本發(fā)明屬于化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種白楊素氨基酸衍生物的制備方法。

背景技術(shù)：

白楊素的抗腫瘤作用機(jī)制一直備受人們的關(guān)注。研究表明白楊素能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖，能夠抑制人未分化甲狀腺癌細(xì)胞HTH7和KAT18，且呈劑量和時(shí)間依賴性，能誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡，熒光定量RT-PCR反應(yīng)、比色測(cè)定以及Wexternblotting分析結(jié)果表明，白楊素是通過(guò)下調(diào)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)和激活caspase-3和-9來(lái)引發(fā)肺腺癌上皮細(xì)胞的凋亡，相關(guān)研究表明白楊素還能逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥作用。

但是白楊素水溶性和脂溶性都較差，腸道吸收甚少或者完全不吸收，且5，7位羥基在體內(nèi)易被糖基化代謝而降低活性，從而限制其臨床應(yīng)用。因此，希望通過(guò)對(duì)白楊素結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾以獲得高效、低毒且選擇性好的抗腫瘤先導(dǎo)化合物。將5位和7位的羥基與乙酸成酯得到的化合物對(duì)H22腫瘤的增殖具有抑制作用，進(jìn)一步流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)表明其可顯著地阻滯H22細(xì)胞的G2期。

然而目前報(bào)道的白楊素及其衍生物的抗癌作用機(jī)制還缺乏充分確切的證據(jù)，并且有關(guān)白楊素結(jié)構(gòu)修飾的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道主要集中在硝基化、三氟甲基化以及鹵素原子的引入等方面，對(duì)白楊素進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾可以改善水溶性、生物利用度以及選擇性。

腫瘤細(xì)胞對(duì)氨基酸的需求量比正常的細(xì)胞要高，并且氨基酸具有良好的水溶性和親和性，將其引入到藥物分子中能夠有利于藥物到達(dá)細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，進(jìn)而提高藥物分子對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性。

綜上所述，雖然目前結(jié)構(gòu)修飾的白楊素已經(jīng)報(bào)道，這些結(jié)構(gòu)修飾旨在與改善白楊素的生物利用度以及提升白楊素的藥理活性，但是收效甚微，并且大多數(shù)白楊素衍生物在藥理學(xué)活性提升的同時(shí)也會(huì)增強(qiáng)了對(duì)正常細(xì)胞的殺傷作用。而且白楊素衍生物的抗癌作用機(jī)制、藥效基團(tuán)及其體內(nèi)的代謝過(guò)程均沒(méi)有具體的研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種白楊素氨基酸衍生物及其制備方法，旨在解決目前白楊素衍利用度低，不能改善白楊素的溶解性和不能減少白楊素對(duì)正常細(xì)胞的殺傷作用的問(wèn)題。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種白楊素氨基酸衍生物通式結(jié)構(gòu)為：

其中，n為大于或等于1的整數(shù)，R₁為-H或不同的烷基，R₂為不同氨基酸的取代基。

本發(fā)明另一目的在于提供一種白楊素氨基酸衍生物的制備方法，該方法對(duì)白楊素7位合成了不同系列的白楊素衍生物，具體合成路線為白楊素先與溴代烷基羧酸酯反應(yīng)，經(jīng)水解后得到7-O-羧烷基化白楊素衍生物，再與不同類型的氨基酸烷基酯鹽反應(yīng)，通過(guò)酰胺縮合得到白楊素氨基酸烷基酯類化合物，再經(jīng)水解制得白楊素氨基酸衍生物。

進(jìn)一步，所述白楊素氨基酸衍生物的制備方法，以白楊素為原料，通過(guò)溴代反應(yīng)得到中間產(chǎn)物7-O-乙氧羰基烷基白楊素，再經(jīng)水解反應(yīng)得到中間產(chǎn)物7-O-羧烷基化的白楊素衍生物，再以1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺、1-羥基苯并三氮唑和4-二甲氨基吡啶為催化體系，加入敷酸劑N，N-二異丙基乙胺，在以DMF為溶劑的情況下，分別與氨基酸烷基酯鹽酸鹽發(fā)生酰胺縮合反應(yīng)，得到白楊素氨基酸烷基酯類化合物，通過(guò)控制pH 2～3，在室溫下水解得到相應(yīng)的白楊素氨基酸類化合物。

進(jìn)一步，7-O-羧烷基化白楊素是利用白楊素在以碳酸鉀和催化劑碘化鉀存在時(shí)與溴代烷基酸酯反應(yīng)，經(jīng)水解得到的。

進(jìn)一步，白楊素氨基酸烷基酯類化合物的合成在-10℃～10℃進(jìn)行反應(yīng)。

進(jìn)一步，白楊素氨基酸烷基酯類化合物的合成是在以EDCI、HOBt、DMAP為催化劑，以DIPEA為敷酸劑的體系中進(jìn)行的。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種利用白楊素氨基酸衍生物制備的抗腫瘤、抗癌的藥物。

本發(fā)明制備白楊素氨基酸衍生物的合成所需的原料和試劑都常見(jiàn)易得，價(jià)格低廉，合成步驟少，操作簡(jiǎn)單，產(chǎn)率較高，具有低投入高產(chǎn)出的特點(diǎn)。本發(fā)明制備的白楊素氨基酸衍生物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用效果顯著，其中大多數(shù)化合物的抗癌活性均強(qiáng)于白楊素，更有些化合物，如實(shí)施例六、十四、十八的化合物具有比市售的抗癌藥物順鉑(DDP)更強(qiáng)的增殖抑制作用。

