專利名稱：氨基酸的分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于氨基酸的分析方法，特別涉及一種在低壓狀態(tài)下采用電導(dǎo)檢測器進行檢測的氨基酸分析方法。
背景技術(shù)：
有關(guān)氨基酸的分析始于二十世紀三、四十年代。四十年代后期，Moore和Stein將離子交換樹脂用于氨基酸分析中，并于1958年研制出了世界上第一臺采用離子交換色譜法和柱后茚三酮衍生檢測法的自動專用氨基酸分析儀，自此，上述方法與配套儀器一直在氨基酸分析中占主導(dǎo)地位；七十年代以來，高效液相色譜特別是鍵合反相色譜及柱前衍生技術(shù)的發(fā)展，為氨基酸分析提供了新的方法，并開發(fā)了除茚三酮外的一系列衍生劑。以上方法雖然解決了氨基酸的定量分析，但都需要利用衍生反應(yīng)才能進行檢測，而且其工藝步驟中包括梯度洗脫，操作十分煩瑣；此外，都需在2000～4000Psi高壓下操作完成檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種氨基酸分析的新方法，此種方法既能保證分析效果，又能簡化工藝流程和降低分析成本。
本發(fā)明的技術(shù)方案是根據(jù)氨基酸分子中既有氨基又有羧基的兩性電離特征、分子側(cè)鏈基團的性質(zhì)和等電點的pH范圍，采用陽離子交換色譜法設(shè)計工藝步驟，工藝步驟依次包括基線測繪、進樣和離子交換、洗脫分析。
1、基線測繪將洗脫液用低壓泵輸送入色譜分離柱使其達到平衡，從色譜分離柱輸出的洗脫液流過電導(dǎo)流通池時由電導(dǎo)檢測器轉(zhuǎn)化為電信號，從而形成基線被測繪。
2、進樣和離子交換含有氨基酸的被測試樣在洗脫液的推動下進入色譜分離柱產(chǎn)生離子交換，帶正電荷的氨基酸置換下色譜分離柱上的氫離子并保留在色譜分離柱上。
3、洗脫分析將洗脫液連續(xù)輸送入色譜分離柱不斷將各種氨基酸在色譜分離柱上展開，各種氨基酸離子產(chǎn)生差速遷移而相互分離，在不同的保留時間被洗脫，從色譜分離柱輸出的含氨基酸離子的溶液流過電導(dǎo)流通池時由電導(dǎo)檢測器轉(zhuǎn)化為電信號，從而形成譜圖被測繪。
洗脫液按照氨基酸的酸堿性選擇，分析酸性和中性氨基酸時，洗脫液采用濃度為0.5～2.0×10-3mol/L的HNO3溶液，分析堿性氨基酸時，洗脫液采用濃度為6～10×10-3mol/L的檸檬酸鉀溶液，以便使被測氨基酸均帶正電荷，以陽離子形式存在。
色譜分離柱的填料為低交換容量的表面離子交換樹脂，最好選用苯乙烯-二乙烯基苯高分子聚合物并將交換容量控制在0.01～0.04mmol/g。色譜分離柱的填料粒度一般為10～30μm，色譜分離柱的尺寸一般為φ3～φ6×40～200mm。
本發(fā)明具有以下有益效果1、對多種常見氨基酸能進行良好的分離，變異系數(shù)為1～5％，檢測限可達10-6g/ml，在10-3～10-5mol/L的濃度范圍內(nèi)，峰高對濃度呈良好的線性關(guān)系。
2、由于采用電導(dǎo)檢測器進行檢測，不需要對被測試樣進行梯度洗脫，因而簡化了工藝流程。
3、分析時，將試樣直接注入色譜分離柱并經(jīng)電導(dǎo)檢測器檢測就能獲得譜圖，去除了現(xiàn)有分析方法中的柱前或柱后衍生步驟，使工藝流程大為簡化。
采用低壓泵輸送，所需配套分析儀器的成本大為降低，工藝的簡化，既節(jié)約了試劑又可縮短分析時間，因而分析成本低，便于普及推廣。
四

圖1是根據(jù)本發(fā)明提供的方法獲得的常見酸性、中性氨基酸色譜圖；圖2是根據(jù)本發(fā)明提供的方法獲得的常見堿性氨基酸色譜圖；圖3是根據(jù)本發(fā)明提供的方法獲得的所測氨基酸His、Ala、Phe、Pro在10-3～10-4mol/L的濃度范圍內(nèi)濃度與峰高的關(guān)系圖；圖4是根據(jù)本發(fā)明提供的方法獲得的所測氨基酸Met、Pro、Glu在10-4～10-5mol/L的濃度范圍內(nèi)濃度與峰高的關(guān)系圖。
