由于疾病的指數(shù)增長，抗癌藥物的研究和開發(fā)是全世界的優(yōu)先事項，然而，正在進(jìn)行對藥物的開發(fā)的研究，該藥物不僅使用了清潔技術(shù)，而且還使用了低成本的原料，這有助于減少由于常規(guī)化療的開支。例如，我們可以提及源自柑橘產(chǎn)業(yè)的化合物，其中巴西占據(jù)世界領(lǐng)先地位。這些化合物之一是檸檬烯，其從工業(yè)廢物(即柑橘皮)中獲得。紫蘇酸(AP)(式I)以其抗癌活性而聞名并且可以通過生物合成(生物轉(zhuǎn)化)從微生物(特別是屬于Arxula屬、假絲酵母屬(Candida)和耶氏酵母屬(Yarrowia)的酵母)對檸檬烯的作用而產(chǎn)生。本發(fā)明包括源自紫蘇酸的鹽形式的化合物，該化合物具有式II，其可以從紫蘇酸獲得，紫蘇酸又通過檸檬烯的生物轉(zhuǎn)化而獲得，該化合物具有抗癌活性并可溶于水。源自紫蘇酸的鹽的化合物，其中反離子(抗衡離子/平衡離子，counterion)M+包含堿金屬或堿土金屬，諸如例如，Na+(鈉)、K+(鉀)、Ca+2(鈣)，由式II表示，其中反離子M+可以是Na、K、Ca/2等。本發(fā)明特別包括獲得源自紫蘇酸的鹽形式的化合物，諸如紫蘇酸鈉(sodiumperylate)，本文被描述為NAP(式III)，該化合物具有抗癌活性并可溶于水。本發(fā)明特別涉及化合物、藥物組合物、用于獲得化合物的方法、化合物用于治療癌癥的用途以及用于治療癌癥的方法。
背景技術(shù)：
：檸檬烯由低成本的單萜組成，廣泛分布在自然界中，是柑橘產(chǎn)業(yè)的豐富的副產(chǎn)物，并且能夠提供具有巨大藥物重要性的高附加值的氧化的衍生物。在這些衍生物中，紫蘇酸占據(jù)顯著的位置，這是因為它具有抗癌和抗微生物活性，根據(jù)下述結(jié)構(gòu)式還有紫蘇醇和紫蘇醛。與化學(xué)合成相比，生物轉(zhuǎn)化方法提供了技術(shù)、經(jīng)濟和環(huán)境優(yōu)勢，其中我們強調(diào)具有化學(xué)選擇性、區(qū)域選擇性和對映選擇性的產(chǎn)物的形成，具有較少的副產(chǎn)物形成、溫和反應(yīng)條件的使用和低能耗。由于生產(chǎn)光學(xué)純(enantiomericallypure)產(chǎn)物的能力，生物轉(zhuǎn)化的工業(yè)應(yīng)用變得越來越重要，特別是生產(chǎn)藥物和藥物中間體。由于來自工業(yè)柑橘殘渣的R-(+)-檸檬烯右旋異構(gòu)體的豐富可用性，該化合物的微生物的生物轉(zhuǎn)化已被集中利用以建立低成本方法來產(chǎn)生芳香族化合物(例如，α-萜品二醇(α-terpinol))和藥理學(xué)活性衍生物(諸如紫蘇醇和紫蘇酸)，其描述于：·CadwalladerK.R.；BraddockRJ.；ParishM.E.；HigginsD.P.Bioconversionofd-limonenebyPseudomonasgladioli.J.FoodSei.54,1241-1245(1989)；·Mirata；MA.；BeerdD.；SchraderJ.IntegratedbioprocessfortbeoxidationoflimonenetoperillicactdwithPseudomonasputidaDSM12264,ProcessBiochem.44,764-771(2009)；·SpeetmansG.；BijlsmaA.；EgginkG.Limonenebioconversiontohighconcentrationsofasingleandstableproduct,perillicacid,byasolvent-resistantPseudomonasputdastrain.Appl.Microbiol.Biotechnol.50,538-544(1998)。從檸檬烯獲得的衍生物已作為抗微生物劑和抗癌劑由下列作者研究：·DaFonseca,C.O.；M.；Lins,I.R.；Caetano,R.O.；Futuro,D.