用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的單克隆抗體對(duì)及雙抗夾心酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種雜交瘤細(xì)胞對(duì)、一種單克隆抗體 對(duì)和它們?cè)跈z測(cè)轉(zhuǎn)G2-EPSPS基因農(nóng)作物中的用途以及一種雙抗夾心酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑 盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 草甘膦是農(nóng)業(yè)應(yīng)用最廣泛的除草劑之一，主要作用于植物和微生物等的5-烯醇 氏丙酮酰莽草酸-3-磷酸（EPSP)合酶，阻斷莽草酸代謝途徑，導(dǎo)致芳香族氨基酸及其衍生 物合成受阻。由于自然界中絕大部分植物體內(nèi)EPSP合酶均屬于草甘膦敏感型，因此草甘膦 除草劑具有十分優(yōu)秀的廣譜性。但是自然界微生物群體的多樣性造就微生物中EPSP合酶 的多樣性，部分微生物體內(nèi)EPSP合酶對(duì)草甘膦不敏感，利用基因工程技術(shù)將草甘膦不敏感 EPSP合酶轉(zhuǎn)入目標(biāo)植物中以替代內(nèi)源敏感型EPSP合酶，將使該植物獲得草甘膦除草劑抗 性。
[0003] 抗草甘膦除草劑轉(zhuǎn)基因大豆是世界上第一例商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因作物，隨后孟 山都公司利用該基因先后研發(fā)了多種轉(zhuǎn)基因抗草甘膦作物（大豆、棉花、玉米、苜蓿、甘蔗 等）。自1996年上市以來，在全世界轉(zhuǎn)基因作物品種及種植面積迅猛增加，從171萬公頃增 加到2014年的1. 815億公頃。全球種植轉(zhuǎn)CP4-EPSPS作物累計(jì)超過1億公頃。
[0004] G2-EPSPS蛋白編碼基因克隆自草甘膦污染土壤細(xì)菌基因組文庫，具有很高的草 甘膦耐受性。該基因編碼的蛋白經(jīng)分析屬于Class I類型，酶活測(cè)定顯示該蛋白具有高底 物親和能力和低草甘膦親和力，因此能賦予宿主高草甘膦除草劑耐受力。在酶學(xué)水平上 G2-EPSPS基因草甘膦耐受性高于孟山都公司的CP4-EPSPS基因。我國(guó)抗草甘膦作物一旦廣 泛應(yīng)用，田間耕作方式將發(fā)生革命性的變革，意義重大。
[0005] ELISA抗原檢測(cè)方法以其敏感、特異、易于操作而被廣泛使用，適用于大量樣品的 快速檢測(cè)。本專利應(yīng)用由兩株雜交瘤細(xì)胞分泌的配對(duì)單克隆抗體制成的雙抗體夾心ELISA 檢測(cè)試劑盒可以用于檢測(cè)G2-EPSPS蛋白及其轉(zhuǎn)基因作物和產(chǎn)品?？蓹z測(cè)到的線性范圍為 0-1000ng/mL，并且對(duì)CP4-EPSPS及27種非轉(zhuǎn)基因作物和14種不同來源的非G2-EPSPS轉(zhuǎn) 基因作物也都不呈現(xiàn)交叉反應(yīng)，具有較高的特異性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種靈敏特異的雙抗體夾心ELISA試劑盒檢測(cè)G2-EPSPS蛋 白的方法。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，一方面，本發(fā)明提供了一種雜交瘤細(xì)胞對(duì)，其中，該雜交瘤細(xì) 胞對(duì)包括獨(dú)立存放的第一雜交瘤細(xì)胞株和第二雜交瘤細(xì)胞株；所述第一雜交瘤細(xì)胞株的保 藏編號(hào)為CGMCC NO. 10498 ;所述第二雜交瘤細(xì)胞株的保藏編號(hào)為CGMCC NO. 10496。
[0008] 再一方面，本發(fā)明還提供了一種單克隆抗體對(duì)，該單克隆抗體對(duì)包括獨(dú)立存放的 第一單克隆抗體和第二單克隆抗體；所述第一單克隆抗體由第一雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生；所述 第二單克隆抗體由第二雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生；所述第一雜交瘤細(xì)胞株的保藏編號(hào)為CGMCC NO. 10498 ;所述第二雜交瘤細(xì)胞株的保藏編號(hào)為CGMCC NO. 10496。
[0009] 再一方面，本發(fā)明還提供了如上所述的單克隆抗體對(duì)在檢測(cè)G2-EPSPS蛋白中的 用途。
[0010] 再一方面，本發(fā)明還提供了一種雙抗體夾心ELISA檢測(cè)試劑盒，所述第一單克隆 抗體作為包被抗體，HRP標(biāo)記的第二單克隆抗體作為檢測(cè)抗體。所述第一單克隆抗體和所述 第二單克隆抗體構(gòu)成單克隆抗體對(duì)，其中，所述單克隆抗體對(duì)為如上所述的單克隆抗體對(duì)。 通過上述技術(shù)方案，本試劑盒可檢測(cè)到線性范圍為〇-l〇〇〇ng/mL，并且對(duì)CP4-EPSPS及27種 非轉(zhuǎn)基因作物和14種不同來源的非G2-EPSPS轉(zhuǎn)基因作物也都不呈現(xiàn)交叉反應(yīng)，具有較高 的特異性。
[0011] 本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的【具體實(shí)施方式】部分予以詳細(xì)說明。
[0012] 生物材料保藏
[0013] 本發(fā)明的第一雜交瘤細(xì)胞株是本發(fā)明的發(fā)明人自行融合篩選得到的，其保藏編號(hào) 為CGMCC NO. 10498,保藏日期為2015年04月10日，保藏單位為中國(guó)微生物菌種保藏管理 委員會(huì)普通微生物中心，地址位于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研 究所，分類命名為抗G2單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株。
