2E還包括子路線，其中作為起始底物的葡萄糖或途徑中的任何中間體都被轉(zhuǎn)化為任何其他下游中間體作為最終產(chǎn)物，并且每條子路線都被視為如同每個都在本文中詳細闡述一般公開。舉例來說，在一些實施方案中，所述方法包括使用路線2E中所述的一個或多個步驟將作為底物的葡萄糖轉(zhuǎn)化為古羅糖醛酸或DEHU的步驟。路線2F示于圖2h中。路線2F中的步驟是D-葡萄糖酶促轉(zhuǎn)化為葡糖酸(步驟1和1A)；葡糖酸酶促轉(zhuǎn)化為古羅糖醛酸(步驟6)；古羅糖醛酸酶促轉(zhuǎn)化為4-脫氧-赤型-己酮糖糖醛酸(DEHU)(步驟17A)；DEHU酶促轉(zhuǎn)化為3-脫氧-D-赤型-2-己酮糖二酸(DDH)(步驟7A)。路線2F還包括子路線，其中使用路線2F的一個或多個步驟將作為起始底物的葡萄糖或葡糖酸或途徑中的任何中間體轉(zhuǎn)化為古羅糖醛酸或DDH或任何其他下游中間體作為最終產(chǎn)物，并且每條子路線都被視為如同每個都在本文中詳細闡述一般公開。路線3示于圖3a中。路線3中的步驟是D-葡萄糖酶促轉(zhuǎn)化為葡糖酸(步驟1和1A)；葡糖酸酶促轉(zhuǎn)化為3-脫氫-葡糖酸(DHG)(步驟2)；DHG酶促轉(zhuǎn)化為4-脫氧-赤型-己酮糖糖醛酸(DEHU)(步驟6A)；DEHU酶促轉(zhuǎn)化為DDG(步驟7A)。路線3還包括子路線，其中使用路線3的一個或多個步驟將作為起始底物的葡萄糖或果糖或蔗糖或半乳糖或途徑中的任何中間體轉(zhuǎn)化為葡糖酸或DDH或路線3的任何其他下游中間體作為最終產(chǎn)物，并且每條子路線都被視為如同每個都在本文中詳細闡述一般公開。路線4示于圖3b中。路線4中的步驟是D-葡萄糖酶促轉(zhuǎn)化為a-D-葡糖-己二醛糖-1，5-吡喃糖(步驟9)；a-D-葡糖-己二醛糖-1，5-吡喃糖酶促轉(zhuǎn)化為a-D-葡吡喃糖醛酸(步驟10)；a-D-葡吡喃糖醛酸酶促轉(zhuǎn)化為D-葡糖二酸1，5-內(nèi)酯(步驟11)；D-葡糖二酸1，5-內(nèi)酯酶促轉(zhuǎn)化為D-葡糖二酸(步驟1C)；D-葡糖二酸酶促轉(zhuǎn)化為DDG(步驟8)。路線4還包括子路線，其中使用路線4的一個或多個步驟將作為起始底物的葡萄糖或途徑中的任何中間體轉(zhuǎn)化為葡糖二酸或DDG或任何其他下游中間體作為最終產(chǎn)物，并且每條子路線都被視為如同每個都在本文中詳細闡述一般公開。路線5示于圖3c中。路線5中的步驟是D-半乳糖酶促轉(zhuǎn)化為D-半乳糖-己二醛糖(步驟9A)；D-半乳糖-己二醛糖酶促轉(zhuǎn)化為半乳糖醛酸(步驟10A)；半乳糖醛酸酶促轉(zhuǎn)化為半乳糖酸(步驟11A)；半乳糖酸酶促轉(zhuǎn)化為DDG(步驟13)。路線5還包括子路線，其中作為起始底物的半乳糖或途徑中的任何中間體都被轉(zhuǎn)化為任何其他下游中間體作為最終產(chǎn)物，并且每條子路線都被視為如同每個都在本文中詳細闡述一般公開。舉例來說，在一些實施方案中，所述方法包括使用路線5中所述的步驟將半乳糖或另一底物轉(zhuǎn)化為半乳糖醛酸鹽或半乳糖酸的步驟。在各種其他實施方案中，本發(fā)明提供一種從起始底物生產(chǎn)酶促和/或化學(xué)途徑的產(chǎn)物的方法，所述方法包括執(zhí)行步驟1，然后是步驟19，然后是步驟1B，以產(chǎn)生古羅糖醛酸產(chǎn)物。任選地，所述途徑可繼續(xù)進行步驟7以產(chǎn)生葡糖二酸。在另一實施方案中，所述方法包括執(zhí)行步驟1和1A，然后是步驟14，然后是步驟15，以產(chǎn)生艾杜糖醛酸。任選地，所述方法可繼續(xù)進行步驟7B以產(chǎn)生艾杜糖二酸產(chǎn)物或進行步驟17以產(chǎn)生DTHU。在另一實施方案中，所述方法包括執(zhí)行步驟1和1A，然后是步驟14，然后是步驟16以產(chǎn)生2，5-DDH產(chǎn)物。在另一實施方案中，所述方法包括執(zhí)行步驟1，然后是步驟19，以產(chǎn)生古羅糖醛酸內(nèi)酯。酶促步驟已公開了廣泛多種可執(zhí)行本文所述的方法步驟的酶(及編碼酶的核酸)。在本發(fā)明的酶促步驟中利用的酶可以是蛋白質(zhì)或多肽。除用于執(zhí)行本發(fā)明步驟的本文所公開的酶家族和類別之外，與本文所公開的任何酶或核酸或與SEQIDNO1-84中的任一個具有序列同一性的同源物也適用于本發(fā)明。是SEQIDNO：1-84的同源物的酶和核酸與SEQIDNO：1-84的任何核酸或酶或與本文所公開的酶類別的成員具有至少40％或至少50％或至少60％或至少70％或至少80％或至少90％或至少95％或至少97％或至少98％或至少99％的序列同一性。相對于氨基酸或核苷酸序列的序列同一性或同源性百分比在本文中被定義為氨基酸或核苷酸殘基在與已知多肽相同的候選序列中的百分比，必要時，比對序列的最大同一性百分比并引入缺口，以便實現(xiàn)最大同一性或同源性百分比。在核苷酸或氨基酸序列水平下的同源性或同一性可使用本領(lǐng)域中已知的方法測定，包括但不限于使用由程序blastp、blastn、blastx、tblastn及tblastx(Altschul(1997)，NucleicAcidsRes.25，3389-3402，及Karlin(1990)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87，2264-2268)所采用的算法的BLAST(基本局部比對檢索工具)分析，這些程序是專為序列相似性檢索。或者，也可使用任何酶或編碼所述酶的核酸或本文所公開的SEQIDNO1-84的任何酶或核酸的功能片段。術(shù)語“功能片段”是指具有氨基末端和/或羧基末端缺失和/或內(nèi)部缺失(其可被取代以形成嵌合蛋白)的多肽，其中剩余氨基酸序列與參照序列中的相應(yīng)位置具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，和/或保持約75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％全長多肽的活性。EC編號提供國際生物化學(xué)和分子生物學(xué)聯(lián)合會命名委員會(NomenclatureCommitteeoftheInternationalUnionofBiochemistryandMolecularBiology)的酶命名。在其他實施方案中，功能片段保留對由SEQIDNO：1-84編碼的蛋白質(zhì)活性所需的輔因子存在的要求。還公開了具有以下序列的表達載體：SEQIDNO：4-6、20-32、36-38、47-54、56、62-66、69-70、72以及79-84。所述載體可為細菌、酵母或海藻載體。為基因表達而設(shè)計的載體還可包括在攜帶載體的生物體中有活性并與本發(fā)明序列可操作地連接的啟動子。載體可含有與以下序列可操作地連接的啟動子或表達控制序列：SEQIDNO：4-6、20-32、36-38、47-54、56、62-66、69-70、72以及79-84或其任一者的密碼子優(yōu)化序列?！皢幼印笔侵改軌蚪Y(jié)合RNA聚合酶以便在5’至3’(“下游”)方向上啟動基因轉(zhuǎn)錄的核酸序列。當RNA聚合酶與啟動子的結(jié)合是所述基因轉(zhuǎn)錄的近因時，序列“可操作地連接”至啟動子。