；Quirico-Santos,T.EfftcacyofmonoterpeneperillylalcoholuponsurvivalrateofpatientswrthrecurrentglioblastomaJ.CancerRes.Clin.Oncot.137.287-293(2011)；·Yeruva,L；Pierre,KJ.；Elegbede,A.；Wang,R.C.；Carper,S.W,Perillylalcoholandperillicacidinducedcellcycleandapoptosisinnon-smallcelllungcancer.Cancerletters257,216-226(2007)。專利申請?zhí)朩O95/24895描述了使用紫蘇醇和紫蘇酸甲酯來降低血清膽固醇水平以形成并引起癌的消退；而專利文獻(xiàn)號BRPI0107262涉及哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)中細(xì)胞腫瘤的治療，其使用紫蘇醇來抑制腫瘤的形成和引起腫瘤的消退。紫蘇酸(PA)可以以左旋形式或(S)-PA(諸如紫蘇醇)商購獲得。因此，可推斷(S)-AP通過化學(xué)合成獲得，包括以前體而非(R)-檸檬烯引發(fā)的幾個步驟，因為這將產(chǎn)生右旋分子。因此，從低成本原料獲得的抗癌藥物的生產(chǎn)被認(rèn)為與群體的健康相關(guān)。這由檸檬烯代表，檸檬烯是柑橘產(chǎn)業(yè)的衍生物，其通過清潔技術(shù)加工，而不使用溶劑或有毒催化劑來產(chǎn)生活性成分。相比之下，該方法通過生物安全的酵母的作用使用含水生物學(xué)方法(aqueousbiologicalmethod)來轉(zhuǎn)化檸檬烯。此外，所開發(fā)的方法僅利用電能來攪拌該系統(tǒng)，而不應(yīng)用熱，即，其在室溫下進(jìn)行，具有中性pH(水pH)。這樣，發(fā)酵過程不僅利用了工業(yè)廢物，而且還生成了能生物降解的殘渣，從而滿足綠色化學(xué)(GreenChemistry)的原則。重要的是強調(diào)本發(fā)明的主題涉及化合物和藥物組合物，它們的生產(chǎn)方法具有高度的可持續(xù)性。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明包括根據(jù)式II的源自紫蘇酸的鹽形式的化合物，其中反離子M+包含堿金屬或堿土金屬，諸如例如Na+(鈉)、K+(鉀)、Ca+2(鈣)等。特別地，本發(fā)明的化合物是由紫蘇酸獲得的由式III表示的紫蘇酸鈉(NAP)，紫蘇酸由檸檬烯生物轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生。本發(fā)明的另一目的涉及藥物組合物，其包含式II的源自紫蘇酸的鹽形式的化合物，特別是式III的化合物紫蘇酸鈉(NAP)。本發(fā)明的又一目的是獲得式II的源自紫蘇酸的鹽形式的化合物，特別是式III的化合物紫蘇酸鈉(NAP)。此外，本發(fā)明涉及源自紫蘇酸的鹽形式的化合物(特別是，紫蘇酸鈉(NAP))在治療癌癥中的用途。本發(fā)明還提供了使用源自紫蘇酸的鹽形式的化合物(特別是紫蘇酸鈉(NAP))治療癌癥的方法。附圖說明下面簡要地描述每個附圖的內(nèi)容。圖1表示用于獲得源自紫蘇酸的化合物的方法的流程圖。圖2示出了(S)-NAP在HCT-116(高度惡性人類結(jié)腸腺癌)活力中的作用。線性回歸示出了0.9347的統(tǒng)計學(xué)顯著相關(guān)系數(shù)(R2)，使用了95％置信區(qū)間。圖3示出了(S)-NAP在HT-29(人類結(jié)腸腺癌)腫瘤細(xì)胞活力中的作用。線性回歸示出了0.9569的統(tǒng)計學(xué)顯著相關(guān)系數(shù)(R2)，使用了95％置信區(qū)間。圖4示出了對K562(白血病)細(xì)胞的抗增殖測定的結(jié)果。圖5示出了對MCF7(乳腺腫瘤)細(xì)胞的抗增殖測定的結(jié)果。圖6示出了對Lucena(多重耐藥性白血病)細(xì)胞的抗增殖測定的結(jié)果。圖7示出了對SKMEL(黑素瘤)細(xì)胞的抗增殖測定的結(jié)果。