專利名稱：硬質禾草內生真菌檢測技術的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種檢測方法，確切講是檢測一種生長于植物體內的真菌的方法。本發(fā)明的方法中包括將禾草樣品用染色劑進行染色，再將經染色的樣品置于光鏡下進行檢測，或者將經染色后的樣品稍加熱后再置于光鏡下進行檢測。
背景技術：
內生真菌(endophyte)是一類生活在植物體內而不表現(xiàn)外部癥狀的真菌。禾草感染內生真菌可以引起采食的家畜中毒甚至死亡。據(jù)美國和新西蘭的統(tǒng)計，每年僅因高羊茅內生真菌(Neotyphodium coenophialum)和黑麥草內生真菌(Lolium perenne)使牛羊患病、死亡造成的經濟損失就達6億美元之多?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，生長于我國北方的醉馬草(Achnatherum inebrians)中含有的內生真菌可能是引起家畜中毒的原因。但在另一方面，禾草內生真菌的侵染可以增加植物抗旱、抗蟲、抗病、耐踐踏等特性。因此，防治內生真菌對畜牧業(yè)的危害和利用內生真菌提高草坪草的抗逆性是當前國際研究的兩大熱點領域。而對禾草內生真菌的帶菌狀況進行檢測是從事上述研究的前提。
目前國際上通用的禾草內生真菌檢測方法為(1)直接光鏡檢測法；(2)血清學檢測法；(3)分子技術檢測法和(4)間接檢測法。在這四種檢測方法中，因后三種由于需較為復雜的前期準備，費時費工，且花費較大，一般不作為常用的檢測方法，直接光鏡檢測法由于簡便、方便，操作相對容易而被用作常用檢測方法?，F(xiàn)廣泛采用的直接光鏡檢測法除種子糊粉層檢測法外，更為簡便的是葉鞘染色法，它是沿禾草葉鞘內側撕取內皮層，再將內皮層用染色劑進行染色，然后將樣品置于光學顯微鏡下進行檢測。為使染色有更好的效果，也可以將染色后的樣品稍稍加熱，如將經染色后的樣品放置于電熱盤上或者酒精火焰上加熱數(shù)秒后，再置于光鏡下進行檢測。但這種檢測方法對于一些質地較為堅硬的禾草，如醉馬草、賴草(Leymus)、冰草(Agropyron)等，很難撕取其內皮薄膜，既使撕取所得的皮層也往往厚度不夠，因而影響采用葉鞘染色和光鏡檢測法對此類禾草內生真菌進行檢測，同時也影響其檢測的準確性。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供可以對質地較為堅硬的禾草進行葉鞘染色和直接光學顯微鏡檢測的方法。
本發(fā)明的方法分為兩種，其中的第一種方法適用于檢測生長期小于4周齡的早齡幼草，而第二種方法適用于檢測生長期大于4周齡的老齡幼苗或成株。
本發(fā)明的第一種方法是先將禾草樣品(可以是整個禾草分蘗)用5～15％的NaOH水溶液浸泡3～5小時后，然后再進行染色處理。
本發(fā)明的第二種方法是先將禾草樣品(使用葉鞘)用沸水煮4～8分鐘，再沿葉鞘內側撕取內皮層，再對內皮層進行染色處理。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明有如下特點1、適用于處理質地較為堅硬的禾草，而且檢測的準確率高。通過本發(fā)明的方法可以使禾草組織軟化和透明，從而提高了檢測的準確性；2、重復性好，檢測精度高。發(fā)明人曾利用本發(fā)明對甘肅的夏河、肅南、永靖、蘭州、慶陽等5個不同生態(tài)區(qū)域的3000余株幼苗、成株進行檢測，其效果令人滿意，而且檢測的重復性很好。通過已經進行的對比實驗，本發(fā)明的方法與直接撕取相比，其菌絲體更為清晰；3、方法簡單，易于掌握和操作；4、檢測方法快速方便，而且可以對早齡幼苗整株進行直接檢測。如果采用現(xiàn)有技術檢測，必須等幼苗生長5～6周時間后才能進行。本發(fā)明則可以對早期幼苗整株直接進行檢測，大大縮短了工作進程。此外，本發(fā)明的檢測速度也很快，根據(jù)實際測算，每小時可每人可檢測30個以上的植株。