步驟1-葡萄糖轉(zhuǎn)化(氧化或脫氫)為1，5-葡糖酸內(nèi)酯。此步驟可用各種酶進行，如氧依賴性葡萄糖氧化酶家族(EC1.1.3.4)或NAD(P)-依賴性葡萄糖脫氫酶家族(EC1.1.1.118、EC1.1.1.119)。已顯示當在發(fā)酵罐中生長時，氧化葡糖桿菌將葡萄糖有效地氧化為葡糖酸和5-酮葡糖酸(5-KGA)?？墒褂靡娪谄咸菞U菌屬及其他氧化細菌中的可溶性和膜結(jié)合PQQ-依賴性酶家族的酶(EC1.1.99.35和EC1.1.5.2)。醌蛋白葡萄糖是適用于進行此步驟的另一種酶。選出的特定酶將取決于所需反應(yīng)條件和將存在于反應(yīng)中的必需的輔因子，其示于表1中。步驟1A-1，5-葡糖酸內(nèi)酯轉(zhuǎn)化(例如水解)為葡糖酸。此步驟可在含水介質(zhì)中以化學(xué)方式進行并且水解速率取決于pH(Shimahara，K，Takahashi，T.，Biochim.Biophys.Acta(1970)，201，410)。水解在堿性pH(例如pH7.5)下較快且在酸性pH下較慢。許多微生物還含有特定的1，5-葡糖酸內(nèi)酯水解酶，且它們中有一些已被克隆和表征(EC3.1.1.17；Shinagawa，EBiosci.Biotechnol.Biochem.2009，73，241-244)。步驟1B-古羅糖醛酸內(nèi)酯轉(zhuǎn)化為古羅糖醛酸。古羅糖醛酸內(nèi)酯的化學(xué)水解可通過在水溶液中的自發(fā)反應(yīng)完成。能夠催化此水解的酶是在眾多內(nèi)酯酶之中被鑒定(EC3.1.1.XX及更具體地，3.1.1.17、3.1.1.25)。步驟2-葡糖酸轉(zhuǎn)化為3-脫氫葡糖酸(DHG)：幾種酶，如葡糖酸脫水酶，可用于葡糖酸脫水成脫氫葡糖酸(DHG)的反應(yīng)中。實例包括屬于葡糖酸脫水酶家族的那些(EC4.2.1.39)。所述脫水酶的一個特定實例已顯示對葡糖酸進行脫水(Kim，S.Lee，S.B.Biotechnol.BioprocessEng.(2008)，13，436)。來自此家族及其克隆的酶的具體實例示于實施例1中。步驟3：3-脫氫-葡糖酸(DHG)轉(zhuǎn)化為4，6-二羥基2，5-二酮己酸(2，5-DDH)。已描述用于進行此轉(zhuǎn)化的酶，2-脫氫-3-脫氧-D-葡糖酸5-脫氫酶(或DHG脫氫酶)(EC1.1.1.127)。步驟4：4，6-二羥基2，5-二酮己酸(2，5-DDH)轉(zhuǎn)化為4-脫氧-L-蘇型-己酮糖糖醛酸(DTHU)。EC5.3.1.12家族的酶可用于此步驟，并且步驟15顯示五種所述酶被克隆并展現(xiàn)具有用于5-KGA脫水的活性。這些酶還展示針對2，5-DDH和DTHU的活性。步驟5：DTHU轉(zhuǎn)化為5-脫氫-4-脫氧-葡糖二酸(DDG)。DDG可由例如用溫和的化學(xué)催化劑進行的DTHU的化學(xué)或酶促氧化產(chǎn)生，所述化學(xué)催化劑能夠在醇存在下氧化醛。醛氧化酶可用于催化此氧化反應(yīng)。氧化細菌如醋桿菌屬和葡糖桿菌屬(Hollmann等人GreenChern.2011，13，226)將適用于篩選。以下家族的酶可進行此反應(yīng)：醛氧化酶EC1.2.3.1、醛鐵氧化還原蛋白氧化還原酶(EC1.2.7.5)、以及在EC1.2.1.-XX的所有家族中。糖醛酸脫氫酶(EC1.1.1.203)家族的酶(例如，參見步驟7)也將具有此活性?？墒褂镁哂写己腿┭趸钚缘钠渌?，包括醛醇氧化酶家族中的酶(參見，步驟19和6)。其他廣泛的底物氧化酶包括可溶性和膜結(jié)合的PQQ-依賴性醇/醛氧化酶。更具體地說，屬于I型(EC1.1.9.1)和II型(EC1.1.2.8)家族的可溶性周質(zhì)PQQ氧化酶及其同源物以及屬于EC1.1.5.X家族的膜結(jié)合的PQQ氧化酶是適用的。在其他實施方案中，可使用作用于DTHU的醛脫氫酶/氧化酶。步驟5也可使用來自醋酸細菌屬如葡糖桿菌屬和醋酸桿菌屬及葡糖酸醋酸桿菌屬等的脫氫酶進行。通過就DTHU的氧化篩選微生物來鑒定全細胞活性。鑒定活性并克隆一種或多種酶。還篩選在步驟7和7B中所述的具有糖醛酸脫氫酶活性的酶并且發(fā)現(xiàn)具有此活性。還克隆可溶性周質(zhì)和膜結(jié)合的PQQ依賴性酶的文庫并且發(fā)現(xiàn)若干酶具有此活性。發(fā)現(xiàn)其中具有活性的一些酶是NAD(P)-或PQQ-依賴性脫氫酶，而其他是FAD依賴性醛脫氫酶。SEQIDNO：71-72是NADP依賴性脫氫酶的實例，并且其中的任一個或組合都可用于進行步驟5。SEQIDNO：73-84是合適的PQQ依賴性脫氫酶的實例，并且其中的任一個或組合都可用于進行步驟5。步驟6和6A：葡糖酸轉(zhuǎn)化為古羅糖醛酸(6)且3-脫氫-葡糖酸(DHG)轉(zhuǎn)化為4-脫氧-5-赤型-己酮糖糖醛酸(DEHU)(6A)。在步驟5中所述的酶適用于這些轉(zhuǎn)化。其他有用的酶包括EC1.1.1.XX家族中的NAD(P)-依賴性脫氫酶且更具體地說葡糖醛酸脫氫酶(EC1.1.1.19)、葡糖醛酸內(nèi)酯還原酶(EC1.1.1.20)。另外，大量具有包括糖的寬底物范圍的O2依賴性醇氧化酶將是有用的(EC1.1.3.XX)，包括山梨醇/甘露醇氧化酶(EC1.1.3.40)、己糖氧化酶(EC1.1.3.5)、醇氧化酶(EC1.1.3.13)以及香草醛氧化酶(EC1.1.3.38)。PQQ依賴性酶及在氧化細菌中存在的酶也可用于這些轉(zhuǎn)化。步驟7和7B：古羅糖醛酸轉(zhuǎn)化為D-葡糖二酸(7)且L-艾杜糖醛酸轉(zhuǎn)化為艾杜糖二酸(7B)。這些步驟可用糖醛酸脫氫酶家族的酶(EC1.1.1.203)或如本文所述的氧化酶完成。糖醛酸脫氫酶的實例包括SEQIDNO：1-6，并且其中的任一個或任何組合都可用于進行步驟7和7B。步驟7A：4-脫氧-5-赤型-己酮糖糖醛酸(DEHU)轉(zhuǎn)化為3-脫氧-D-赤型-2-己酮糖二酸(DDH)。步驟5中所述相同的酶將適用于進行此轉(zhuǎn)化。類似于步驟5，對于步驟7和7B來說，鑒定具有所述活性的酶，其是NAD(P)-或PQQ-依賴性脫氫酶，而其他是FAD依賴性醛脫氫酶。NADP依賴性葡糖酸-5-脫氫酶的實例包括SEQNO：71-72且PQQ依賴性脫氫酶的實例包括SEQIDNO：73-84，并且其中的任一個或任何組合都可用于進行步驟7和7B。步驟8和8A：D-葡糖二酸轉(zhuǎn)化為5-脫氫-4-脫氧-葡糖二酸(DDG)(步驟8)和艾杜糖二酸轉(zhuǎn)化為DDG(步驟8A)。葡糖二酸脫水酶家族的酶(EC4.2.1.40)可用于進行這些步驟。此家族的酶已被克隆并且已顯示葡糖二酸有效地轉(zhuǎn)化為DDG。如以下克隆的葡糖二酸脫水酶的表中所示克隆兩種D-葡糖二酸脫水酶(EC4.2.1.40)。兩種酶對于葡糖二酸脫水為DDG展示極高活性，使用氨基脲測定，如步驟2中所述?？寺〉钠咸嵌崦撍覆襟E9和9A：D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為α-D-葡糖-己二醛糖-1，5-吡喃糖(9)且D-半乳糖轉(zhuǎn)化為D-半乳糖-己二醛糖(9A)。氧化酶，如半乳糖氧化酶家族的那些(EC1.1.3.9)，可用于此步驟。