具體實施方式紫蘇酸(AP)(式I)以其抗癌活性而聞名，并且其可以通過由微生物(特別是屬于Arxula屬、假絲酵母屬(Candida)和耶氏酵母屬(Yarrowia)的酵母)對檸檬烯的作用所促進(jìn)的生物合成(生物轉(zhuǎn)化)而產(chǎn)生。反過來，檸檬烯是大規(guī)模地從柑橘產(chǎn)業(yè)的殘渣(橘皮)獲得的被歸類為單萜的化合物?；谖墨I(xiàn)中描述的使用紫蘇醇(POH)以及還使用紫蘇酸(PA)的臨床測定和臨床前測定的結(jié)果，源自紫蘇酸的鹽形式的化合物，特別是紫蘇酸鈉(NAP)，已經(jīng)成為防止腫瘤生長的可行藥劑(試劑)。使用源自紫蘇酸的鹽形式的化合物來治療腫瘤的主要原因如下：(i)在來自接受使用紫蘇醇的臨床治療的患者的血漿中發(fā)現(xiàn)了高濃度的紫蘇酸和二氫紫蘇酸；(ii)NAP在水性培養(yǎng)基中的溶解度高于POH和PA的溶解度，并因此，其在生理培養(yǎng)基和血漿中具有更大的溶解度，這使得其在體內(nèi)更易獲得，從而導(dǎo)致較低的濃度要求以達(dá)到與更大親脂性的衍生物(諸如紫蘇酸和紫蘇醇)相同的活性水平；(iii)源自紫蘇酸鹽的化合物的更高的生物利用度允許當(dāng)與紫蘇醇或紫蘇酸的更大親脂性的分子相比時在身體的不同器官中的性能更全面；(iv)紫蘇酸鹽的酸官能度和電離電位(ionizationpotential)促進(jìn)分子雜化物(hybrid)或新型藥物組合物的產(chǎn)生，從而使得可能的組合也鞏固它們在常規(guī)癌癥治療中作為佐劑和/或協(xié)同劑的用途。本發(fā)明包括獲得源自紫蘇酸的鹽形式的化合物(式II)，特別是紫蘇酸鈉(本文描述為NAP(式III))，其具有抗癌活性并且可溶于水。該分子從紫蘇酸獲得，而紫蘇酸又源自檸檬烯生物轉(zhuǎn)化。用于獲得紫蘇酸和紫蘇酸鈉的方法在獲得本發(fā)明的化合物紫蘇酸鈉(NAP)之前，必須借助于檸檬烯生物轉(zhuǎn)化來獲得紫蘇酸。通過生物過程，單萜檸檬烯通過微生物(特別是屬于Arxula屬、假絲酵母屬(Candida)和耶氏酵母屬(Yarrowia)的酵母)的作用而轉(zhuǎn)化為紫蘇酸。這種生物轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物紫蘇酸(AP)從生物水性培養(yǎng)基中提取，然后單獨轉(zhuǎn)化為通過鈉鹽NAP舉例說明的相應(yīng)的鹽，鈉鹽NAP由合適的堿在相容的溶劑中的作用產(chǎn)生。獲得方法發(fā)生在四個主要步驟中，如圖1的流程圖中所表示的。用于獲得鈉鹽(NAP)的方法例如包括以下步驟：1)細(xì)胞生長2)檸檬烯生物轉(zhuǎn)化3)從培養(yǎng)基分離紫蘇酸4)獲得鈉鹽(NAP)步驟1-細(xì)胞生長在該階段，從原種培養(yǎng)和生物量生產(chǎn)進(jìn)行細(xì)胞增殖。細(xì)胞生長階段使用所選擇的酵母，其根據(jù)如由美國食品和藥物管理局(FDA)(在美國負(fù)責(zé)藥物注冊的機構(gòu))建立的GRAS(通常被認(rèn)為安全)標(biāo)準(zhǔn)已被分類為安全。在該階段，產(chǎn)生足夠的生物量來開始生物轉(zhuǎn)化的理想的細(xì)胞生長條件是通過研究影響細(xì)胞培養(yǎng)的所考慮的參數(shù)(諸如碳源和氮源)來優(yōu)化。步驟2-檸檬烯生物轉(zhuǎn)化根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)解脂耶羅威亞酵母(Yarrowialipolytica)是產(chǎn)生特異性酶的微生物，其能夠?qū)幟氏┭趸勺咸K酸。獲得紫蘇酸(PA)的檸檬烯生物轉(zhuǎn)化發(fā)生在單個步驟中，其被測試用以下參數(shù)產(chǎn)生最大產(chǎn)量：a)5-20g/L之間的酵母細(xì)胞團(cellmass)的濃度；b)在反應(yīng)中使用的檸檬烯的量在0.1％和0.5％v/v之間；c)以單一份或以間歇份加入檸檬烯；d)培養(yǎng)基的pH介于5.7-7.4之間；和e)溫度范圍為20℃至30℃；以及，f)反應(yīng)時間為24至48小時。