本發(fā)明的目的在于提供一種白楊素氨基酸衍生物的制備方法。旨在解決提高白楊素衍生物療效，并降低其毒性。由于白楊素具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化等多種生物學(xué)活性，進(jìn)而備受人們的關(guān)注。但是白楊素的溶解性差，導(dǎo)致其生物利用度低。鑒于大多數(shù)已報(bào)道的白楊素衍生物抗癌效果一般，對(duì)正常細(xì)胞毒性較大的問(wèn)題，本發(fā)明通過(guò)將氨基酸與白楊素分子結(jié)合，一方面改善白楊素的溶解性，另一方面減少對(duì)正常細(xì)胞的殺傷作用。氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單元，作為人體內(nèi)重要的活性分子，參與多種生命活動(dòng)過(guò)程，對(duì)人體無(wú)毒無(wú)害。氨基酸具有良好的溶解性，并且腫瘤細(xì)胞對(duì)氨基酸的需求量比正常的細(xì)胞高。所以將氨基酸與白楊素有效的結(jié)合不僅能改善白楊素的溶解性，提高生物利用度和藥理活性，還能提高白楊素對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性，進(jìn)而發(fā)揮出對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向殺傷作用。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的白楊素氨基酸衍生物的制備方法流程圖。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步描述。

本發(fā)明實(shí)施例提供的白楊素氨基酸衍生物，結(jié)構(gòu)通式為：

其中n為大于或等于1的整數(shù)，R₁為-H或不同的烷基，R₂為不同氨基酸的取代基。其反應(yīng)過(guò)程為：

其中n為大于或等于1的整數(shù)，R₁為-H或不同的烷基，R₂為不同氨基酸的取代基。

本發(fā)明實(shí)施例以白楊素為原料，通過(guò)溴代反應(yīng)得到中間產(chǎn)物7-O-乙氧羰基烷基白楊素(2系列)，再經(jīng)水解反應(yīng)得到中間產(chǎn)物7-O-羧烷基化的白楊素衍生物(3系列)，再以1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺(EDCI)、1-羥基苯并三氮唑(HOBt)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)為催化體系，加入敷酸劑N，N-二異丙基乙胺(DIPEA)，在以DMF為溶劑的情況下，分別與氨基酸烷基酯鹽酸鹽發(fā)生酰胺縮合反應(yīng)，得到白楊素氨基酸烷基酯類化合物(4系列)，通過(guò)控制pH，在室溫下水解得到相應(yīng)的白楊素氨基酸類化合物(5系列)。

本發(fā)明實(shí)施例在制備白楊素氨基酸烷基酯類化合物時(shí)，引入氨基酸時(shí)用到的是氨基酸烷基酯鹽酸鹽。氨基酸烷基酯鹽的制備過(guò)程為：在250ml四頸瓶(帶干燥和堿液吸收裝置)中，加入150ml甲醇，冰鹽浴冷卻至-10攝氏度以下，磁力攪拌拌下滴加21.60ml，新蒸的二氯亞砜，控制滴加速度使反應(yīng)溫度不超過(guò)0攝氏度，反應(yīng)1小時(shí)后自然升至室溫，得150ml 2mol/L的氯化亞砜-甲醇溶液。將上述溶液轉(zhuǎn)移至棕色試劑瓶中，密封，避光保存。在100ml四頸燒瓶上安裝回流冷凝管(管口接氯化鈣干燥塔和堿液吸收裝置)。滴液漏斗和溫度計(jì)。將25ml甲醇加入反應(yīng)瓶中，用冰鹽浴冷卻至-10攝氏度以下，攪拌下緩慢滴加1.8ml新蒸的二氯亞砜，滴加過(guò)程中控制滴加速度，以保持反應(yīng)液的溫度在0℃以下。滴加完畢后繼續(xù)攪拌1小時(shí)。將上述溶液轉(zhuǎn)移至盛有25mmol氨基酸的100ml單口燒瓶中。加熱回流一小時(shí)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)出去過(guò)量的甲醇和二氯亞砜，得到白色固體物。將上述固體溶解在25ml 2mol/ml二氯亞砜-甲醇溶液中，加熱回流1小時(shí)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溶劑，得到白色固體即氨基酸烷基酯鹽酸鹽。

本發(fā)明實(shí)施例制備白楊素氨基酸烷基酯類化合物時(shí)，使用的催化劑為1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺(EDCI)、1-羥基苯并三氮唑(HOBt)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)，敷酸劑為N，N-二異丙基乙胺(DIPEA)，反應(yīng)溶劑為丙酮、異丙酮、甲醇等。