具體實施例方式
以下提供本發(fā)明的實施例例1材料采自甘肅、青海、新疆和內蒙古的醉馬草種樣，經種子糊粉層染色檢測找出帶菌率為100％的種子，種植于16×6眼的塑料育種盤內，在15～30℃溫室條件下生長，取生長期在4周以內的單株幼苗為樣品。
方法將所取的早齡幼苗分蘗用5～15％的NaOH水溶液在室溫下浸泡3至5小時，然后將其直接置于玻片上，再用0.8％的乳酸苯胺藍溶液染色，將樣品輕壓，再用電熱盤或酒精火焰加熱數(shù)秒后，在光學顯微鏡下進行檢測。
結果2000個醉馬草早齡幼苗的葉鞘經本發(fā)明處理后，其內生真菌檢出率為98％。而使用現(xiàn)有技術，樣品極難以處理，經處理所得樣品檢測其內生真菌檢出率僅為12％。
例2材料采自甘肅、青海、新疆和內蒙古的醉馬草種樣，經種子糊粉層染色檢測找出帶菌率為100％的種子，種植于16×6眼的塑料育種盤內，在15～30℃溫室條件下生長，取生長期在5周齡的老齡幼株。
方法將所取的老齡幼株葉鞘用開水煮4～6分鐘，再沿葉鞘內側撕取內皮層，將撕取的內皮層置于玻片上，再用0.8％的乳酸苯胺藍溶液染色，再用電熱盤或酒精火焰加熱數(shù)秒后，在光學顯微鏡下進行檢測。
結果2000個醉馬草成株葉鞘經本發(fā)明處理后，其內生真菌檢出率為100％。而使用現(xiàn)有技術，樣品非常難處理，且經處理所得樣品進行檢測，其內生真菌檢出率僅為5％。
例3材料采自甘肅、青海、新疆和內蒙古的醉馬草種樣，經種子糊粉層染色檢測找出帶菌率為100％的種子，種植于16×6眼的塑料育種盤內，在15～30℃溫室條件下生長，取生長期在15月齡的成株。
方法將所取的成株葉鞘用開水煮5～8分鐘，再沿葉鞘內側撕取內皮層，將撕取的內皮層置于玻片上，用0.8％的乳酸苯胺藍溶液染色，再用電熱盤或酒精火焰加熱數(shù)秒后，在光學顯微鏡下進行檢測。
結果2000個醉馬草成株葉鞘經本發(fā)明處理后，其內生真菌檢出率為100％。而使用現(xiàn)有技術，樣品非常難處理，且經處理后所得樣品進行檢測，其內生真菌檢出率僅為20％。
權利要求
1.硬質禾草內生真菌檢測技術，將樣品用染色劑進行染色，再將樣品置于光鏡下進行檢測，或者將染色后的樣品稍加熱后再置于光鏡下進行檢測，其特征是首先將樣品用5～15％的NaOH水溶液浸泡3～5小時后，再進行染色處理。
2.禾草中內生真菌檢測技術，將樣品用染色劑進行染色，再將樣品置于光鏡下進行檢測，或者將染色后的樣品稍加熱后再置于光鏡下進行檢測，其特征是首先將樣品用沸水煮4～8分鐘，再沿葉鞘內側撕取內皮層，再對撕內皮層進行染色處理。
全文摘要
本發(fā)明涉檢測一種生長于植物體內的真菌的方法。本發(fā)明的第一種方法適用于幼苗，它是先將禾草樣品用5～15％的NaOH水溶液浸泡3～5小時后，再進行染色處理和檢測；本發(fā)明的第二種方法適用于成株，它是先將樣品葉鞘用沸水煮4～8分鐘，再沿葉鞘內側撕取內皮層，再對內皮層進行染色處理和檢測。本發(fā)明的方法適用于處理質地較為堅硬的禾草，而且檢測的準確率高，其檢測重復性好，檢測精度高，方法簡單、快速，易于掌握和操作。
文檔編號G01N21/29GK1661357SQ20041002594
公開日2005年8月31日 申請日期2004年2月25日 優(yōu)先權日2004年2月25日
發(fā)明者李春杰, 南志標 申請人:蘭州大學