所獲得的PA的量與類似于使用細(xì)菌的檸檬烯的生物轉(zhuǎn)化器所報道的量相當(dāng)，即當(dāng)以相同規(guī)模進(jìn)行時約1g/L的檸檬烯，對應(yīng)于30％的轉(zhuǎn)化率。獲得紫蘇酸的方法相對于現(xiàn)有技術(shù)的優(yōu)點之一包括通過生物轉(zhuǎn)化選擇性生產(chǎn)PA，即所得的副產(chǎn)物不污染產(chǎn)物，諸如紫蘇醛、紫蘇醇和源自多羥基化檸檬烯的物質(zhì)。此外，生物轉(zhuǎn)化涉及水性培養(yǎng)基，因此消除了所有的有毒組分，從而符合當(dāng)前的環(huán)境要求。步驟3-從培養(yǎng)基提取紫蘇酸在該步驟中，AP在酸培養(yǎng)基中沉淀，或者可替換地利用合適的溶劑提取。因此，在完成檸檬烯的生物轉(zhuǎn)化步驟之后，開始該方法的第三步驟，其包括分離紫蘇酸(PA)的步驟，該步驟在正常的環(huán)境條件下是足夠穩(wěn)定的?？紤]到其單萜性質(zhì)(具有10個碳)和羧基官能的存在，可以以若干方式分離PA，其中選擇以下兩種：(1)用合適的溶劑分配：PA分離可以使用水不混溶的親脂性溶劑(特別是乙酸乙酯)通過液-液分配進(jìn)行；或者，(2)過濾與酸-堿分配的組合：提取可以通過理想化的一組操作來實現(xiàn)，所述操作包括在其某個階段中用無機酸和堿金屬氫氧化物增加/降低培養(yǎng)基的pH，在合適的膜上預(yù)先過濾或后過濾(post-filtration)；隨后回收最終的酸培養(yǎng)基，從而引起AP的沉淀，然后通過過濾最終分離AP。在該階段，分離PA用于兩個目的：它們中的前者用于隨后獲得源自紫蘇酸的NAP或其他鹽；以及后者用于獲得將被定量分析的樣品，以便評估酵母對檸檬烯的生物氧化的有效與否和所獲得的PA的質(zhì)量/純度。步驟4-獲得鈉鹽(NAP)在分離紫蘇酸(PA)后，該方法的第四且最后步驟涉及通過用來自堿金屬或堿土金屬的陽離子(諸如Na+(鈉)、K+(鉀)、Ca+2(鈣)等)取代羧酸的氫來獲得紫蘇酸鹽。該步驟旨在增加化合物在親水性溶劑中的溶解度以有利于溶劑化，從而促進(jìn)陰離子和相應(yīng)陽離子之間的分離的穩(wěn)定性。因此，將共價分子變成鹽的目的在于促進(jìn)制藥技術(shù)(藥學(xué)技術(shù)/藥物技術(shù)，pharmacotechnical)程序以及藥物的生物利用度。對于紫蘇酸(PA)，發(fā)現(xiàn)存在兩種對映體形式，其可以以下列方式獲得：●(S)-PA(左旋形式)-在試劑市場購買；或者●(R)-PA(右旋形式)-通過(R)-檸檬烯的轉(zhuǎn)化在實驗室中產(chǎn)生。兩種形式(左旋和右旋)可以產(chǎn)生相應(yīng)的鹽，而不損害每種形式固有的光學(xué)活性(對映異構(gòu))，只要紫蘇酸(PA)變成其相應(yīng)的鹽不影響其性質(zhì)。因此，與使用紫蘇酸(PA)的一種或另一種對映體(R或S)無關(guān)，其對紫蘇酸鹽(諸如例如，NAP)的變化的描述不需要詳述該條件，這是因為負(fù)責(zé)該活性的分子的手性中心將不會通過此種轉(zhuǎn)化而改變。因此，原始的PA對映體將被整體維持，即(R)-PA將僅產(chǎn)生(R)-NAP，并且(S)-PA將僅產(chǎn)生(S)-NAP。對商業(yè)的(S)-PA試劑和對于在實驗室中通過用解脂耶羅威亞酵母對(R)-檸檬烯生物轉(zhuǎn)化所產(chǎn)生的(R)-PA試劑二者進(jìn)行PA轉(zhuǎn)化為NAP鹽。在這種情況下，鹽(R)-NAP和(S)-NAP二者通過溶解在相應(yīng)的醇特別是甲醇中的堿金屬甲醇鹽特別是商購的甲醇鈉的作用而獲得。PA是相對可溶的，并且NAP(由于其離子特性)在醇中是相對不溶的。因此，在攪拌和冰浴冷卻下，將甲醇中的甲醇鈉溶液(10％-30％)以合適的濃度控制地加到另一種PA的甲醇溶液中，促進(jìn)了沉淀物的形成，如實施例5中所示的。使用稍微化學(xué)計量過量的甲醇鈉來確保在甲醇中形成NAP沉淀物和最大PA消耗。該沉淀物包含白色至微黃色固體，并且可以過濾、用丙酮洗滌、純化、干燥和儲存用于抗腫瘤活性測試。