五具體實施例方式
實施例1本實施例是對常見酸性、中性、堿性氨基酸進行分析，所用試樣為已知濃度的氨基酸標樣。
1)酸性、中性氨基酸的分析使用的儀器按本發(fā)明提供的方法設(shè)計的氨基酸分析儀，其工作壓力為30～40Psi洗脫液1.0×10-3mol/L硝酸溶液，流速1.2ml/min色譜分離柱填料為苯乙烯-二乙烯基苯高分子聚合物，交換容量0.02mmol/g，填料粒度25～30μm，尺寸為φ5×200mm分析步驟A、基線測繪操作氨基酸分析儀，將洗脫液輸送入色譜分離柱使其達到平衡，從已知濃度的氨基酸標樣。色譜分離柱輸出的洗脫液流過電導(dǎo)流通池時由電導(dǎo)檢測器轉(zhuǎn)化為電信號，從而形成基線被測繪。
B、譜圖測繪將含有氨基酸的被測試樣注入氨基酸分析儀的液體流路中，操作氨基酸分析儀，使洗脫液推動被測試樣進入色譜分離柱產(chǎn)生離子交換，帶正電荷的氨基酸置換下色譜分離柱上的氫離子并保留在色譜分離柱上；將洗脫液連續(xù)輸送入色譜分離柱不斷將各種氨基酸在色譜分離柱上展開，各種氨基酸離子產(chǎn)生差速遷移而相互分離，在不同的保留時間被洗脫，從色譜分離柱輸出的含氨基酸離子的溶液流過電導(dǎo)流通池時由電導(dǎo)檢測器轉(zhuǎn)化為電信號，從而形成譜圖被測繪。所測繪的譜圖見圖1。
2)堿性氨基酸的分析使用的儀器按本發(fā)明提供的方法設(shè)計的氨基酸分析儀，其工作壓力為30～40Psi洗脫液9.0×10-3mol/L檸檬酸鉀溶液，流速1.3ml/min色譜分離柱填料為苯乙烯-二乙烯基苯高分子聚合物，交換容量0.02mmol/g，填料粒度20～25μm，尺寸為φ5×40mm分析步驟與酸性、中性氨基酸的分析步驟相同。所測繪的譜圖見圖2。
實施例2本實施例是對蛋白質(zhì)水解注射液中的酸性、中性、堿性氨基酸進行分析。
1)酸性、中性氨基酸的分析使用的儀器按本發(fā)明提供的方法設(shè)計的氨基酸分析儀，其工作壓力為30～40Psi洗脫液1.5×10-3mol/L硝酸溶液，流速1.2ml/min色譜分離柱填料為苯乙烯-二乙烯基苯高分子聚合物，交換容量0.015mmol/g，填料粒度25～30μm，尺寸為φ6×150mm分析步驟與實施例1相同。
2)堿性氨基酸的分析使用的儀器按本發(fā)明提供的方法設(shè)計的氨基酸分析儀，其工作壓力為30～40Psi洗脫液8.0×10-3mol/L檸檬酸鉀溶液，流速1.3ml/min色譜分離柱填料為苯乙烯-二乙烯基苯高分子聚合物，交換容量0.015mmol/g，填料粒度20～25μm，尺寸為φ6×50mm分析步驟與酸性、中性氨基酸的分析步驟相同。
分析結(jié)果如下(mol/L)Asp 7.29×10-4Pro 1.16×10-3Val 9.75×10-4Phe 3.12×10-3His 2.20×10-3Lvs 1.88×10-4Arg 8.06×10-4實施例3本實施例是對氨基酸口服液中的酸性、中性、堿性氨基酸進行分析。
1)酸性、中性氨基酸的分析使用的儀器按本發(fā)明提供的方法設(shè)計的氨基酸分析儀，其工作壓力為30～40Psi洗脫液0.8×10-3mol/L硝酸溶液，流速1.2ml/min色譜分離柱填料為苯乙烯-二乙烯基苯高分子聚合物，交換容量0.03mmol/g，填料粒度25～30μm，尺寸為φ5×180mm分析步驟與實施例1相同。