突變半乳糖氧化酶也被工程化以對葡萄糖具有活性且已有描述(Arnold，F(xiàn).H.等人ChemBioChem，2002，3(2)，781)。步驟9A可用類別EC1.1.3.9的酶進行。步驟10：α-D-葡糖-己二醛糖-1，5-吡喃糖轉(zhuǎn)化為α-D-葡吡喃糖醛酸(步驟10)且D-半乳糖-己二醛糖轉(zhuǎn)化為半乳糖醛酸(10A)此步驟可使用醛脫氫酶家族的酶進行。同樣，由步驟5的那些所鑒定的酶將適用于這兩個轉(zhuǎn)化。步驟11和11A：α-D-葡吡喃糖醛酸轉(zhuǎn)化為葡糖醛酸1，5-內(nèi)酯。如步驟5中所述的醛脫氫酶和氧化酶將適用于進行此步驟。在步驟7和7B中所述的糖醛酸脫氫酶也可適用于進行此步驟。步驟11A是半乳糖醛酸轉(zhuǎn)化為半乳糖酸。糖醛酸脫氫酶(EC1.1.1.203)，例如在步驟7和7B中所述的那些，將適用于進行此步驟。步驟12：果糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖。葡萄糖和果糖異構(gòu)酶(EC5.3.1.5)將適用于進行此步驟。步驟13：半乳糖酸轉(zhuǎn)化為5-脫氫-4-脫氧-D-葡糖二酸(DDG)。半乳糖酸脫氫酶家族的酶(EC4.2.1.42)可用于進行此步驟，且額外的酶可被工程化用于進行此步驟。步驟14：葡糖酸轉(zhuǎn)化為5-酮葡糖酸(5-KGA)。NAD(P)-依賴性脫氫酶家族(EC1.1.1.69)的許多酶已被克隆并對葡糖酸的氧化或5KGA的還原具有活性。舉例來說，合成來自葡糖桿菌屬(ExpasyP50199)的NADPH依賴性葡糖酸5-脫氫酶用于如本文所示在大腸桿菌中的最佳表達并且在pET24(pSGI-383)中進行克隆。表達所述酶并顯示其具有所需活性。適用于進行此步驟的額外的酶包括存在于葡糖桿菌屬中的PQQ依賴性酶家族中的那些(Peters，B.等人Appl.MicrobiolBiotechnol.，(2013)，97，6397)以及在步驟6中所述的酶。來自這些家族的酶也可用于從葡糖酸合成5KGA。步驟15：5-KGA轉(zhuǎn)化為L-艾杜糖醛酸。此步驟可用來自不同異構(gòu)酶家族的各種酶進行，如在實施例4中進一步描述。實例包括SEQIDNO：7-19的異構(gòu)酶或與SEQIDNO：7-19的異構(gòu)酶具有至少70％序列同一性的同源物；或由SEQIDNO：20-32的核酸編碼的異構(gòu)酶或其中任一個的同源物。步驟16：5-KGA轉(zhuǎn)化為(4S)-4，6-二羥基2，5-二酮己酸(2，5-DDH)。此脫水可用葡糖酸脫水酶家族中的酶(EC4.2.3.39)，如實施例5或步驟17中的所述的那些進行?？捎糜诓襟E16的葡糖酸脫水酶的實例包括SEQIDNO33-35(由SEQIDNO：36-38編碼，且其中的任一個或任何組合都可用于進行步驟16或其同源物。步驟17和17A：L-艾杜糖醛酸轉(zhuǎn)化為4-脫氧-5-蘇型-己酮糖糖醛酸(DTHU)且古羅糖醛酸轉(zhuǎn)化為4-脫氧-赤型-5-己酮糖糖醛酸(DEHU)。鑒定可用于進行此步驟的脫水酶家族的酶。來自葡糖酸或葡糖二酸脫水酶家族的酶將具有進行這些步驟的所需活性。此外，許多脫水酶家族(EC4.2.1.X)適用于進行這些步驟。具體說來，對1，2-二羥酸脫水以選擇性地產(chǎn)生2-酮酸的酶將是有用的，如以下家族的酶：EC4.2.1.6(半乳糖酸脫水酶)、EC4.2.1.8(甘露糖酸脫水酶)、EC4.2.1.25(阿拉伯糖酸脫水酶)、EC4.2.1.39(葡糖酸脫水酶)、EC4.2.1.40(葡糖二酸脫水酶)、EC4.2.1.67(巖藻糖酸脫水酶)、EC4.2.1.82(木糖酸脫水酶)、EC4.2.1.90(鼠李糖酸脫水酶)以及二羥酸脫水酶(4.2.1.9)。由于已知的酶選擇性是α-酮酸的產(chǎn)生，所以鑒定的酶將分別產(chǎn)生DEHU和DTHU作為反應(yīng)產(chǎn)物。步驟19：1，5-葡糖酸內(nèi)酯轉(zhuǎn)化為古羅糖醛酸內(nèi)酯。此步驟可通過醛醇氧化酶家族的酶(EC1.1.3.41)或在步驟6中所述的酶進行?？捎糜诓襟E19的醛醇氧化酶的實例包括SEQIDNO39-54或其任一個的同源物，或由SEQIDNO：47-54的核酸編碼的醛醇氧化酶或其任一個的同源物；并且其中的任一個或任何組合都可用于進行。步驟19.DDG轉(zhuǎn)化為FDCA以及制造酯化的DDG和FDCA的方法。本發(fā)明還提供DDG轉(zhuǎn)化為FDCA和FDCA酯的新型方法。FDCA的酯包括二乙酯、二丁酯及其他酯。所述方法包括通過DDG與醇、無機酸及任選的助溶劑接觸以產(chǎn)生DDG的衍生物來將DDG轉(zhuǎn)化為DDG酯。醇可為甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇、異丁醇、戊醇、己醇、庚醇、辛醇、壬醇、癸醇、十一醇、十二醇、十三醇、十四醇、十五醇、十六醇、十七醇、十八醇、十九醇、二十醇、二甲亞砜、二甲基甲酰胺、聚乙二醇、甲基異丁基酮、或任何C1-C20醇。無機酸可為硫酸、磷酸、高氯酸、硝酸、鹽酸、氫氟酸、氫溴酸及氫碘酸。助溶劑可為以下任一種或任何混合物：THF、丙酮、乙腈、醚、乙酸丁酯、二噁烷、氯仿、二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、己烷、甲苯及二甲苯。醇、無機酸及助溶劑的任何組合都可用于反應(yīng)中。酯化的DDG可隨后轉(zhuǎn)化為酯化的FDCA，例如通過將其與酸催化劑接觸而實現(xiàn)。DDG純化用于脫水或酯化的DDG純化是通過酸化DDG，例如通過借助于添加濃HCl將反應(yīng)的pH降至pH～2.5來進行。在此pH下，通過過濾除去蛋白質(zhì)和任何殘余的葡糖二酸沉淀并且對混合物進行凍干以得到由DDG和反應(yīng)鹽組成的白色粉末。在通過過濾除去酶之后，可在中性pH下凍干混合物。在沒有進一步純化的情況下，DDG可隨后被脫水以得到2，5-FDCA，或在脫水之前被酯化成二丁基DDG(或二乙基DDG)。純化或酯化DDG的一個或多個步驟可添加到本文所公開的產(chǎn)生DDG的任何方法和途徑中。也可使用從含水混合物中純化DDG的其他方法。這些方法包括使用捕獲鹽或DDG等的膜或離子交換樹脂進行分離。因此，本發(fā)明提供一種純化DDG的方法，其包括在溶液中酸化DDG，經(jīng)由濾膜過濾溶液，并且從溶液中(例如通過冷凍干燥或噴霧干燥)除去水。含有DDG的溶液可被酸化至2.5-3.5的pH或3.0-4.0的pH或3.5-4.5的pH或4.0-5.0的pH或4.5-5.5的pH或5.0-6.0的pH或5.5-6.5的pH或6.0-7.0的pH或6.5-7.5的pH或7.0-8.0的pH或7.5-8.5的pH或約8的pH。除去的水量可大于80％或大于85％或大于87％的水或大于90％的水或大于95％的水或大于97％或大于98％或大于99％來自包含DDG的溶劑的水?？色@得大于25摩爾％或30摩爾％或35摩爾％或40摩爾％或45摩爾％的產(chǎn)率。在一個實施方案中，所述方法不包括離子交換色譜步驟。用于合成FDCA和FDCA衍生物的方法本發(fā)明還提供合成FDCA的各種方法。用于合成FDCA的一種方法包括將DDG與醇、無機酸在高溫下接觸以形成FDCA。醇可為任何醇(例如，如上所述的那些中的任一種)，并且實例包括(但不限于)甲醇、乙醇、丙醇及丁醇。