一種測定枯草芽孢桿菌毒性的實驗方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于環(huán)境污染檢測技術(shù)領(lǐng)域,涉及一種測定枯草芽孢桿菌毒性的試驗方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 實驗室條件下進行化合物的生物效應(yīng)檢測,可為化合物的環(huán)境排放標準提供科學(xué) 依據(jù)。由于微生物生長周期短,測試方法簡單,測試成本低,又有著與高等生物類似的理化 特性和酶作用過程,因此以微生物作為受試生物的毒性測試方法在環(huán)境領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng) 用。
[0003] 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)廣泛存在于土壤、湖泊、海洋和動植物體的體 表,自身沒有致病性,只具有單層細胞外膜,對人畜無害且不污染環(huán)境,具有耐高溫、耐酸堿 和耐擠壓等特性,目前已被作為革蘭氏陽性菌毒性測試的模式菌株,廣泛應(yīng)用于各類化合 物的毒性檢測[1-3]。
[0004] 枯草芽孢桿菌毒性測試尚未有統(tǒng)一的標準方法,目前常用方法[4-7]主要有:(1) 平板計數(shù)法,即根據(jù)每個活菌能長出一個菌落的原理,將不同菌懸液進行平板培養(yǎng),根據(jù)長 出的菌落數(shù)算出培養(yǎng)物中的活菌數(shù);(2)抑菌圈測定法(瓊脂擴散紙片法),根據(jù)測定涂布 于瓊脂平皿上菌懸液培養(yǎng)后菌落直徑大小確定化合物對微生物生長的抑制;(3)比濁法, 測定原理為菌懸液中細菌數(shù)量與菌液濁度呈線性關(guān)系;(4)分光光度法,其原理與比濁法 類似,根據(jù)菌懸液中細菌數(shù)量與菌液吸光值呈線性關(guān)系,通過測定菌液吸光值進而得出菌 液中活菌的數(shù)量。
[0005] 以上枯草芽孢桿菌毒性測定方法目前較為普遍使用,但均存在一定缺陷。如平板 計數(shù)法一般選取菌落數(shù)在30~300之間的平板進行計數(shù),過多或過少均不準確,并且此法 僅限于測定形成菌落的微生物,操作費時且結(jié)果誤差較大;抑菌圈測定法對實驗無菌操作 要求較高,測定菌落直徑誤差較大;比濁法和分光光度法即時性差,操作繁瑣,所需樣品量 大,實驗再現(xiàn)性較為困難。
[0006] 在環(huán)境領(lǐng)域,實驗室進行化合物對生物的毒性效應(yīng)研究已成為化合物生態(tài)風(fēng)險評 價和制定環(huán)境標準的重要科學(xué)依據(jù)。枯草芽孢桿菌作為革蘭氏陽性菌的模式生物,常作為 模式生物用于各類化合物的毒性效應(yīng)檢測,但是目前對于枯草芽孢桿菌的毒性測試尚未形 成標準方法。因此,需建立一種枯草芽孢桿菌毒性測試方法以實現(xiàn):(1)受環(huán)境因素干擾 少,不易感染雜菌;(2)檢測快速,操作簡單,節(jié)約工作時間及空間;(3)減少樣品量以節(jié)約 實驗材料;(4)減少因人為操作帶來的結(jié)果誤差等。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007] 本發(fā)明的目的在于為克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷而提供一種測定枯草芽孢桿菌毒 性的實驗方法。
[0008] 為實現(xiàn)上述目的,本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0009] 本發(fā)明中,采用酶標儀對樣品進行檢測,其測定原理建立在物質(zhì)吸收光譜及可見 光比色技術(shù)基礎(chǔ)之上。
[0010] -種測定枯草芽孢桿菌毒性的實驗方法,其包括以下步驟:
[0011] (1)菌種復(fù)蘇與傳代;
[0012] (2)工作菌液的培養(yǎng)及平衡
[0013] (3)化合物對步驟⑵的平衡菌液進行毒性測試;
[0014] (4)毒性反應(yīng)后檢測試樣0D620進行毒性表征。