為了獲得NAP，可以使用兩種不同的途徑，其基于：(1)商業(yè)的(S)-PA與甲醇鈉的反應(yīng)，以及(2)通過用解脂耶羅威亞酵母的(R)-檸檬烯生物轉(zhuǎn)化生物合成(R)-PA，隨后使(R)-PA與甲醇鈉反應(yīng)以產(chǎn)生(R)-NAP，如下列方案中所描述的：通過常規(guī)光譜法特別是通過質(zhì)子磁共振(1H-NMR)來鑒定NAP。該鑒定由可用于紫蘇酸以及用于檸檬烯的比較數(shù)據(jù)支持。如通過氣相色譜(GC)所測量的，(S)-NAP和(R)-NAP的產(chǎn)率從44％變化至76％；也用于確定各自的純度。不存在描述該化合物或與其相關(guān)的數(shù)據(jù)的引用；這使它新穎。例如，根據(jù)式IV，對于R-NAP所獲得的1H-NMR的數(shù)據(jù)列于下面。對于化合物R-NAP所指示的值與S-NAP的值相同，這是因為所應(yīng)用的NMR技術(shù)不能區(qū)分對映體。下面描述實施例以提供本發(fā)明的細(xì)節(jié)。實施例1獲得解脂耶羅威亞酵母的細(xì)胞生物量在檸檬烯生物轉(zhuǎn)化中所使用的所用的酵母譜系解脂耶羅威亞酵母ATCC18942是基于收集外來培養(yǎng)物(美國典型培養(yǎng)物保藏中心)，對巴西領(lǐng)土的基因遺傳資源不存在有權(quán)鑒定(characterization)。所使用的菌株解脂耶羅威亞酵母的來源是OswaldoCruz的微生物的機構(gòu)收集，其保藏物存儲在InstitutoNacionaldeControledaQualidadeemSaúde-巴西國家衛(wèi)生質(zhì)量研究所(INCQS/FIOCRUZ)，記錄號為40149。最佳酵母培養(yǎng)條件涉及其生長于旋轉(zhuǎn)攪拌器(250rpm)上在YMB(酵母麥芽肉湯)(10g/L葡萄糖、3.0g/L酵母提取物、3.0g/L麥芽提取物和5.0g/L蛋白胨)中在25℃進(jìn)行48小時。培養(yǎng)在含有50ml的培養(yǎng)基的250ml錐形瓶中進(jìn)行，并在旋轉(zhuǎn)攪拌器中在以250rpm攪拌下在28℃下孵育細(xì)胞48小時。參照校準(zhǔn)曲線，在OD600測定細(xì)胞質(zhì)量濃度。OD600中的單位對應(yīng)于0.444g/L的解脂耶羅威亞酵母的干細(xì)胞濃度。實施例2使用解脂耶羅威亞酵母的檸檬烯生物轉(zhuǎn)化將如實施例1中所述的所獲得的酵母解脂耶羅威亞酵母的細(xì)胞團以3000g離心并用于R-(+)-檸檬烯轉(zhuǎn)化(96％-Fluka，Buchs，瑞士)。檸檬烯生物轉(zhuǎn)化的反應(yīng)條件如下：(i)溫度在20℃到30℃之間；(ii)在磷酸鹽緩沖液(50mM)中pH在5.7至7.4之間；(iii)細(xì)胞團濃縮物在5g/L到20g/L之間；以及(iv)0.1％至0.5％(v/v)的檸檬烯濃縮物。將反應(yīng)混合物在250rpm的攪拌下孵育，并通過以3000g離心從上清液(含有PA)中分離細(xì)胞。根據(jù)GC-FID分析(參見下文)，檸檬烯生物轉(zhuǎn)化導(dǎo)致1g/L的紫蘇酸的形成。通過具有火焰離子化檢測器(GC-FID)的氣相色譜法測量生物轉(zhuǎn)化中的紫蘇酸的產(chǎn)生。為此，在兩種不同的制劑中分析樣品，如實施例3A和3B中所述的。GC分析在具有毛細(xì)管柱HP-Innowax(30m×0.25mm×0.25mm的膜厚度)的氣相色譜儀(型號NetworkHP6890N)中進(jìn)行，流速為2.0mL/min以及流動分級速率模式1/15(進(jìn)樣口“分流/不分流”)。溫度程序如下：初始溫度為50℃，保持2分鐘，最終溫度為250℃，保持8分鐘，并且加熱速率為10℃/min。使用氦氣作為輸送氣體。將進(jìn)樣口溫度調(diào)節(jié)至270℃。在270℃下利用火焰離子化檢測器(FID)進(jìn)行檢測。為了檢測所形成的PA，使用商業(yè)的(S)-紫蘇酸來建立校準(zhǔn)曲線。通過生物轉(zhuǎn)化所獲得的紫蘇酸的結(jié)構(gòu)通過與用電子轟擊(GC-EI)的質(zhì)譜偶聯(lián)的氣相色譜來證實。