也可使用二醇。高溫可為大于70℃或大于80℃或大于90℃或大于100℃或大于110℃或大于120℃或大于130℃或大于140℃或大于150℃的溫度以形成FDCA。可實現(xiàn)大于20％或大于30％或大于35％或大于40％的反應(yīng)產(chǎn)率。本發(fā)明還提供用于合成FDCA衍生物的方法。所述方法包括將DDG的衍生物與無機酸接觸以產(chǎn)生FDCA的衍生物。無機酸可為例如硫酸或任何無機酸，如以上所述的那些。任選地，可在其與第二無機酸接觸之前純化DDG的衍生物。DDG或FDCA的衍生物的非限制性實例包括但不限于：甲基DDG、乙基DDG、丙基DDG、丁基DDG、異丁基DDG、二甲基DDG、二乙基DDG、二丙基DDG、二丁基DDG。所產(chǎn)生的FDCA的衍生物可為但不限于甲基FDCA、乙基FDCA、丙基FDCA、丁基FDCA、二甲基FDCA、二乙基FDCA、二丙基FDCA、二丁基FDCA以及異丁基FDCA。所產(chǎn)生的FDCA的衍生物對應(yīng)于方法中使用的DDG的衍生物。FDCA的衍生物可隨后被去酯化以產(chǎn)生FDCA。所述方法也可在氣相中，例如使用如下所述的參數(shù)進行。用于合成FDCA或FDCA衍生物的另一種方法包括將DDG或DDG衍生物(任何本文所述的)與無機酸在氣相中接觸，這可在以下短停留時間下完成，例如小于10秒或小于8秒、或小于6秒或小于5秒或小于4秒或小于3秒或小于2秒或小于1秒。停留時間是指樣品存在于高溫流過型反應(yīng)器的反應(yīng)區(qū)中的時間。所述方法也可在高溫下進行，例如在大于150℃、大于200℃、大于250℃、大于300℃或大于350℃的溫度下?？色@得大于25摩爾％或大于30摩爾％或大于40摩爾％或大于45摩爾％或大于50摩爾％的產(chǎn)率。用于合成FDCA的另一種方法包括將DDG與無機酸在超過80℃或90℃或100℃或110℃或120℃的溫度下接觸。用于合成FDCA的另一種方法包括將DDG與無機酸在無水反應(yīng)條件下接觸。在不同實施方案中，無水條件可通過在本文所公開的合成FDCA的任何方法中凍干DDG以使得DDG含有以下含量的水來建立：小于10重量％或小于9重量％或小于8重量％或小于7重量％或小于6重量％或小于5重量％或小于4重量％或小于3重量％水或小于2重量％的水。如本文所述用于合成FDCA及其衍生物的本發(fā)明方法提供比已經(jīng)可利用的明顯更高的產(chǎn)率。在不同的實施方案中，可獲得以下FDCA(對DDG)的摩爾產(chǎn)率：大于10％或大于15％或大于20％或大于25％或大于30％或大于35％或大于40％或大于45％或大于50％或大于60％或大于65％、或約40％至約70％、或約45％至約65％、或約50％至約60％。實施例實施例1-步驟2，葡糖酸轉(zhuǎn)化為3-脫氫-葡糖酸(DHG)具有用于葡糖酸脫水的天然活性的酶適用于本發(fā)明中(EC4.2.1.39)。來自這個家族的三種酶如表1所示被克隆。酶pSGI-365被克隆并且被證明是具有寬底物范圍的脫水酶，其對于葡糖酸的脫水具有強活性(Kim，S.Lee，S.B.Biotechnol.BioprocessEng.2008，13，436)。表1：在此實驗中使用的酶及同一性同源性。所有都在熒光假單胞菌中表達359_無色桿菌屬365_E3HJU7pSGI-360_不動桿菌屬(SGI)7879pSGI-359_無色桿菌屬(SGI)95pSGI-365_氣單胞菌屬蛋白359、360及365(分別為SEQIDNO33-35)對于葡糖酸的脫水合成(凝膠未示出)展示每mg為2-5μmol/min的粗酶裂解物活性。將pSGI-359通過用硫酸銨沉淀并重新溶解于緩沖液中來分離并且通過氨基脲測定進行分析。由氨基脲測定圖計算出針對葡糖酸脫水的46.2U/mL或5.3U/mg(1單位＝μmol/min)的活性。將含有Kpi10mMpH8.0且具有2mMMgCl2和3.5gr(0.016摩爾)葡糖酸鈉的反應(yīng)緩沖液(93mL)與7mL先前的葡糖酸脫水酶溶液混合。將反應(yīng)物在45℃下培養(yǎng)16h，之后通過HPLC-MS分析一個等分試樣(圖4)。如圖4所示，產(chǎn)生具有DHG的分子量的一種新的主要產(chǎn)物。該產(chǎn)物還顯示具有DHG脫水酶的活性。所有蛋白質(zhì)都在pRANGERTM(Lucigen，Middleton，WI)表達載體上克隆并在熒光假單胞菌菌株中表達。pRANGERTM是廣泛的宿主可商購獲得的質(zhì)粒載體，其含有pBBR1復(fù)制子、卡那霉素抗性及用于基因的誘導(dǎo)型表達的pBAD啟動子。對于酶測定，將用于量化α酮酸的氨基脲測定的修改版本用于計算每種酶的活性(Kim，S.；Lee，S.B.BiochemJ.2005，387，271)。SEQIDNO：30-32和33-35顯示分別為葡糖酸脫水酶#0385、#0336及E3HJU7的氨基酸及核苷酸序列。實施例2-步驟3-3-脫氫-葡糖酸(DHG)轉(zhuǎn)化為(4S)-4，6-二羥基2，5-二酮己酸(2，5-DDH)。酶家族(EC1.1.1.127)可用于進行此步驟。兩個實例是2-脫氫-3-脫氧-D-葡糖酸5-脫氫酶和DHG脫氫酶。來自此家族的五種酶如下表2中所示進行克隆。pRANGERTM載體用于每個情況。表2：DHG氧化還原酶(或2-脫氫-3-脫氧-D-葡糖酸5-脫氫酶)的克隆由步驟2中的葡糖酸的脫水制備的產(chǎn)物被用作分析表2的裂解物的底物。如下表3中所示，在測量NADH形成的測定中鑒定對于DHG的氧化顯示活性的酶(在340nm下吸光度提高)。表3：使用DHG氧化還原酶的DHG氧化為2，5-DDH的活性計算。單位＝μmol/min的NADH通過這些酶形成2，5-DDH的進一步驗證示于步驟16中，其中顯示在酸性pH下用pSGI-395還原2，5-DDH(通過5KGA的脫水制得)。實施例3-步驟7和7B-古羅糖醛酸轉(zhuǎn)化為D-葡糖二酸(7)且L-艾杜糖醛酸轉(zhuǎn)化為艾杜糖二酸(7B)。為了證明步驟7和7B，進行以下研究。糖醛酸脫氫酶(EC1.1.1.203)是氧化葡糖醛酸和半乳糖醛酸的酶。從表4和5中所示的菌株克隆與已知糖醛酸脫氫酶具有序列相似性的三種酶(Expasy：Q7CRQ0；Prather，K.J等人，J.Bacteriol.2009，191，1565)。表4-克隆的糖醛酸脫氫酶生物體pSGI(pET28)基因ID表達土壤桿菌#474#8807BL21DE3根瘤菌#475#8958BL21DE3假單胞菌#476#1770BL21DE3表5-序列同一性#475#476Q7CRQ0474_土壤桿菌734990475_根瘤菌5174476_假單胞菌50用來自pET28的His標簽表達每種蛋白并且在其篩選之前進行純化。粗裂解物和純化酶的蛋白質(zhì)凝膠示于圖1的凝膠中。在純化之后，關(guān)于針對葡糖醛酸鹽的活性以及針對古羅糖醛酸鹽和艾杜糖醛酸鹽的活性對所有酶進行測試。在不同的底物濃度下進行動力學(xué)測量并且為每種酶計算的活性和Km值示于表6中。所有酶都顯示針對葡糖醛酸鹽以及針對L-艾杜糖醛酸和古羅糖醛酸的良好活性。表6：純化的糖醛酸脫氫酶的活性和Km值。表4中所示的每個質(zhì)粒都在BL21DE3大腸桿菌細胞中轉(zhuǎn)化。將澄清的裂解物與等體積(25mL)的平衡緩沖液混合并在NiNTA柱上純化。