[0015] 所述步驟(1)中的菌種復(fù)蘇與傳代
[0016] 在固體斜面培養(yǎng)基上進行,將枯草芽孢桿菌凍干粉(購自中國科學(xué)院微生物所菌 種保藏管理委員會)溶解,接種到斜面上傳代3次后獲得穩(wěn)定生長的菌株F 3,置于4°C冰箱 保存?zhèn)溆茫?br>[0017] 其中,固體斜面培養(yǎng)基配方為:牛肉膏5. 0g,蛋白胨10. 0g,酵母提取物5. 0g,葡萄 糖5. 0g,NaC15. 0g,蒸餾水1. 0L,瓊脂15. 0g ;所述固體培養(yǎng)基用lmol/L NaOH調(diào)pH至7. 0。
[0018] 所述步驟(2)中的工作菌液培養(yǎng)及平衡,具體包括以下步驟:
[0019] (2a)培養(yǎng)工作菌液
[0020] 將傳代至F3的菌株用接種環(huán)接種到5mL液體培養(yǎng)基中,在溫度為37°C,培養(yǎng)箱轉(zhuǎn) 速180r/min條件下培養(yǎng)6~8h,以作為毒性測試的工作菌液;
[0021] 液體培養(yǎng)基配方為:牛肉膏5. 0g,蛋白胨10. 0g,酵母提取物5. 0g,葡萄糖5. 0g, NaC15. 0g,蒸餾水1. 0L ;所述液體培養(yǎng)基用lmol/L NaOH調(diào)pH至7. 0 ;
[0022] (2b)平衡工作菌液
[0023] 按照十萬分之一的稀釋量移取步驟(2a)的工作菌液到無菌水中,控制稀釋后工 作菌液細菌數(shù)為1〇 3個/mL,磁力攪拌器攪拌40min,以使得菌液穩(wěn)定。
[0024] 所述步驟(3)中的化合物毒性反應(yīng)在96孔微孔板中進行,具體包括以下步驟:
[0025] 設(shè)置96孔板加樣順序,控制每孔加樣總體積量為200 ii L,即80 ii L測試化合物 (根據(jù)配制化合物母液濃度及設(shè)置的化合物不同濃度梯度,孔板內(nèi)加入不同體積的化合物 溶液,不足80 ii L的用無菌水補充至80 ii L),80 ii L高倍液體培養(yǎng)基及40 ii L步驟(2b)的 平衡菌液。
[0026] 所述高倍培養(yǎng)基(2. 5倍)是為保證慢性毒性反應(yīng)(12h)過程中菌體生長所需正 常營養(yǎng)量。
[0027] 高倍液體培養(yǎng)基配方:牛肉膏12. 5g,蛋白胨25. 0g,酵母提取物12. 5g,葡萄糖 12. 5g,NaC112. 5g,蒸餾水1. 0L ;高倍液體培養(yǎng)基用lmol/L NaOH調(diào)pH至7. 0。
[0028] 所述的96孔板加樣順序為:
[0029] 外圍一圈加入200 ii L無菌水以防止孔板邊緣效應(yīng);
[0030] 第2列為空白組(120 y L無菌水,80 y L高倍液體培養(yǎng)基),以測得相同培養(yǎng)條件 下培養(yǎng)基基底〇D62。,從而得到化合物對菌體生長的絕對抑制率;
[0031] 第3, 7,11列為對照組(80 ii L無菌水,80 ii L高倍液體培養(yǎng)基,40 ii L工作菌液), 表征相同培養(yǎng)條件下菌體正常生長量;
[0032] 第4, 5,6及8,9,10列分別為12個化合物濃度梯度,每個濃度梯度3個平行。
[0033] 所述毒性反應(yīng),即加樣結(jié)束后進行混勻1000r/min速度震蕩lmin,以使得96孔板 內(nèi)體系均勻,然后將96孔板放入恒溫震蕩培養(yǎng)箱內(nèi),在溫度為37°C,培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)速為180r/ min條件下培養(yǎng)12h。
[0034] 所述步驟(4)中的毒性表征,具體包括以下步驟:步驟(3)試樣培養(yǎng)12h后取出, 用酶標儀檢測其光密度值(〇D 62。),化合物對枯草芽孢桿菌的毒性大小以化合物對枯草芽孢 桿菌吸收光〇D62。的抑制率進行表征,計算如下:
[0035] 抑制率(%) = [1_(樣品 0D62。一空白 OD620V(對照 0D62。一空白 0D6J]x100 %式 (1)
[0036] 其中,對照0D62。指的是樣品前后的空白0D62。的平均值。
[0037] 本發(fā)明所建立的方法為枯草芽孢桿菌毒性測試的基本方法,適用于各種污染物對 枯草芽孢桿菌的毒性作用測定。