除了使用HP-5MS柱之外，以在GC-FID中使用的相同條件進(jìn)行分析。在該柱中，紫蘇酸在13.03分鐘中洗脫，從而導(dǎo)致與商業(yè)的化合物相同的質(zhì)譜裂解[m/z166(M+)、121(M+-CO2H)、105、93、79、68]。實施例3從反應(yīng)培養(yǎng)基中分離紫蘇酸實施例3A：通過溶劑提取將來自檸檬烯生物轉(zhuǎn)化的水相轉(zhuǎn)移到1L的提取器中，并且加入NaCl(75g/L)，攪拌直至完全溶解該鹽。水相用乙酸乙酯(三份的325mL/L)提取，并且在分液漏斗中與有機相分離。在合并有機相之后，加入干燥劑Na2SO4(10至15g/L)。溶劑過濾和在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中的濃縮導(dǎo)致獲得微黃色固體，然后在高真空下將其干燥。該方法的平均產(chǎn)率在80％到90％之間，并且樣品的平均純度在80％到85％之間，如通過GC所測定的。一旦以較小規(guī)模進(jìn)行，則該程序也用于制備用于通過所獲得的PA的GC分析的樣品。實施例3B：通過添加酸進(jìn)行的PA沉淀將來自檸檬烯的水相的等分試樣(1ml)轉(zhuǎn)移到離心管中，向其中加入50μL的0.6M的HCl以誘導(dǎo)沉淀。在以10,000rpm離心10分鐘并棄去上清液后，將沉淀物溶解到2ml的乙酸乙酯中，用于GC分析。使用商業(yè)的紫蘇酸的人工制劑來評價該樣品的制備方法，從而獲得98.1％的回收率。一旦以更大的規(guī)模進(jìn)行，則該程序也用于從生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中提取PA。實施例4紫蘇酸鈉(NAP)制備在MeOH(5.3-7.3mL)中的紫蘇酸(580-702mg；3.5-4.2mmol)的溶液中，在冷卻(10-0℃)下加入MeONa的商業(yè)溶液(30％，Vetec)直到完成沉淀。過濾濾液并通過用冰冷的丙酮(8.5至10.5mL)洗滌來純化，在真空干燥后，提供對應(yīng)于NAP的微黃色固體(480至722mg，產(chǎn)率從73％至91％)。對商業(yè)試劑(S)-PA和對在實驗室中通過(R)-檸檬烯生物轉(zhuǎn)化所產(chǎn)生的(R)-PA二者進(jìn)行該方法；從而分別獲得(S)-NAP和(R)-NAP。通過常規(guī)光譜法特別是1H-NMR來鑒定所獲得的產(chǎn)物。實施例5(S)-NAP分子對高度惡性人類結(jié)腸腺癌細(xì)胞-HCT-116的殺腫瘤作用進(jìn)行該實施例以證明紫蘇酸鈉的殺腫瘤能力。首先評價(S)-NAP對具有惡性程度增加的人類結(jié)腸腺癌細(xì)胞(Caco2、HT-29、HCT-116和正常對照細(xì)胞MDCK、達(dá)爾馬提亞人腎細(xì)胞)的活力的影響。增殖測定(i)細(xì)胞培養(yǎng)：使用具有降低的惡性水平的人類結(jié)腸腺癌細(xì)胞系HCT116、HT-29和Caco-2。作為上皮細(xì)胞模型的對照，使用引流(drainage)上皮的正常細(xì)胞系(IEC-6)。根據(jù)ATCC規(guī)范培養(yǎng)這些細(xì)胞，并在具有5％的CO2的烘箱中在37℃下在DMEM培養(yǎng)基中保持直至達(dá)到半?yún)R合(semiconfluence)。(ii)處理：首先，測試紫蘇酸鈉的濃度(1.0、1.8、2.6、3.4、4.2和5.0mM)以測定藥物的IC50。在用(S)-NAP處理之前和處理24小時期間，單層半?yún)R合細(xì)胞被血清去除24小時。(iii)活力測試：將該譜系接種在具有含有上述的不同的(S)-NAP濃度的DMEM培養(yǎng)基的96孔平底板中。細(xì)胞與(S)-NAP的孵育在37℃下進(jìn)行24小時，此后，用MTT[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物](2.5mg/ml)以250μg/ml的最終濃度孵育該板2小時。將板在4℃下以1200RPM離心5分鐘，傾倒以除去上清液，這是因為晶體已沉積在細(xì)胞內(nèi)。