通過將0.050mL每種純化酶的各種稀釋液與0.95mL反應(yīng)緩沖液(100mMTrisHCl，pH8.0、50mMNaCl、0.75mMNAD+)混合來測量每種純化酶的活性。通過在340nm下監(jiān)測NADH的形成來測量反應(yīng)進程。圖6a和6b提供葡糖醛酸鹽和艾杜糖醛酸鹽的氧化的Lineweaver-Burk繪圖，其中所有三種酶都示于圖6中。在給出上表所示活性的所有酶的情況下都獲得了明顯的正斜率。糖醛酸脫氫酶的蛋白質(zhì)序列顯示為SEQIDNO：1-3且基因顯示為SEQIDNO：4-6。吡咯并喹啉(PQQ)依賴性醛脫氫酶也顯示對于古羅糖醛酸鹽和艾杜糖醛酸鹽的氧化的良好活性。這些是可溶性周質(zhì)酶，在它們的周質(zhì)靶序列除去之后在大腸桿菌胞質(zhì)液中表達。以每毫克總裂解物蛋白質(zhì)的單位(μmol/min)計的粗裂解物的活性示于下表6A中。如果純化的話，每種酶的實際活性是至少2-5倍高(參見圖3中的表達)。表6A：在艾杜糖醛酸和古羅糖醛酸下PQQ依賴性脫氫酶的活性(單位＝μmol/min)酶艾杜糖醛酸U/mg古羅糖醛酸U/mgP75804(SEQIDNO：73)8.73.29522(SEQIDNO：74)7.36.16926(SEQIDNO：75)9.24.17510(SEQIDNO：76)7.33.77215(SEQIDNO：77)14.28.38386(SEQIDNO：78)4.31.5根據(jù)以下方案，使用人工電子受體DCPIP(2，6-二氯靛酚)測量表6A中所示的活性：在0.95mL含有0.2mMDCPIP、0.2mMPMS(phnazineethosulffate)及底物(10-40mM)的20mM三乙醇胺(pH8.0)中，添加0.050mL酶(作為粗裂解物或用緩沖液10-100x稀釋)并且反應(yīng)進展是根據(jù)在600nm下DCPIP吸光度的變化。因為在其自然狀態(tài)下這些酶在膜電子傳遞鏈中將電子轉(zhuǎn)移給其他蛋白質(zhì)或輔因子，所以使用人工電子受體測量體外活性，其中DCPIP是最常見的。表6A中的酶針對許多其他醛有活性，包括丁醛、丁醛及甘油(而非葡萄糖)。因此，這些酶將氧化艾杜糖醛酸鹽和古羅糖醛酸鹽的醛基以分別得到艾杜糖醛酸和葡糖二酸。為了證實此選擇性，這些酶中的兩個，#403和#412，通過將其與#403(天然大腸桿菌酶)的周質(zhì)靶序列融合而在大腸桿菌的周質(zhì)中表達。兩種蛋白質(zhì)都在周質(zhì)中表達，但與胞質(zhì)液相比水平較低。之前的重組細胞以良好的產(chǎn)率將苯甲醛氧化為安息香酸且以較低產(chǎn)率由古羅糖醛酸鹽和艾杜糖醛酸鹽產(chǎn)生葡糖二酸和艾杜糖二酸。實施例4-步驟-15：5-酮葡糖酸(5-KGA)轉(zhuǎn)化為L-艾杜糖醛酸(15)或古羅糖醛酸(15A)。此實施例說明了能夠?qū)?-KGA異構(gòu)化為艾杜糖醛酸(步驟15)或古羅糖醛酸(步驟15A)的酶的鑒定。來自三個不同異構(gòu)酶家族的十三種酶如表7所示被克隆，而其序列同一性％示于表8中。表7：所克隆的異構(gòu)酶表8：異構(gòu)酶的同一性％如表8所示，選擇每個家族內(nèi)具有中等同源性(加下劃線)的酶進行克隆。數(shù)據(jù)證明來自所有家族的酶對于5-KGA的異構(gòu)化(得到L-艾杜糖醛酸鹽作為主要產(chǎn)物)都顯示活性。來自5.3.1.17家族的兩種酶(433和434)也在實施例中使用，顯示從5-酮葡糖酸(5KGA)形成DDG。使用酶促方法測量使用表7的酶對于5KGA和艾杜糖醛酸的異構(gòu)化的活性，該方法通過其針對兩種不同酶的活性檢測產(chǎn)物的形成。舉例來說，5KGA的異構(gòu)化是通過使用糖醛酸脫氫酶(pSGI-476)測量產(chǎn)物艾杜糖醛酸鹽的活性來檢測。艾杜糖醛酸的異構(gòu)化是通過測量產(chǎn)物5KGA的5KGA還原酶(pSGI-383，EC1.1.1.69)活性來檢測。還通過GC-MS檢測產(chǎn)物的存在。來自所有家族的酶顯示出針對5KGA和艾杜糖醛酸鹽的異構(gòu)化的變化活性將來自EC5.3.1.12的兩種酶用于無細胞的反應(yīng)中以便異構(gòu)化5KGA且最終產(chǎn)生如實施例中所述的DDG。將酶純化并且通過凝膠電泳顯示出單個條帶。將純化的異構(gòu)酶用于使用含有5KGA或艾杜糖醛酸的裂解物和緩沖液的反應(yīng)中。使用HPLC和先前所述的酶促方法證明產(chǎn)物形成。使用HPLC和酶測定的培養(yǎng)17h的結(jié)果示于圖7a中。所有酶都對5KGA和艾杜糖醛酸的異構(gòu)化顯示良好活性。通過pSGI433、pSGI434、pSGI435及pSGI436的艾杜糖醛酸異構(gòu)化的產(chǎn)率當酶促測量時分別是56％、48％、42％(436未測量)且當通過HPLC測定測量時分別是78.8％、78.5％、73.3％及76.6％。通過相同酶的5KGA異構(gòu)化的16h之后的產(chǎn)率當通過酶促測定測量時分別是18％、17％及19％(436未測量)，且當通過HPLC測定測量時分別是16.6％、17.8％、16.3％及16.9％。EC5.3.1.12酶來自EC5.3.1.12家族的酶(葡糖醛酸異構(gòu)酶)也通過凝膠電泳純化，分離，并通過與含有5mM的5KGA或艾杜糖醛酸的緩沖液(50mMHEPES、1mMZnCl2，pH8.0)混合制備反應(yīng)物。將反應(yīng)物在30℃下培養(yǎng)并且使用HPLC和酶促法分析產(chǎn)物形成。結(jié)果示于圖7b中。5.3.1.17酶酶pSGI-478和pSGI-479(5-脫氫-4-脫氧-D-葡糖醛酸異構(gòu)酶)顯示了針對5KGA和艾杜糖醛酸兩者的異構(gòu)化活性。此活性同樣用如上的酶促測定來證實。通過pSGI-478和-479的艾杜糖醛酸的異構(gòu)化產(chǎn)率當酶促測量時分別是50％和37％，且當通過HPLC測量時分別是20％和18％。5KGA異構(gòu)化的產(chǎn)率當酶促測量時分別是23％和26％，且當通過HPLC測量時分別是24％和16％。結(jié)果示于圖7a中。5.3.1.n1酶通過凝膠電泳純化此家族中的酶。使用如上所述的酶促測定測量產(chǎn)物形成且結(jié)果示于圖8中。在此家族中克隆的所有酶都顯示對于5KGA和艾杜糖醛酸的異構(gòu)化具有活性。在每個情況下，將質(zhì)粒在BL21DE3中轉(zhuǎn)化并且在NiNTA柱上純化蛋白質(zhì)。實施例5：步驟16-5-酮葡糖酸(5KGA)轉(zhuǎn)化為(4S)-4，6-二羥基2，5-二酮己酸(2，5-DDH)。在步驟2(實施例1)中所述的三種葡糖酸脫水酶如實施例1中所述表達，連同來自步驟8的純化的葡糖二酸脫水酶一起。進行針對活性的酶促反應(yīng)并且HPLC-MS分析顯示2，5-DDH的形成(圖9)，其還通過以下事實來證實：新產(chǎn)物的形成伴隨有僅在含有葡糖酸脫水酶的樣品中的5-KGA的還原，并且還通過用DHG脫水酶(pSGI-395)的酶促測定。在340nm下的良好斜率表示當混合NADH、pSGI-395裂解物及先前反應(yīng)物的等分試樣時獲得較大的酶活性(數(shù)據(jù)未示出)。此結(jié)果聯(lián)合HPLC分析證明所檢查的葡糖酸脫水酶將5KGA脫水為2，5-DDH。