[0038] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比,具有以下優(yōu)點和有益效果:
[0039] 1.酶聯(lián)免疫吸附實驗由于操作簡單,靈敏度高,特異性強等特點在環(huán)境領(lǐng)域已廣 泛使用。酶標儀作為酶聯(lián)免疫測定的常規(guī)儀器,測定原理基于物質(zhì)物質(zhì)吸收光譜及可見光 比色基礎(chǔ)之上,操作簡單、方便,減少實驗操作中人為讀數(shù)引起的誤差,實驗重復(fù)性好;樣品 檢測速度快,一次可檢測多個樣品,節(jié)省操作時間;實驗結(jié)果直接儲存于計算機中,實驗數(shù) 據(jù)處理方便;
[0040] 2.使用96孔微孔板測定化合物對枯草芽孢桿菌的毒性,實用樣品微量,節(jié)省實驗 材料及實驗試劑的用量,降低實驗成本。同時,培養(yǎng)后直接測定,環(huán)境對樣品干擾小,不易被 雜菌污染。
【附圖說明】
[0041] 圖1為本發(fā)明實施例的流程圖。
[0042] 圖2為本發(fā)明實施例96孔微孔板加樣設(shè)置示意圖。
[0043] 圖3為鄰苯二酚和間硝基苯酚對枯草芽孢桿菌的慢性毒性效應(yīng)圖。其中:(1)為 鄰苯二酸對枯草芽孢桿菌的慢性毒性效應(yīng),EC 5。值為396mg/L(文獻中采用分光光度計測定 結(jié)果為為437mg/L) ;(2)為間硝基苯酸對枯草芽孢桿菌的慢性毒性效應(yīng),EC5。值為440mg/ L (文獻中采用紫外-可見分光光度計測定結(jié)果為430mg/L)。
[0044] 圖4為應(yīng)用所建立方法測定5種磺胺類抗生素對枯草芽孢桿菌的慢性毒性效 應(yīng)結(jié)果圖,其中:(1)為磺胺吡啶(SPY)對枯草芽孢桿菌的慢性毒性效應(yīng)圖,EC50值為 51.5nmol/L ;
[0045] (2)為磺胺氯噠嗪(SCP)對枯草芽孢桿菌的慢性毒性效應(yīng)圖,EC50值為6. 78nmol/ L ;
[0046] (3)為磺胺甲惡唑(SMX)對枯草芽孢桿菌的慢性毒性效應(yīng)圖,EC50值為57. 3nmol/ L ;
[0047] (4)為磺胺二甲異惡唑(SSZ)對枯草芽孢桿菌的慢性毒性效應(yīng)圖,EC50值為 9.57nmol/L ;
[0048] (5)為周效磺胺(SFD)對枯草芽孢桿菌的慢性毒性效應(yīng)圖,EC50值為33. lnmol/ L〇
【具體實施方式】
[0049] 以下結(jié)合實施例進一步說明本發(fā)明。
[0050] 實施例1
[0051] -種使用96孔微孔板測定枯草芽孢桿菌毒性的實驗方法,其包括以下步驟(如圖 1所示):
[0052] (1)菌種復(fù)蘇與傳代,具體包括以下步驟:
[0053] 菌種復(fù)蘇及傳代在固體斜面培養(yǎng)基上進行;
[0054] 固體斜面培養(yǎng)基配方:牛肉膏5. 0g,蛋白胨10. 0g,酵母提取物5. 0g,葡萄糖5. 0g,
[0055] NaC15. 0g,蒸饋水 1. 0L,瓊脂 15. 0g
[0056] 固體培養(yǎng)基用lmol/L NaOH調(diào)pH至7. 0。
[0057] 將枯草芽孢桿菌凍干粉(購自中國科學(xué)院微生物所菌種保藏管理委員會)溶解, 接種到斜面上傳代3次后獲得穩(wěn)定生長的菌株F 3,置于4°C冰箱保存?zhèn)溆茫?br>[0058] (2)工作菌液培養(yǎng)及平衡,具體包括以下步驟:
[0059] (2a)工作菌液培養(yǎng)
[0060] 將傳代至F3的菌株用接種環(huán)接種到5mL液體培養(yǎng)基中,在溫度為37°C,培養(yǎng)箱轉(zhuǎn) 速180r/min條件下培養(yǎng)6~8h,以作為毒性測試的工作菌液;
[0061] 液體培養(yǎng)基配方:牛肉膏5. 0g,蛋白胨10. 0g,酵母提取物5. 0g,葡萄糖5. 0g,
[0062] NaC15. 0g,蒸餾水 1. 0L ;
[0063] 液體培養(yǎng)基用lmol/L NaOH調(diào)pH至7. 0。
[0064] (2b)工作菌液平衡
[0065] 按照十萬分之一的稀釋量移取步