2)堿性氨基酸的分析使用的儀器按本發(fā)明提供的方法設(shè)計的氨基酸分析儀，其工作壓力為30～40Psi洗脫液8.5×10-3mol/L檸檬酸鉀溶液，流速1.3ml/min色譜分離柱填料為苯乙烯-二乙烯基苯高分子聚合物，交換容量0.03mmol/g，填料粒度20～25μm，尺寸為φ5×45mm分析步驟與酸性、中性氨基酸的分析步驟相同。
分析結(jié)果如下(mol/L)Asp 8.33×10-4Glu 5.48×10-4Val 5.00×10-4Met 3.50×10-4Phe 6.60×10-3His 3.48×10-3Lys 2.50×10-4Arg 7.64×10-4上述實施例中所測的部分氨基酸的濃度與峰高的關(guān)系見圖3、圖4。
權(quán)利要求
1.一種氨基酸的分析方法，其特征在于工藝步驟依次包括1)基線測繪將洗脫液用低壓泵輸送入色譜分離柱使其達到平衡，從色譜分離柱輸出的洗脫液流過電導(dǎo)流通池時由電導(dǎo)檢測器轉(zhuǎn)化為電信號，從而形成基線被測繪，2)進樣和離子交換含有氨基酸的被測試樣在洗脫液的推動下進入色譜分離柱產(chǎn)生離子交換，帶正電荷的氨基酸置換下色譜分離柱上的氫離子并保留在色譜分離柱上，3)洗脫分析將洗脫液連續(xù)輸送入色譜分離柱不斷將各種氨基酸在色譜分離柱上展開，各種氨基酸離子產(chǎn)生差速遷移而相互分離，在不同的保留時間被洗脫，從色譜分離柱輸出的含氨基酸離子的溶液流過電導(dǎo)流通池時由電導(dǎo)檢測器轉(zhuǎn)化為電信號，從而形成譜圖被測繪。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氨基酸的分析方法，其特征在于1)分析酸性和中性氨基酸時，洗脫液采用濃度為0.5～2.0×10-3mol/L的HNO3溶液，分析堿性氨基酸時，洗脫液采用濃度為6～10×10-3mol/L的檸檬酸鉀溶液，2)色譜分離柱的填料為低交換容量的表面離子交換樹脂。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的氨基酸的分析方法，其特征在于低交換容量的表面離子交換樹脂為苯乙烯-二乙烯基苯高分子聚合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的氨基酸的分析方法，其特征在于色譜分離柱的填料的交換容量為0.01～0.04mmol/g。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的氨基酸的分析方法，其特征在于色譜分離柱的填料粒度為10～30μm，色譜分離柱的尺寸為φ3～φ6×40～200mm。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的氨基酸的分析方法，其特征在于色譜分離柱的填料粒度為10～30μm，色譜分離柱的尺寸為φ3～φ6×40～200mm。
全文摘要
一種氨基酸的分析方法，工藝步驟依次包括1、將洗脫液用低壓泵輸入色譜分離柱，從色譜分離柱輸出的洗脫液流過電導(dǎo)流通池時由電導(dǎo)檢測器轉(zhuǎn)化為電信號，從而形成基線被測繪；2、含有氨基酸的被測試樣在洗脫液的推動下進入色譜分離柱產(chǎn)生離子交換，氨基酸生成陽離子置換下色譜分離柱上的氫離子并保留在色譜分離柱上；3、將洗脫液連續(xù)輸入色譜分離柱洗脫氨基酸離子，從色譜分離柱輸出的含氨基酸離子的溶液流過電導(dǎo)流通池時由電導(dǎo)檢測器轉(zhuǎn)化為電信號，從而形成譜圖被測繪。此種方法不僅對氨基酸能進行良好的分析，而且工藝簡單、分析成本低。
文檔編號B01D15/08GK1410769SQ0212794
公開日2003年4月16日 申請日期2002年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月3日
發(fā)明者張新申, 戴紅, 蔣小萍 申請人:四川大學(xué)