實施例6：步驟19-1，5-葡糖酸內(nèi)酯轉(zhuǎn)化為古羅糖醛酸δ-內(nèi)酯。1，5-葡糖酸內(nèi)酯氧化是來自醛醇氧化酶(EC1.1.3.41)家族的酶的副活性。這些酶氧化各種醛醇，如山梨糖醇、木糖醇、甘油等。鑒定對1，5-葡糖酸內(nèi)酯的氧化具有活性的酶，如下表6中所示。表6.對1，5-葡糖酸內(nèi)酯具有活性的醛醇氧化酶。*粗裂解物使用表6中所示的所有純化酶的裂解物制備反應(yīng)物。在50mM具有0.5mg/mL過氧化氫酶的K-磷酸鹽緩沖液pH7.0中制備反應(yīng)物并在30℃下培養(yǎng)。通過HPLC-MS分析觀察新產(chǎn)物，在與可信標準比較之后展示與古羅糖醛酸相同的保留時間(圖10)。這是通過GC-MS證實，其中產(chǎn)物還具有與古羅糖醛酸相同的MS指紋。因此，很明顯在表中所述的醛醇氧化酶氧化1，5-葡糖酸內(nèi)酯的6-OH以產(chǎn)生古羅糖醛酸內(nèi)酯。在具有HisTag的pET28a中克隆所有的醛醇氧化酶并且在BL21DE3中表達并在NiNTA柱上純化。實施例7-FDCA及其他中間體的合成純化的DDG單鉀鹽被用于脫水成2，5-FDCA。添加硫酸到DDG中并且在60℃下攪拌反應(yīng)。(通過HPLC-MS)計算的原位產(chǎn)率是～24％和～27％。合并反應(yīng)溶液，然后通過倒入冰中(以中和熱)來稀釋。添加大致相等體積的THF，并且將溶液轉(zhuǎn)移至分液漏斗。添加氯化鈉鹽直到實現(xiàn)分離。在添加之間攪動溶液以便最佳可能的溶解。除去水層，并且用NaCL飽和溶液洗滌THF層3x。添加硫酸鈉并將溶液靜置過夜。再次形成兩層過夜。丟棄水層，然后添加硅膠到溶液中。隨后經(jīng)由旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將其濃縮成固體。將固體裝載到二氧化硅快速柱中，然后經(jīng)由色譜法分離。濃縮并干燥級分。分離產(chǎn)率是173.9mg。校正產(chǎn)率：24.9％。1H和13CNMR及HPLC-MS分析證實產(chǎn)物。DDG二丁基-2，5-FDCA在BuOH/H2SO4中的脫水使用Dean-Stark裝置完成含有在BuOH中的脫水鹽的非衍生化的凍干DDG的脫水。在這些條件下，添加DDG到BuOH中，然后添加H2SO4并在140℃下加熱反應(yīng)。在攪拌4h之后，HPLC-MS分析顯示DDG消失并形成二丁基2，5-FDCA。(通過HPLC-MS)計算的原位產(chǎn)率是36.5％。.將混合物用水、1％NaOH及再次用水提取。隨后濃縮有機層至37.21g的最終質(zhì)量。除去此質(zhì)量的一部分(3.4423g)并且使用HPLC純化0.34g的二丁基-2，5-FDCA。將分離產(chǎn)物的產(chǎn)率外推至由反應(yīng)分離的化合物的總量(37.21g)并且考慮到存在于原始DDG中的鹽量(～60重量％純的)，反應(yīng)產(chǎn)率經(jīng)計算為42％。1H和13CNMR及HPLC-MS分析證實產(chǎn)物。二丁基DDG的合成另一方面，本發(fā)明提供一種用于合成DDG衍生物的方法。所述方法包括將DDG與醇、無機酸及任選的助溶劑接觸以產(chǎn)生DDG的衍生物。任選地，可純化DDG的衍生物。反應(yīng)可具有以下DDG衍生物的產(chǎn)率：至少10摩爾％產(chǎn)率或至少15摩爾％產(chǎn)率或至少20摩爾％產(chǎn)率或至少25摩爾％或至少30摩爾％或至少35摩爾％產(chǎn)率或至少40摩爾％產(chǎn)率。無機酸可為硫酸且醇可為甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、異丁醇或任何C1-C20醇。在不同實施方案中，助溶劑可為以下任一種：THF、丙酮、乙腈、醚、乙酸丁酯、二噁烷、氯仿、二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、己烷、甲苯及二甲苯。當醇為乙醇時，DDG衍生物將為DDG一乙酯和/或DDG二乙酯。當醇為丁醇時，DDG衍生物將為DDG一丁酯和/或DDG二丁酯。DDG單鉀鹽用于根據(jù)以下方案進行的衍生化。在配備有機械攪拌器和加熱套的1L莫頓型凹入的反應(yīng)容器中裝入60∶40DDG∶KCl(31.2mmol)、BuOH及庚烷。在單獨的小瓶中，添加硫酸到水中，并且允許在溶解之后冷卻。隨后添加溶液到燒瓶中。將溶液保持在30℃下。將沉淀濾掉，濃縮。將剩余的凝膠溶于EtOAc中，然后用溶液點樣TLC板并且用磷鉬酸混合物對板噴霧，接著在熱板上加熱至至少150℃以鑒定DDG-DBE級分。分離產(chǎn)率：4.62g(15.2mmol，47％產(chǎn)率)，＞98％純度。1H和13CNMR及HPLC-MS分析證實產(chǎn)物。不同溶劑可用于DDG酯的合成中，如BuOH(5％-95％v/v)與以下助溶劑的混合物如THF、丙酮、乙腈、醚(二丁醚、二乙醚等)、酯如乙酸丁酯、1，6-二噁烷、氯仿、二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、己烷、甲苯及二甲苯。反應(yīng)催化劑如酸(硫酸、鹽酸、多磷酸或固定化酸如DOWEX)或基質(zhì)(吡啶、乙胺、二乙胺、三氟化硼)或其他催化劑通常用于羧酸類的酯化。在n-BuOH/H2SO4中二丁基DDG脫水為二丁基FDCA在丁醇中制備DDG-DBE(二丁基酯)的儲備溶液并轉(zhuǎn)移到清潔的、干燥的100mL圓底燒瓶中，該燒瓶配備有攪拌棒。向燒瓶中添加25mL濃硫酸。密封燒瓶，接著在60℃下攪拌2小時。原位產(chǎn)率經(jīng)計算為～56％。濃縮反應(yīng)溶液并且將殘余物溶于MTBE中并轉(zhuǎn)移到分液漏斗，然后用水洗滌。濃縮回收的有機層，然后經(jīng)由HPLC分離，分離產(chǎn)量：250.7mg(～90％純度)和分離產(chǎn)率：35％(針對純度來校正)。1C和13CNMR及HPLC-MS分析證實產(chǎn)物。實施例8-從5-KGA無細胞合成DDG和FDCA及衍生物(路線2A)此實施例說明了根據(jù)方案6(2B的子方案)使用純化酶將5KGA酶促轉(zhuǎn)化為DDG，并且還說明了使用化學(xué)步驟將所產(chǎn)生的DDG脫水為FDCA。所述方案包括以下步驟：5KGA的異構(gòu)化(步驟15)且接著氧化為艾杜糖二酸(步驟7B)。DDG還在不同化學(xué)條件下脫水為FDCA。使用來自大腸桿菌的葡糖二酸脫水酶進行最后一步(步驟8A)。方案6示于圖11中。所述方案使用從5-KGA開始的DDG的無細胞酶促合成進行。所述方案包括執(zhí)行步驟15、7B及8A(參見圖2d)。使用兩種額外的蛋白質(zhì)來完成反應(yīng)路徑，第一種為NADH氧化酶(步驟A)，其在氧的存在下將NAD+輔因子再循環(huán)；和過氧化氫酶(步驟B)，其分解由NADH氧化酶的作用產(chǎn)生的過氧化物。酶示于以下表7中。所有酶都含有HisTag并且使用Ni-NTA柱來純化。DDG合成的產(chǎn)率經(jīng)計算為至少88-97％。表7：針對反應(yīng)的每種異構(gòu)酶純化500mL液體培養(yǎng)物。