如圖1所示，本發(fā)明實(shí)施例的提供的白楊素氨基酸衍生物的制備方法，具體實(shí)施步驟包括：

S101、將白楊素10mmol、無(wú)水碳酸鉀11.5mmol置于250mL三頸瓶中，加入溶劑丙酮100mL，加熱攪拌回流1h,此時(shí)用恒壓滴液漏斗向反應(yīng)液中緩慢滴加溴代烷基羧酸酯以及催化量的KI 1mmol，60℃左右繼續(xù)冷凝回流，TLC檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。反應(yīng)結(jié)束后，冷卻，過(guò)濾，濾渣加入適量丙酮攪拌溶解再過(guò)濾，合并兩次濾液，減壓蒸除丙酮，得黃色粗品，用丙酮重結(jié)晶或者硅膠色譜柱分離提純(洗脫劑：V_石油醚：V_乙酸乙酯＝4:1)得中間產(chǎn)物(2系列)；在50mL三頸燒瓶中加入中間產(chǎn)物(2系列)5mmol，1mol/L氫氧化鉀12.5mmol以及異丙酮12.5mL,機(jī)械攪拌，加熱回流1-5小時(shí)，溫度控制在60℃左右，TLC檢測(cè)原料點(diǎn)消失，冷卻，過(guò)濾，濾液用0.5mol/L硫酸調(diào)節(jié)pH至2～3,放置冰箱中過(guò)夜，抽濾得黃色固體，分別用3.8％稀鹽酸、飽和NaCl、蒸餾水各洗3次，50℃真空干燥12h得黃色固體(3系列)；

S102、在冰浴條件下將0.5mmol黃色固體(3系列)、2mmol EDCI以及2mmol HOBt加入50mL三口燒瓶中，加入10mL DMF溶解，冰浴下攪拌2～4h，加入2mmol化合物氨基酸烷基酯鹽酸鹽的DMF溶液2mL，敷酸劑2mmolDIPEA以及0.6mmol DMAP的DMF溶液1mL，冰浴下反應(yīng)30min，然后室溫下反應(yīng)24h，將反應(yīng)液加入50mL冰水中，放入冰箱中靜置2h，抽濾，棄濾液，濾渣分別用飽和食鹽水及蒸餾水各洗滌3次，真空干燥得到淡黃色粗品，用硅膠色譜柱分離提純(洗脫劑:V_二氯甲烷：V_丙酮＝12∶1)得淡黃色固體(4系列)；

S103、將0.25mmol淡黃色固體(4系列)加入25mL三口燒瓶中，加入10mL蒸餾水，用0.1mol/LKOH調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH至10～11左右，室溫下攪拌，用TLC檢測(cè)原料點(diǎn)消失，過(guò)濾反應(yīng)液，濾液用0.5mol/L硫酸調(diào)節(jié)pH為2～3左右，放入冰箱中靜置，抽濾，于50℃真空干燥12h后得淡黃色固體(5系列)。

S102中冰浴條件為-10℃～10℃。

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。

實(shí)施例一：2-(5-羥基-2-苯基-4H-苯并吡喃酮-7-氧)丙酸乙酯的制備

將白楊素10mmol、無(wú)水碳酸鉀11.5mmol置于250mL三頸瓶中，加入溶劑丙酮100mL，加熱攪拌回流1h,此時(shí)用恒壓滴液漏斗向反應(yīng)液中緩慢滴加2-溴丙酸乙酯以及催化量的KI 1mmol，60℃左右繼續(xù)冷凝回流，TLC檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。反應(yīng)結(jié)束后，冷卻，過(guò)濾，濾渣加入適量丙酮攪拌溶解再過(guò)濾，合并兩次濾液，減壓蒸除丙酮，得黃色粗品，用丙酮重結(jié)晶或者硅膠色譜柱分離提純(洗脫劑：V_石油醚：V_乙酸乙酯＝4:1)得化合物2，產(chǎn)率為70.5％。m.p.138.5～140.2℃.IR v_max(cm^-1,KBr):1738,1657,1616,1380,755.¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆,δ,ppmJ/Hz):1.21(t,J＝7.2,3H),1.56(d,J＝6.9,3H),4.18(q,J＝6.9,2H),5.21(q,J＝6.9,1H),6.38(d,J＝2.4,1H),6.78(d,J＝2.1,1H),7.05(s,1H),7.56～7.66(m,3H),8.08～8.11(m,2H),12.81(s,1H)；¹³C-NMR(100MHz,DMSO-d₆),δ:13.95(C-6”),17.91(CH3-2”(C)),61.05(C-5”),72.07(C-2”),93.79(C-8),98.67(C-6),105.25(C-3),105.40(C-10),126.46(C-2’),C-6’),129.13(C-3’,C-5’),130.54(C-4’),132.16(C-1’),157.18(C-9),161.22(C-2),163.22(C-5),163.58(C-7),170.60(C-3”),182.04(C-4)；ESI-MS,m/z:355.1356[M+H]⁺。

實(shí)施例二：4-(5-羥基-2-苯基-4H-苯并吡喃酮-7-氧)丁酸乙酯的制備

制備方法同實(shí)施例一，以4-溴丁酸乙酯代替2-溴丙酸乙酯，得到化合物3，產(chǎn)率為78.5％。m.p.159～161℃.IRv_max(cm^-1,KBr):1732,1666,1612,1381,767.¹H-NMR(400MHz,CDCl₃,δppm,J/Hz):1.28(t,J＝7.2,3H),2.14～2.17(m,2H),2.53(t,J＝7.2,2H),4.09(t,J＝6,2H),4.17(q,J＝7.2,2H),6.36(d,J＝2.0,1H),6.49(d,J＝2.4,1H),6.67(s,1H),7.51～7.56(m,3H),7.88(dd,J＝1.2,7.6,2H),12.70(s,1H)；¹³C-NMR(100MHz,DMSO-d6),δ:14.08(C-8”),23.92(C-3”),29.97(C-4”),59.88(C-7”),67.44(C-2”),92.80(C-8),98.56(C-6),105.12(C-3),105.42(C-10),126.38(C-2’,C-6’),129.11(C-3’,C-5’),130.63(C-4’),132.06(C-1’),157.46(C-9),161.58(C-2),163.18(C-5),164.42(C-7),172.39(C-5”),181.87(C-4)；ES I-MS,m/z:369.1544[M+H]⁺。