將甲臜晶體溶解到100μl的DMSO中，并手動均質(zhì)化且通過裝置。在平板讀數(shù)器(SpectraMax190)中在538nm處測定吸光度。與實驗同時進(jìn)行無藥物添加100％活力和使用甲醛的0％活力的對照。結(jié)果被證明對治療是難治的CaCO2細(xì)胞，以及最具侵襲性的細(xì)胞HCT-116是最受影響的細(xì)胞。因此，使用HCT-116進(jìn)行試驗，并且CaCO2作為陰性對照。在圖2和圖3中以及表1中示出了(S)-PA的殺腫瘤作用。表1-用(S)-NPA進(jìn)行的體外測定*受NAP溶解度限制的濃度高于該值。實施例6-使用(R)-AP、(S)-AP、(R)-NAP和(S)-NAP的抗增殖作用進(jìn)行實施例6以確定以下樣品對人類腫瘤譜系的生物活性：(S)-紫蘇醇、(S)-AP、(R)-AP、(S)-NAP和(R)-NAP。將(S)-紫蘇醇與鈉酸和鹽的樣品結(jié)合進(jìn)行測試，這是因為它是被認(rèn)為具有一些確立的臨床功效的物質(zhì)。增殖測定接收樣品(R)-AP、(S)-AP、(R)-NAP、(S)-NAP和紫蘇醇(POH)并溶解于DMSO或鹽水溶液(0.9％的NaCl)中并在-20℃下保存直至實驗當(dāng)天，在使用前立即將它們稀釋在富含10％胎牛血清、100U/l青霉素和0.1mg/ml鏈霉素以及0.05mg/ml慶大霉素的細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM(DMEM完全培養(yǎng)基)中。根據(jù)分子藥理學(xué)實驗室的標(biāo)準(zhǔn)操作程序FARMO1003版本00進(jìn)行實驗，其總結(jié)如下。在DMEM完全培養(yǎng)基上培養(yǎng)K562(白血病)、LUCENA(多藥耐藥性白血病)、SKMEL28(黑素瘤)和MCF7(乳腺腫瘤)細(xì)胞，并保持在對數(shù)生長期。在用樣品處理之前24小時，將100μl的細(xì)胞懸浮液(5×104個細(xì)胞/ml)加入96孔板的孔中，并保持在5％CO2氣氛、37℃下的烘箱中。以響應(yīng)劑量(0.01至100μM；5個點)進(jìn)行五種樣品中的每一個的處理，每個濃度一式三份。在48小時后，加入噻唑藍(lán)(MTT；SIGMA代碼M5655)，并將板在具有CO2的烘箱中保持4小時。在孵育時間后，吸出上清液，并用異丙醇溶解由細(xì)胞活性所形成的甲臜晶體，并在完全溶解后，在微板讀數(shù)器中在570nm處(VictorX5；PerkinUSA)進(jìn)行光密度測定。結(jié)果：圖4示出了用樣品R-NAP(R-型紫蘇酸鈉)的處理顯示出最佳性能，具有1.24μM的IC50。其他測試樣品不顯示需要計算IC50的抑制。圖5示出了用五種樣品(R)-PA、(S)-PA、(R)-NAP、(S)-NAP和(POH)的處理顯示出沒有使IC50計算必需的抑制。圖6示出了用樣品(R)-NAP(R-型紫蘇酸鈉)的處理顯示出最佳性能，具有0.013μM的IC50。其他測試樣品不顯示需要在所用的劑量間隔內(nèi)IC50計算的抑制。圖7示出了用樣品(S)-PA(S-型紫蘇酸鈉)和(R)-NAP(R-型紫蘇酸鈉)的處理在所用劑量間隔內(nèi)顯示出沒有使IC50計算必需的抑制。在所測試的樣品中，樣品(R)-NAP(R-型紫蘇酸鈉)顯示出最佳性能，示出對K562和LUCENA譜系的活性，分別具有1.240和0.013μM的IC50，而其他測試樣品在所用的劑量間隔內(nèi)對任何所測試的譜系均沒有顯示相關(guān)活性?；谇笆鼋Y(jié)果，已經(jīng)證明了紫蘇酸的鈉鹽(即，紫蘇酸鈉)是適用于治療癌癥的產(chǎn)品，并且它也可以用作常規(guī)治療的協(xié)同佐劑。本發(fā)明的藥物組合物包含作為單一成分或與抗癌劑組合的從紫蘇酸(其在使用酵母解脂耶羅威亞酵母的檸檬烯的生物轉(zhuǎn)化過程中產(chǎn)生)獲得的紫蘇酸鈉，所述組合物根據(jù)用于制備藥物組合物的常規(guī)技術(shù)被配制到適用于人類的藥學(xué)上可接受的載體、佐劑和/或賦形劑中。