[0014] 本發(fā)明的第二雜交瘤細(xì)胞株是本發(fā)明的發(fā)明人自行融合篩選得到的，其保藏編號(hào) 為CGMCC NO. 10496,保藏日期為2015年04月10日，保藏單位為中國(guó)微生物菌種保藏管理 委員會(huì)普通微生物中心，地址位于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研 究所，分類命名為抗G2單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株。
【附圖說明】
[0015] 附圖是用來提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與下面的具 體實(shí)施方式一起用于解釋本發(fā)明，但并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。在附圖中：
[0016] 圖1是實(shí)施例2中雙抗體夾心ELISA檢測(cè)試劑盒在檢測(cè)G2-EPSPS蛋白的線性相 關(guān)曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描 述的【具體實(shí)施方式】?jī)H用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0018] -方面，本發(fā)明提供了一種雜交瘤細(xì)胞對(duì)，其中，該雜交瘤細(xì)胞對(duì)包括獨(dú)立存放 的第一雜交瘤細(xì)胞株和第二雜交瘤細(xì)胞株；所述第一雜交瘤細(xì)胞株的保藏編號(hào)為CGMCC NO. 10498 ;所述第二雜交瘤細(xì)胞株的保藏編號(hào)為CGMCC NO. 10496。
[0019] 再一方面，本發(fā)明還提供了一種單克隆抗體對(duì)，該單克隆抗體對(duì)包括獨(dú)立存放的 第一單克隆抗體和第二單克隆抗體；所述第一單克隆抗體由第一雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生；所述 第二單克隆抗體由第二雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生；所述第一雜交瘤細(xì)胞株的保藏編號(hào)為CGMCC NO. 10498 ;所述第二雜交瘤細(xì)胞株的保藏編號(hào)為CGMCC NO. 10496。
[0020] 再一方面，本發(fā)明還提供了如上所述的單克隆抗體和如上所述的單克隆抗體對(duì)在 檢測(cè)G2-EPSPS蛋白中的用途。
[0021] 再一方面，本發(fā)明還提供了一種雙抗夾心酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其中，該試劑盒包 括：酶聯(lián)板、包被緩沖液、第一單克隆抗體、封閉液、酶標(biāo)記的第二單克隆抗體、顯色底物和 終止液；所述第一單克隆抗體由保藏編號(hào)為CGMCC NO. 10498的雜交瘤細(xì)胞株分泌得到，所 述第二單克隆抗體由保藏編號(hào)為CGMCC NO. 10496的雜交瘤細(xì)胞株分泌得到。
[0022] 其中，為了提高定量檢測(cè)的準(zhǔn)確性并提高試劑盒的易用性，優(yōu)選地，該試劑盒還含 有G2-EPSPS蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。
[0023] 其中，所述包被緩沖液可以為常規(guī)的ELISA包被緩沖液，例如為含有0. 05-0. 1體 積％吐溫-20的磷酸鹽緩沖液。
[0024] 其中，所述封閉液可以為常規(guī)的ELISA封閉液，例如為含有0. 05-0. 1體積％吐 溫-20和5-10重量％酪蛋白的磷酸鹽緩沖液。
[0025] 其中，對(duì)第二單克隆抗體的酶標(biāo)記可以為本領(lǐng)域常規(guī)的酶標(biāo)記方案，例如，可以按 照Pierce HRP標(biāo)記試劑盒（Cat No31488)的說明書中的方法進(jìn)行酶標(biāo)記。優(yōu)選地，酶標(biāo)記 的第二單克隆抗體的標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶，當(dāng)標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶 時(shí)，所述顯色底物包括顯色底物A和顯色底物B，所述顯色底物A為過氧化氫或過氧化脲，所 述顯色底物B為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺，所述終止液為l-2mol/L的硫酸或鹽酸緩沖液； 當(dāng)標(biāo)記酶為堿性磷酸酶時(shí)，所述顯色底物為對(duì)硝基磷酸鹽緩沖液，所述終止液為l_2mol/L 氫氧化鈉。
[0026] 本發(fā)明的試劑盒的使用方法可以包括：將第一單克隆抗體用包被緩沖液稀釋后 包被于酶聯(lián)板上，然后用包被緩沖液洗去多余的第一單克隆抗體；接著用封閉液封閉經(jīng)包 被的酶聯(lián)板，然后用包被緩沖液洗板以洗去多余的封閉液；接著加入待檢測(cè)樣品，然后用 包被緩沖液洗板以洗去多余的待檢測(cè)樣品；接著加入酶標(biāo)記的第二單克隆抗體，然后用包 被緩沖液洗板以洗去多余的酶標(biāo)記的第二單克隆抗體；接著加顯色底物顯色，然后加終止 液終止反應(yīng)；測(cè)定0D450值；若待測(cè)樣品中含有G2-EPSPS蛋白，則會(huì)有顯色反應(yīng)，若不含 G2-EPSPS蛋白，則呈