除表7中所示的酶之外，每個反應(yīng)還含有50mMTrisHCl(pH8.0)、50mMNaCl、1mMZnCl2和2mMMgCl2、1mMMnCl2和1mMNAD+。在培養(yǎng)16h之后通過HPLC分析反應(yīng)并且圖12呈現(xiàn)色譜圖。對于脫水為FDCA，將兩個樣品的反應(yīng)混合物合并并且凍干成白色粉末，將其分成兩個樣品并將每個溶于具有0.25MH2SO4的AcOH中或具有0.25MH2SO4的4.5mLBuOH中。在120℃下，在密封小瓶中加熱兩個反應(yīng)2-4h反應(yīng)產(chǎn)物示于圖13中。樣品1和2分別代表可信標準和來自AcOH/H2SO4中的反應(yīng)的3h時間點。用樣品1對樣品2進行摻加得到單峰，進一步證實了FDCA產(chǎn)物。樣品1和3(圖13)分別代表可信標準和來自BuOH/H2SO4中的反應(yīng)的4h時間點。由酶促反應(yīng)形成FDCA進一步證實了DDG在這些樣品中的存在。實施例9-由葡萄糖和葡糖酸合成DDG此實施例顯示葡萄糖和葡糖酸酶促轉(zhuǎn)化為DDG。用純化酶進行反應(yīng)，且粗裂解物作為催化劑。如下表中所示在生物反應(yīng)器中合并酶和底物：1.來自具有質(zhì)粒的重組大腸桿菌的500mL液體培養(yǎng)物的裂解物2.來自BL21DE3/pSGI-434的2L液體培養(yǎng)物的裂解物3.純化酶，～30個單位的活性(或3mg純化的GlucD)4.來自250mL培養(yǎng)物的裂解物在35℃下培養(yǎng)反應(yīng)物并且溶解氧和pH分別保持在20％和8。通過HPLC-MS分析時間點并且結(jié)果示于圖17b中提取的色譜圖驗證DDG質(zhì)量(未示出)和相應(yīng)的MS片段。結(jié)果清楚地顯示在用葡萄糖或葡糖酸進行的酶培養(yǎng)期間DDG的產(chǎn)生。實施例10-用于重組葡糖二酸脫水酶的表達盒的構(gòu)建下列實施例描述含有D-葡糖二酸脫水酶活性(GDH，EC4.2.1.40)的編碼序列的重組核酸構(gòu)建體的形成用于在大腸桿菌細胞中異源表達。將編碼來自大腸桿菌的D-葡糖二酸脫水酶(Expasy：P0AES2；)、不動桿菌屬ADP1(Expasy：P0AES2)以及專有的假單胞菌菌株(#8114)的基因由基因組DNA進行PCR擴增。隨后將每個PCR擴增基因克隆到細菌轉(zhuǎn)化載體pET24a(+)中，其中每個GDH基因的表達都位于T7啟動子的控制下。還通過測序確認證實每個PCR擴增插入物的核苷酸序列。實施例11-表達重組葡糖二酸脫水酶的大腸桿菌菌株將如實施例9中所述構(gòu)建的每個表達載體通過熱激介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化引入NovaBlue(DE3)大腸桿菌中。在補充有卡那霉素(50μg/ml)的LB瓊脂上選出推定的轉(zhuǎn)化體。將適當?shù)腜CR引物用于集落-PCR測定中以確定含有每個表達載體的陽性克隆。對于每個表達載體，從轉(zhuǎn)化板中挑取菌落并允許其在30℃下在補充有卡那霉素(50μg/ml)的液體LB培養(yǎng)基中生長兩天。隨后將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到含有15％甘油的小瓶中并作為冷凍的純培養(yǎng)物保存在-80℃下。實施例12-通過使用表達GDH酶的重組大腸桿菌細胞的細胞裂解物體外合成DDG的示范此實施例描述了如何使用在大腸桿菌細胞中產(chǎn)生的重組葡糖二酸脫水酶(GDH)實現(xiàn)DDG中間體的體外合成。細胞裂解物的制備：在30℃下，在轉(zhuǎn)速預(yù)設(shè)為250rpm的旋轉(zhuǎn)振蕩器上將如先前在實施例2中所述構(gòu)建的重組菌株單獨在3mL補充有卡那霉素(50μg/ml)的液體LB培養(yǎng)基中生長1天。此預(yù)培養(yǎng)物被用于接種100mL含有卡那霉素(50ug/ml)的TB培養(yǎng)基，然后在30℃下在預(yù)設(shè)為250rpm的旋轉(zhuǎn)振蕩器上培養(yǎng)2-3小時直到早期對數(shù)期(OD600～0.5-0.6)，之后添加異丙基D-1硫代半乳糖苷(IPTG；0.25mM最終濃度)以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達。允許細胞在30℃下再生長18小時，之后將其通過離心收獲，再懸浮于15mL溶解緩沖液(10mM磷酸鹽緩沖液pH7.8，2mMMgCl2)中并且通過超聲處理來溶解。使用標準預(yù)制的SDS-PAGE凝膠系統(tǒng)(BioRad)量化重組酶在大腸桿菌細胞中的產(chǎn)生，并且根據(jù)Gulick等人(Biochemistry39，4590-4602，2000)所述的工序測量比放射性。隨后測試粗細胞裂解物或純化酶(使用HisTag)將一定克數(shù)的葡糖二酸轉(zhuǎn)化為DDG的能力，如下文中更詳細地描述。葡糖二酸的酶促脫水制備使用葡糖二酸脫水酶的葡糖二酸的大規(guī)模氧化。將350mL水、25g葡糖二酸鈉鹽(0.1摩爾)及4.5克KOH(0.8摩爾)在錐形燒瓶中混合。通過減緩添加5MKOH溶液(～3mL)溶解殘留的固體葡糖二酸并且調(diào)節(jié)pH至7.4。在此溶液中添加100mg純化的葡糖二酸脫水酶和2mMMgCl2，并且在30℃下將混合物置于軌道振蕩器中20h。次日，通過過濾除去沉淀。反應(yīng)的pH基本上未改變。反應(yīng)分析展現(xiàn)在溶液中僅DDG存在，指示＞95％產(chǎn)率。來自酶促反應(yīng)的DDG產(chǎn)物的純化：通過使用如下兩項技術(shù)中的任一種純化經(jīng)由酶促脫水產(chǎn)生的DDG。用6MHCl將酶促脫水反應(yīng)酸化至pH～3.0，過濾以除去沉淀，且隨后凍干以產(chǎn)生由DDG和鹽組成的白色粉末。如果反應(yīng)經(jīng)由10KDa膜過濾以除去蛋白質(zhì)然后凍干，可獲得相同的DDG純度(但較低量的鹽)。在沒有更進一步純化的情況下，可將先前兩個凍干粉末脫水成FDCA(或其酯)或可酯化為二丁基DDG，如本申請的其他實施例中所示。HPLC-MS分析的結(jié)果指示DDG產(chǎn)物構(gòu)成由兩項純化技術(shù)的任一項獲得的樣品中收物的至少95％。實施例13-在一步化學(xué)反應(yīng)中由DDG體外合成FDCA的示范申請者已發(fā)現(xiàn)FDCA(即游離酸形式)的合成可通過在H2SO4存在下DDG化學(xué)轉(zhuǎn)化為FDCA而實現(xiàn)。反應(yīng)如下進行。將大約20mgDDG酸(如實施例3中所述先前被純化的含有鹽的粗凍干粉末)和0.25MH2SO4添加到含有1mL水和1mLDMSO的氣密的密封管中。發(fā)現(xiàn)DDG完全溶于此溶液中。在105℃下攪拌反應(yīng)18小時小時。對粗反應(yīng)樣品進行的HPLC-MS分析結(jié)果指示形成FDCA游離酸(FDCA：2，5-呋喃二甲酸)作為主要產(chǎn)物以及微量的一些其他未鑒定的副產(chǎn)物。在HPLC-MS分析中作為對照，在相同條件下分析商用的FDCA。