可用于本發(fā)明組合物中的藥學(xué)上可接受的載體包括常規(guī)的藥學(xué)載體，諸如磷酸緩沖鹽溶液、水和乳劑(諸如油包水乳劑或水包油乳劑)。該組合物可另外含有固體藥物賦形劑，諸如淀粉、纖維素、滑石、葡萄糖、乳糖、蔗糖、凝膠、麥芽、大米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鎂、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、氯化鈉、脫脂乳粉和類似物質(zhì)。液體和半固體賦形劑可以選自甘油、丙二醇、水、乙醇和各種油，包括石油、動物油、植物油或合成來源的油，比如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。(特別是用于可注射溶液的)液體載體包括水、鹽水、葡萄糖水溶液和二醇。作為合適的藥學(xué)上可接受的載體、佐劑和/或賦形劑的實例，參見由E.W.Martin編輯的RemingtonPharmaceuticalSciences(MackPublishingCompany，18th版，1,90)。該組合物還可以包括穩(wěn)定劑和防腐劑。對于權(quán)利要求中的術(shù)語“治療有效量”，應(yīng)當(dāng)理解，治療有效量是足以治療特定病癥或疾病的量，或者可替換地，足以獲得對病癥或疾病治療的藥理反應(yīng)(pharmacologicalresponse)的量。確定最有效的給藥方式和給藥劑量的方法可隨用于治療的組合物、治療的目的、待治療的靶細(xì)胞和待治療的患者而變化。通?？梢缘味ㄖ委焺┝恳詢?yōu)化安全性和功效。單次或多次給藥可以在由醫(yī)生選擇的劑量水平和標(biāo)準(zhǔn)下進(jìn)行。合適的劑量配制和給藥方法可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。比如，以約0.01mg/kg至約200mg/kg、以約0.1mg/kg至約100mg/kg或以約0.5mg/kg至約50mg/kg給予該組合物。當(dāng)本文所描述的化合物與另一種藥劑或療法共同給藥時，有效量可以小于當(dāng)單獨使用藥劑時的有效量。也就是說，所述組合物可以與也用作抗癌劑的另一種化合物組合使用。本發(fā)明的藥物組合物包含治療有效量的源自紫蘇酸的鹽形式的化合物(根據(jù)式II)以及適用于人類的藥學(xué)上可接受的載體、佐劑和/或賦形劑。根據(jù)本發(fā)明，將源自紫蘇酸的鹽形式的化合物(根據(jù)式II)(其中反離子M+包括堿金屬或堿土金屬，諸如Na+(鈉)、K+(鉀)、Ca2+(鈣)等)，特別是由式III表示的紫蘇酸鈉(NAP)用于制備用于治療、預(yù)防或抑制癌形成的藥物。式II的化合物還可以用于治療與非實體瘤(諸如白血病、多發(fā)性骨髓瘤、血液惡性腫瘤或淋巴瘤)以及與實體瘤及其轉(zhuǎn)移(諸如黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肝細(xì)胞癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、甲狀腺癌、膽管腫瘤、骨腫瘤、胃腫瘤、腦/CNS腫瘤、頭頸腫瘤、肝腫瘤、腹部腫瘤、前列腺腫瘤、乳腺腫瘤、腎腫瘤、睪丸腫瘤、卵巢腫瘤、皮膚腫瘤、子宮頸腫瘤、肺腫瘤、子宮腫瘤、外陰腫瘤、子宮內(nèi)膜腫瘤、結(jié)腸直腸腫瘤、胰腺腫瘤、胸膜/腹膜腫瘤、膜腫瘤、涎腺腫瘤和表皮樣腫瘤)相關(guān)的疾病。根據(jù)本發(fā)明，源自紫蘇酸的鹽形式的式(II)化合物可以用于制備用于在溫血動物(諸如人類生物)中產(chǎn)生抗癌作用的藥物。根據(jù)本發(fā)明，包含源自紫蘇酸的鹽形式的根據(jù)式II的化合物(其中反離子M+包括堿金屬或堿土金屬，諸如Na+(鈉)、K+(鉀)、Ca2+(鈣)等)特別是由式III表示的紫蘇酸鈉(NAP)的藥物組合物被用于制備用于癌癥治療、預(yù)防和形成抑制的藥物。本發(fā)明還包括包含作為單一成分或與抗癌劑組合的式(II)的化合物，特別是式(III)的化合物(紫蘇酸鈉)用于治療癌癥的方法。當(dāng)前第1頁1 2 3