實(shí)施例三：6-(5-羥基-2-苯基-4H-苯并吡喃酮-7-氧)己酸乙酯的制備

制備方法同實(shí)施例一，以6-溴己酸乙酯代替2-溴丙酸乙酯，得到化合物4，產(chǎn)率為69.5％。m.p.103.2～104.5℃.IR v_max(cm^-1,KBr):3068,2980,2939,2873,2818,1720,1656,1612,1396,773.¹HNMR(300MHz,DMSO-d₆,δ,ppm,J/Hz):1.18(t,J＝7.2,3H),1.40～1.47(m,2H),1.55～1.65(m,2H),1.70～1.79(m,2H),2.32(t,J＝7.2,2H),4.02～4.11(m,4H),6.37(d,J＝2.1,1H),6.80(d,J＝2.1,1H),7.03(s,1H),7.56～7.66(m,3H),8.08～8.12(m,2H),12.79(s,1H)；¹³C-NMR(100MHz,DMSO-d6),δ:14.10(C-10”),24.11(C-5”),25.09(C-4”),28.12(C-3”),33.39(C-6”),59.65(C-9”),68.32(C-2”),93.16(C-8),98.46(C-6),104.84(C-3),105.30(C-10),126.42(C-2’,C-6’),129.11(C-3’,C-5’),130.59(C-4’),132.12(C-1’),157.35(C-9),161.13(C-2),163.40(C-5),164.72(C-7),172.78(C-7”),182.03(C-4)；ESI-MS,m/z:397.1885[M+H]⁺。

實(shí)施例四：2-(5-羥基-2-苯基-4H-苯并吡喃酮-7-氧)丙酸的制備

在50mL三頸燒瓶中加入5mmol實(shí)施例一中合成的化合物2，1mol/L氫氧化鉀12.5mmol以及異丙酮12.5mL,機(jī)械攪拌，加熱回流1-5小時(shí)，溫度控制在60℃左右，TLC檢測(cè)原料點(diǎn)消失，冷卻，過(guò)濾，濾液用0.5mol/L硫酸調(diào)節(jié)pH至2～3,放置冰箱中過(guò)夜，抽濾得黃色固體，分別用3.8％稀鹽酸、飽和NaCl、蒸餾水各洗3次，50℃真空干燥12h得化合物5，產(chǎn)率為89.2％,m.p.240～243℃.IR v_max(cm^-1,KBr):3419,3086,2939,2821,1720,1658,1608,1379；¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆,δ,ppm,J/Hz):1.56(t,J＝7.2,3H),5.09(q,J＝6.9,1H),6.36(d,J＝2.4,1H),6.75(d,J＝2.1,1H),7.05(s,1H),7.56～7.66(m,3H),8.08～8.11(m,2H),12.80(s,1H),13.23(br.s,1H)；¹³C-NMR(100MHz,DMSO-d6),δ:17.99(CH3-2”(2)),72.09(C-2”),93.64(C-8),98.69(C-6),105.10(C-3),105.36(C-10),126.46(C-2’,C-6’),129.13(C-3’,C-5’),130.54(C-4’),132.14(C-1’),157.19(C-9),161.14(C-2),163.20(C-5),163.53(C-7),172.22(C-3”),182.04(C-4)；ESI-M S,m/z:325.0782[M+H]^-。

實(shí)施例五：4-(5-羥基-2-苯基-4H-苯并吡喃酮-7-氧)丁酸的制備

以實(shí)施例二中制備得到的化合物3為原料，制備方法同實(shí)施例四，得到化合物6，產(chǎn)率為76.5％。m.p.218～220℃.IR v_max(cm^-1,KBr):3080,2925,2857,1724,1651,1616；¹HNMR(300MHz,CDCl₃,δ,ppm,J/Hz):2.11～2.22(m,2H),2.62(t,J＝7.5,2H),4,12(t,J＝6.2,2H),6.37(d,J＝2.1,1H),6.51(d,J＝2.1,1H),6.68(s,1H),7.50～7.61(m,3H),7.88～7.91(dd,J＝1.8,7.5,2H)；¹³C-NMR(100MHz,DMSO-d6),δ:23.92(C-3”),29.93(C-4”),,67.61(C-2”),93.16(C-8),98.50(C-6),104.91(C-3),105.31(C-10),126.42(C-2’,C-6’),129.11(C-3’,C-5’),130.57(C-4’),132.12(C-1’),157.19(C-9),157.35(C-9),161.14(C-2),163.41(C-5),164.56(C-7),173.96(C-5”),182.04(C-4)；ESI-MS,m/z:341.1239[M+H]^-。