實施例14-FDCA酯(二甲基酯、二乙基酯、二丁基酯及異丙基酯)的體外合成的示范由純化的DDG合成二乙基-2，5FDCA：在氣密的密封管中，添加18mLEtOH、0.2克(1毫摩爾)DDG酸(先前如實施例11中所述純化的)以及0.25MH2SO4。DDG酸并不完全溶于此溶液中。在105℃下溫和地攪拌反應(yīng)物18小時。粗反應(yīng)樣品的GC-MS分析結(jié)果顯示形成二乙基-FDCA作為主要產(chǎn)物。作為對照，將真正的FDCA在化學(xué)上合成，酯化為二乙基-FDCA并在相同的條件下分析。實施例15-由純化的DDG合成二丁基2，5FDCA在氣密的密封管中，添加18mLn-BuOH、0.2克(1毫摩爾)DDG酸(先前如實施例11中所述純化的)以及0.25MH2SO4。DDG酸并不完全溶于此溶液中。在105℃下溫和地攪拌反應(yīng)物18小時。如圖15所示，反應(yīng)樣品的GC-MS分析結(jié)果顯示形成二乙基FDCA(FDCA：2，5-呋喃二甲酸)作為主要產(chǎn)物。作為對照，將真實FDCA在化學(xué)上合成，酯化為二乙基-FDCA并在相同的條件下分析。實施例16-由粗DDG合成二丁基2，5FDCA(未純化的)：將0.2克(1毫摩爾)粗DDG酸添加到含有18mLn-BuOH的氣密密封管中，然后添加0.25MH2SO4，粗DDG酸是直接由實施例11中所述的葡糖二酸的酶促脫水獲得的未純化的凍干粉末。粗DDG酸并不完全溶于此溶液中。在105℃下溫和地攪拌反應(yīng)物18小時。粗反應(yīng)樣品的GC-MS分析結(jié)果顯示形成二乙基FDCA(FDCA：2，5-呋喃二甲酸)作為主要產(chǎn)物。GC-MS結(jié)果顯示污染物鹽在粗的/未純化的凍干粉末中的存在不會顯著影響反應(yīng)結(jié)果。作為對照，將真實FDCA在化學(xué)上合成酯化為二乙基-FDCA并在相同的條件下分析。實施例17-使用固定化酸的FDCA和/或酯的體外產(chǎn)生在工業(yè)實踐中，固定化酸為脫水的進行提供許多優(yōu)點，這是由于其通常在幾種類型的溶劑(含水、有機或混合等)中操作。另外，其可容易再循環(huán)并重新使用。遵循一些實施例，使用固定化的15(RohmandHaas，Philadelphia，PA)和50WX8(DowChemicalCo，Midland，MI)合成FDCA的酯。通過使用50WX8由粗DDG合成二丁基FDCA在一個氣密密封管中，將2mL正丁醇、20mg粗DDG酸(含有鹽的未純化的凍干粉末)及200mg50WX8合并。DDG并不完全溶于此溶液中。在105℃下溫和地攪拌反應(yīng)物18小時。粗反應(yīng)樣品的GC-MS分析結(jié)果顯示形成二乙基-FDCA(FDCA：2，5-呋喃二甲酸)作為主要產(chǎn)物。此GC-MS結(jié)果顯示污染物鹽(磷酸鹽和NaCl)在粗的/未純化的凍干粉末中的存在不會顯著影響反應(yīng)結(jié)果。作為對照，將真實FDCA在化學(xué)上合成酯化為二乙基-FDCA并在相同的條件下分析。通過使用15由粗DDG合成二丁基FDCA在一個氣密密封管中，將2mL正丁醇、20mg粗DDG酸(含有鹽的粗凍干粉末)及200mg15(RohmandHaas，Philadelphia，PA)合并。DDG并不完全溶于此溶液中。在105℃下溫和地攪拌反應(yīng)物18小時。粗反應(yīng)樣品的GC-MS分析結(jié)果顯示形成二乙基-FDCA(FDCA：2，5-呋喃二甲酸)作為主要產(chǎn)物。此GC-MS結(jié)果顯示污染物鹽(磷酸鹽和NaCl)在粗的/未純化的凍干粉末中的存在不會顯著影響反應(yīng)結(jié)果。作為對照，將真實FDCA在化學(xué)上合成酯化為二乙基-FDCA并在相同的條件下分析。通過使用15由粗DDG合成乙基FDCA在一個氣密密封管中，將2mL乙醇、20mg粗DDG酸(含有鹽的未純化的凍干粉末)及200mg15(RohmandHaas，Philadelphia，PA)合并。DDG并不完全溶于此溶液中。在105℃下溫和地攪拌反應(yīng)物18小時。粗反應(yīng)樣品的GC-MS分析結(jié)果顯示形成二乙基-FDCA(FDCA：2，5-呋喃二甲酸)作為主要產(chǎn)物。此GC-MS結(jié)果顯示污染物鹽(磷酸鹽和NaCl)在粗的/未純化的凍干粉末中的存在不會顯著影響反應(yīng)結(jié)果。作為對照，將商用的FDCA在化學(xué)上酯化為二乙基-FDCA并在相同的條件下分析。通過使用50WX8由粗DDG合成二乙基FDCA在一個氣密密封管中，將2mL乙醇、20mg粗DDG酸(含有鹽的未純化的凍干粉末)及200mg50WX8合并。DDG并不完全溶于此溶液中。在105℃下溫和地攪拌反應(yīng)物18小時。粗反應(yīng)樣品的GC-MS分析結(jié)果顯示形成二乙基-FDCA(FDCA：2，5-呋喃二甲酸)作為主要產(chǎn)物。此GC-MS結(jié)果顯示污染物鹽(磷酸鹽和NaCl)在粗的/未純化的凍干粉末中的存在不會顯著影響反應(yīng)結(jié)果。作為對照，將商用的FDCA在化學(xué)上酯化為二乙基-FDCA并在相同的條件下分析。實施例18-FDCA衍生物的產(chǎn)生許多高值FDCA衍生物的合成描述于圖16中，其中DTHU脫水產(chǎn)生糠醛-5-甲酸，即FCA，其隨后被化學(xué)或酶促氧化成FDCA，還原成FCH，或轉(zhuǎn)氨(使用化學(xué)還原胺化或氨基轉(zhuǎn)移酶)成氨基酸-AFC。實施例19-二丁基FDCA在氣相反應(yīng)中的產(chǎn)生在此實施例中，GC的入口被用作高溫反應(yīng)器以便將二丁基DDG脫水為二丁基FDCA。將生成的產(chǎn)物進行色譜分離，通過質(zhì)譜法來檢測。將二丁基DDG(10mM)和硫酸(100mM)在丁醇中的溶液置于GC小瓶中。將小瓶注入GC中并且觀察FDCA二丁酯。反應(yīng)在300℃入口中發(fā)生(停留時間＝4秒)。6次注入的平均產(chǎn)率為54％。GC設(shè)置：直接液體注入/MS檢測器入口：300℃，總流量29.51ml/min，分流比10∶1，分流量24.1ml/min，隔膜清洗液流量3mL/minGC襯管：4mm，玻璃棉(P/N5183-4647)柱流量：2.41ml/minHe恒壓控制烘箱程序：在40℃下保持2min，然后以25℃/min升溫至275℃，然后以40℃/min升至325℃，保持2min柱：HP-5MS，AgilentTechnologies，30mx0.25mmx0.25um總運行時間：14.65分鐘MSD傳輸管線：290℃MS源：250℃MSQuad：150℃保留時間：2，3-FDCA二丁酯：9.3min2，5-FDCA二丁酯：9.7min本說明書中提到的所有公布和專利申請均引入本文以供參考，其程度就如同每個單獨的公布或?qū)＠暾埍痪唧w和單獨地指明引入以供參考。并不承認任何參考文獻構(gòu)成現(xiàn)有技術(shù)。參考資料的論述說出了其作者的論斷，申請人保留質(zhì)疑引用文件的準確性和適當性的權(quán)利。顯然可以理解，盡管本文參考了許多現(xiàn)有技術(shù)公開文獻，但是這種參考并不構(gòu)成對這些文獻中的任意一篇形成本領(lǐng)域中公知常識的組成部分的許可。還應(yīng)理解，提供以上實施例來說明，而非限制本發(fā)明。當前第1頁1 2 3