實(shí)施例六：6-(5-羥基-2-苯基-4H-苯并吡喃酮-7-氧)己酸的制備

以實(shí)施例三中制備得到的化合物4為原料，制備方法同實(shí)施例四，得到化合物7，產(chǎn)率為90.2％。m.p.168.8～170.9℃.IR v_max(cm^-1,KBr):3084,2951,2879,1716,1656,1620；¹HNMR(300MHz,DMSO-d₆,δ,ppm,J/Hz):1.38～1.48(m,2H),1.53～1.63(m,2H),1.70～1.79(m,2H),2.25(t,J＝7.5,2H),4.09(t,J＝6.6,2H),6.37(d,J＝2.1,1H),6.80(d,J＝2.1,1H),7.03(s,1H),7.56～7.66(m,3H),8.10(dd,J＝1.2,7.5,2H),12.00(br.s,1H),12.79(s,1H)；¹³C-NMR(100MHz,DMSO-d6),δ:24.16(C-5”),25.11(C-4”),28.10(C-3”),33.58(C-6”),68.36(C-2”),93.13(C-8),98.45(C-6),104.83(C-3),105.28(C-10),126.41(C-2’,C-6’),129.09(C-3’,C-5’),130.59(C-4’),132.10(C-1’),161.13(C-2),163.37(C-5),164.72(C-7),174.38(C-7”),182.01(C-4)；ESI-MS,m/z:369.1534[M+H]⁺。

實(shí)施例七：N-[2-(5-羥基-2-苯基-4H-苯并吡喃酮-7-氧基)乙?；鵠甘氨酸甲酯的制備

將白楊素按照實(shí)施例一中的方法制備化合物8，再按照實(shí)施例四中的方法制備化合物9，在冰浴條件下將0.5mmol化合物9、2mmol EDCI以及2mmol HOBt加入50mL三口燒瓶中，加入10mL DMF溶解，冰浴下攪拌2～4h，加入2mmol化合物甘氨酸甲酯鹽酸鹽的DMF溶液2mL，敷酸劑2mmolDIPEA以及0.6mmol DMAP的DMF溶液1mL，冰浴下反應(yīng)30min，然后室溫下反應(yīng)24h，將反應(yīng)液加入50mL冰水中，放入冰箱中靜置2h，抽濾，棄濾液，濾渣分別用飽和食鹽水及蒸餾水各洗滌3次，真空干燥得到淡黃色粗品，用硅膠色譜柱分離提純(洗脫劑:V_二氯甲烷：V_丙酮＝12∶1)得化合物10，產(chǎn)率為67％,m.p.201.1～202.2℃.IRv_max(cm^-1,KBr):3414,2920,1743,1681,1658,1651,1527,1381,1284,1209,1168；¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆,δ,ppm,J/Hz):3.65(s,3H),3.94(d,J＝5.7,2H),4.73(s,2H),6.46(d,J＝2.1,1H),6.85(d,J＝2.1,1H),7.07(s,1H),7.57～7.67(m,3H),8.11(dd,J＝1.5,7.8,2H),8.65(t,J＝5.7,1H),12.82(s,1H)；¹³C-NMR(100MHz,DMSO-d6),δ:40.53(C-5”),51.74(C-8”),67.02(C-2”),93.66(C-8),98.86(C-6),105.33(C-3),105.42(C-10),126.44(C-2’,C-6’),129.14(C-3’,C-5’),130.54(C-4’),132.20(C-1’),157.18(C-9),161.07(C-2),163.12(C-5),163.53(C-7),167.51(C-3”),170.03(C-6”),182.10(C-4)；ESI-MS,m/z:384.1292[M+H]⁺。

實(shí)施例八：N-[2-(5-羥基-2-苯基-4H-苯并吡喃酮-7-氧基)乙酰基]-L-丙氨酸甲酯的制備

以實(shí)施例七中制備得到的化合物9和L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽為原料，制備方法同實(shí)施例七，得到淡黃色固體，即化合物11，產(chǎn)率65％,m.p.181.1～182.4℃.

¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆,δ,ppm,J/Hz):1.35(d,J＝7.2,3H),3.64(s,3H),4.35～4.45(m,1H),4.71(dd,J＝15,18,2H),6.45(d,J＝2.1,1H),6.83(d,J＝2.4,1H),7.07(s,1H),7.57～7.67(m,3H),8.11(dd,J＝1.5,2.8,2H),8.63(d,J＝7.5,1H),12.82(s,1H)。

實(shí)施例九：N-[2-(5-羥基-2-苯基-4H-苯并吡喃酮-7-氧基)乙?；鵠-L-異亮氨酸甲酯的制備

以實(shí)施例七中制備得到的化合物9和L-異亮氨酸甲酯鹽酸鹽為原料，制備方法同實(shí)施例七，得到淡黃色固體，即化合物12，產(chǎn)率59％,m.p.132.3～133.9℃.¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆,δ,ppm,J/Hz):0.83(d,J＝7.2,3H),0.87(t,J＝6.9,3H),1.14～1.27(m,1H),1.36～1.49(m,1H),1.82～1.91(m,1H),3.65(s,3H),4.30(dd,J＝6.6,8.4,1H),4.77(dd,J＝14.7,18,2H),6.42(d,J＝2.4,1H),6.78(d,J＝2.4,1H),7.07(s,1H),7.56～7.67(m,3H),8.10～8.12(m,2H),8.51(d,J＝8.1,1H),12.80(s,1H)。

實(shí)施例十：N-[2-(5-羥基-2-苯基-4H-苯并吡喃酮-7-氧基)乙酰基]-L-苯丙氨酸甲酯的制備

以實(shí)施例七中制備得到的化合物9和L-苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽為原料，得到淡黃色固體，制備方法同實(shí)施例七，即化合物13，產(chǎn)率為51％,m.p.175.2～177.8℃.¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆,δ,ppm,J/Hz):3.00(dd,J＝9.6,13.8,1H),3.11(dd,J＝5.4,14.1,1H),3.64(s,3H),4.55～4.59(m,1H),4.66(dd,J＝15,21,2H),6.40(d,J＝2.1,1H),6.72(d,J＝2.1,1H),7.07(s,1H),7.11～7.15(m,1H),7.15～7.25(m,4H),7.57～7.65(m,3H),8.11(dd,J＝1.2,7.8,2H),8.60(d,J＝8.1,1H),12.81(s,1H)。

實(shí)施例十一：N-[4-(5-羥基-2-苯基-4H-苯并吡喃酮-7-氧基)丁?；鵠甘氨酸甲酯的制備

以實(shí)施例五中制備得到的化合物6和甘氨酸甲酯鹽酸鹽為原料，制備方法同實(shí)施例七，得到淡黃色固體，即化合物14，產(chǎn)率57％,m.p.175.3～178.5℃,IRv_max(cm^-1,KBr):3290,2941,1757,1662,1645,1614,1548,1357,1303,1207,1172.¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆,δ,ppm,J/Hz):1.94～2.03(m,2H),2.33(t,J＝7.2,2H),3.63(s,3H),3.84(d,J＝6.0,2H),4.13(t,J＝6.6,2H),6.40(d,J＝2.1,1H),6.83(d,J＝2.7,1H),7.05(s,1H),7.56～7.64(m,3H),8.11(dd,J＝1.2,7.8,2H),8.36(t,J＝5.7,1H),12.80(s,1H)；¹³C-NMR(100MH z,DMSO-d6),δ:24.45(C-3”),31.07(C-4”),40.53(C-7”),51.61(C-10”),67.76(C-2”),93.18(C-8),98.54(C-6),104.91(C-3),105.35(C-10),126.42(C-2’,C-6’),129.13(C-3’,C-5’),130.59(C-4’),132.12(C-1’),157.39(C-9),161.14(C-2),163.40(C-5),164.61(C-7),170.45(C-5”),172.05(C-8”),182.04(C-4)；ESI-MS,m/z:434.1459[M+Na]⁺。

實(shí)施例十二：N-[4-(5-羥基-2-苯基-4H-苯并吡喃酮-7-氧基)丁?；鵠L-丙氨酸甲酯的制備

以實(shí)施例五中制備得到的化合物6和丙氨酸甲酯鹽酸鹽為原料，制備方法同實(shí)施例七，得到淡黃色固體，即化合物15，產(chǎn)率為58％,m.p.196.2～198.7℃.

¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆,δ,ppm,J/Hz):1.27(d,J＝7.5,3H),1.92～2.01(m,2H),2.30(t,J＝7.5,2H),3.62(s,3H),4.12(t,J＝6.6,2H),4.22～4.32(m,1H),6.39(d,J＝2.1,1H),6.82(d,J＝2.1,1H),7.05(s,1H),7.56～7.66(m,3H),8.11(dd,J＝1.5,8.1,2H),8.33(d,J＝6.9,1H),12.80(s,1H)。

實(shí)施例十三：N-[4-(5-羥基-2-苯基-4H-苯并吡喃酮-7-氧基)丁?；鵠L-亮氨酸甲酯的制備

以實(shí)施例五中制備得到的化合物6和L-亮酸甲酯鹽酸鹽為原料，制備方法同實(shí)施例七，得到淡黃色固體，即化合物16，產(chǎn)率為55％,m.p.145.2～147.1℃.

¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆,δ,ppm,J/Hz):0.82(d,J＝6.3,3H),0.86(d,J＝6.3,3H),1.41～1.49(m,2H),1.51～1.50(m,1H),1.93～2.02(m,2H),2.32(t,J＝6.0,2H),3.61(s,3H),4.11(dd,J＝4.5,6.6,2H),4.25～4.33(m,1H),6.39(d,J＝2.1,1H),6.82(d,J＝2.4,1H),7.05(s,1H),7.56～7.66(m,3H),8.11(dd,J＝1.8,8.1,2H),8.28(d,J＝7.5,1H),12.80(s,1H)

實(shí)施例十四：N-[4-(5-羥基-2-苯基-4H-苯并吡喃酮-7-氧基)丁?；鵠L-異亮氨酸甲酯的制備

以實(shí)施例五中制備得到的化合物6和L-異亮酸甲酯鹽酸鹽為原料，制備方法同實(shí)施例七，得到淡黃色固體，即化合物17，產(chǎn)率55％,m.p.149.5～151.7℃.

¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆,δ,ppm,J/Hz):0.82(d,J＝7.2,3H),0.83(t,J＝6.6,3H),1.10～1.22(m,1H),1.35～1.43(m,1H),1.73～1.78(m,1H),1.95～2.01(m,2H),2.36(t,J＝7.5,2H),3.62(s,3H),4.11(t,J＝5.7,2H),4.21～4.25(m,1H),6.39(d,J＝2.1,1H),6.81(d,J＝2.1,1H),7.04(s,1H),7.56～7.66(m,3H),8.10(dd,J＝1.8,7,8,2H),8.21(d,J＝7.5,1H),12.80(s,1H)。

實(shí)施例十五：N-[4-(5-羥基-2-苯基-4H-苯并吡喃酮-7-氧基)丁?；鵠L-苯丙氨酸甲酯的制備

以實(shí)施例五中制備得到的化合物6和L-苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽為原料，制備方法同實(shí)施例七，得到淡黃色固體，即化合物18，產(chǎn)率為50％,m.p.174.4～175.5℃.¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆,δ,ppm,J/Hz):1.85～1.94(m,2H),2.23～2.28(m,2H),2.90(dd,J＝9.6,13.8,1H),3.04(dd,5.4,13.5,1H),3.60(s,3H),4.01(t,J＝6.6,2H),4.46～4.54(m,1H),6.36(d,J＝2.4,1H),6.77(d,J＝2.4,1H),7.05(s,1H),7.15～7.29(m,5H),7.56～7.64(m,3H),8.11(dd,J＝1.5,8.1,2H),8.40(d,J＝7.8,1H),12.80(s,1H)。

實(shí)施例十六：N-[4-(5-羥基-2-苯基-4H-苯并吡喃酮-7-氧基)乙?；鵠-L-亮氨酸的制備

以實(shí)施例七中制備得到的化合物9和L-亮氨酸甲酯鹽酸鹽為原料，得到淡黃色固體，制備方法同實(shí)施例七，得到化合物19，將0.25mmol化合物19加入25mL三口燒瓶中，加入10mL蒸餾水，用0.1mol/LKOH調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH至10～11左右，室溫下攪拌，用TLC檢測(cè)原料點(diǎn)消失，過(guò)濾反應(yīng)液，濾液用0.5mol/L硫酸調(diào)節(jié)pH為2～3左右，放入冰箱中靜置，抽濾，于50℃真空干燥12h后得化合物20，產(chǎn)率為58％,m.p.113.4～116.7℃.¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆,δ,ppm,J/Hz):0.83(d,J＝6.0,3H),0.88(d,J＝5.7,3H),1.49～1.54(m,2H),1.55～1.68(m,1H),4.27～4.35(m,1H),4.72(dd,J＝15,18.3,2H),6.45(d,J＝2.4,1H),6.80(d,J＝2.4,1H),7.07(s,1H),7.56～7.67(m,3H),8.10(dd,J＝1.2,7.5,2H),8.44(d,J＝8.1,1H),12.80(s,1H)。

實(shí)施例十七：N-[4-(5-羥基-2-苯基-4H-苯并吡喃酮-7-氧基)乙酰基]-L-異亮氨酸的制備

制備方法同實(shí)施例16，以化合物12代替化合物19，合成得到化合物21，產(chǎn)率59％,m.p.102.4～106.7℃.¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆,δ,ppm,J/Hz):0.86(t,J＝7.5,6.6,6H),1.14～1.29(m,1H),1.38～1.51(m,1H),1.82～1.91(m,1H),4.26(dd,J＝6.0,8.0,1H),4.65(dd,J＝14.4,17.7,2H),6.43(d,J＝2.1,1H),6.79(d,J＝2.1,1H),7.06(s,1H),7.56～7.67(m,3H),8.09(dd,J＝1.2,7.5,2H),8.32(d,J＝8.4,1H),12.80(s,1H)。

實(shí)施例十八：N-[4-(5-羥基-2-苯基-4H-苯并吡喃酮-7-氧基)丁?；鵠甘氨酸的制備

制備方法同實(shí)施例16，以化合物14代替化合物19，合成得到化合物22，產(chǎn)率為47％,m.p.218.2～219.9℃.IRv_max(cm^-1,KBr):3342,,2935,2842,1724,1162,1646,1617,1538,1276；¹HNMR(300MHz,DMSO-d₆,δ,ppm,J/Hz):1.96～2.03(m,2H),2.32(t,J＝7.2,2H),3.75(d,J＝5.7,2H),4.13(t,J＝6.3,2H),6.40(d,J＝2.1,1H),6.83(d,J＝2.4,1H),7.05(s,1H),7.56～7.66(m,3H),8.11(dd,J＝1.2,7.8,2H),8.23(t,J＝5.7,1H),12.80(s,1H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d6),δ:24.48(C-3”),31.09(C-4”),40.63(C-7”),67.81(C-2”),93.18(C-8),98.52(C-6),104.89(C-3),105.31(C-10),126.44(C-2’,C-6’),129.12(C-3’,C-5’),130.59(C-4’),132.12(C-1’),157.36(C-9),161.15(C-2),163.42(C-5),164.64(C-7),171.42(C-5”),171.88(C-8”),182.04(C-4)；ESI-MS,m/z:396.1179[M-H]^-。

實(shí)施例十九：N-[4-(5-羥基-2-苯基-4H-苯并吡喃酮-7-氧基)丁?；鵠-L-丙氨酸的制備

制備方法同實(shí)施例16，以化合物15代替化合物19，合成得到化合物23，產(chǎn)率為58％,m.p.202.7～204.2℃.¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆,δ,ppm,J/Hz):1.26(d,J＝7.5,3H),1.93～2.02(m,2H),2.30(t,J＝7.5,2H),4.12(t,J＝6.6,2H),4.16～4.26(m,1H),6.39(d,J＝2.1,1H),6.82(d,J＝2.1,1H),7.05(s,1H),7.56～7.67(m,3H),8.11(dd,J＝1.2,2H),8.20(d,J＝7.2,1H),12.44(br.s,1H),12.80(s,1H)。

實(shí)施例二十：N-[4-(5-羥基-2-苯基-4H-苯并吡喃酮-7-氧基)丁?；鵠-L-亮氨酸的制備

制備方法同實(shí)施例16，以化合物16代替化合物19，合成得到化合物24，產(chǎn)率50％,m.p.88.3～90.8℃.¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆,δ,ppm,J/Hz):0.82(d,J＝6.3,3H),0.86(d,J＝6.6,3H),1.46～1.53(m,2H),1.56～1.60(m,1H),1.95～2.00(m,2H),2.32(t,J＝6.3,2H),4.11(t,J＝6.6,2H),4.19～4.27(m,1H),6.39(d,J＝1.8,1H),6.81(d,J＝1.8,1H),7.05(s,1H),7.57～7.64(m,3H),8.11(dd,J＝1.8,8.1,2H),8.28(d,J＝7.5,1H),12.44(br.s,1H),12.80(s,1H)。

實(shí)施例二十一：N-[4-(5-羥基-2-苯基-4H-苯并吡喃酮-7-氧基)丁酰基]-L-異亮氨酸的制備

制備方法同實(shí)施例16，以化合物17代替化合物19，合成得到化合物25，產(chǎn)率為52％,m.p.81.2～85.4℃.¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆,δ,ppm,J/Hz):0.81(d,J＝7.2,3H),0.85(t,J＝6.63H),1.11～1.23(m,1H),1.33～1.44(m,1H),1.72～1.78(m,1H),1.95～1.99(m,2H),2.36(t,J＝6.6,2H),4.12(t,J＝6.3,2H),4.17～4.22(m,1H),6.39(d,J＝1.8,1H),6.81(d,J＝1.5,1H),7.05(s,1H),7.53～7.66(m,3H),8.06(d,J＝8.7,2H),8.11(d,J＝6.6,1H),12.51(br.s,1H),12.80(s,1H)。

實(shí)施例二十二：N-[4-(5-羥基-2-苯基-4H-苯并吡喃酮-7-氧基)丁?；鵠-L-苯丙氨酸的制備

制備方法同實(shí)施例16，以化合物18代替化合物19，合成得到化合物26，產(chǎn)率為49％,m.p.205.4～206.8℃.¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆,δ,ppm,J/Hz):1.84～1.93(m,2H),2.23～2.28(m,2H),2.85(dd,J＝9.6,13.5,1H),3.07(dd,J＝4.8,13.8,1H),4.00(t,J＝6.6,2H),4.42～4.50(m,1H),6.36(d,J＝2.4,1H),6.76(d,J＝2.1,1H),7.04(s,1H),7.14～7.28(m,5H),7.56～7.66(m,3H),8.11(dd,J＝1.2,7.8,2H),8.25(d,J＝8.4,1H),12.66(br.s,1H),12.80(s,1H)。

本發(fā)明通過(guò)以下方法來(lái)證明所制得的白楊素氨基酸衍生物對(duì)腫瘤細(xì)胞的體外增殖抑制作用：

將人肝癌細(xì)胞HepG2和人胃癌細(xì)胞MGC-803培養(yǎng)于含10％(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清、1×105U/L青霉素和1×105U/L鏈霉素的PRM1-1640培養(yǎng)基中，在37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加入100μL單細(xì)胞懸液(5×10³～6×10³個(gè)細(xì)胞)；24h后，吸棄上清液，每孔加入200μL含藥培養(yǎng)基，使HepG2細(xì)胞株化合物終濃度為120，60，30，15和7.5μmol/L，MGC-803細(xì)胞株化合物終濃度為20，10，5，2.5和1.25μmol/L，同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組(陽(yáng)性對(duì)照藥為順鉑DDP，HepG2細(xì)胞株DDP濃度為100，50，25，12.5和6.25μmol/L；MGC-803細(xì)胞株DDP濃度為20，10，5，2.5，1.25μmol/L)，溶媒對(duì)照組(加含0.2％DMSO+0.1％Tween-80的培養(yǎng)液)及調(diào)零組(僅加等量的培養(yǎng)液)，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48h后，每孔加入20μL MTT溶液(5g/L)，混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150μL DMSO，震蕩10min，使藍(lán)紫色結(jié)晶充分溶解，用酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值。以藥物濃度為橫坐標(biāo)，細(xì)胞存活率為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞增殖抑制曲線，用SPSS18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，測(cè)定藥物半數(shù)抑制濃度(IC50)。測(cè)試結(jié)果如下表：

化合物1～26對(duì)腫瘤細(xì)胞HepG2、MGC-803的體外增值抑制作用

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。