草甘膦檢測(cè)微流控芯片、草甘膦抗原固定方法及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種草甘膦檢測(cè)微流控芯片、草甘膦抗原固定方法及檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]草甘膦(Glyphosate，GLY)作為除草劑，經(jīng)近年來許多研宄表明草甘膦對(duì)生物具有一定的毒性，草甘膦進(jìn)入環(huán)境會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生有害影響，引起水污染，植被破壞，并通過在食物中的殘留對(duì)人類健康構(gòu)成威脅，并在遺傳方面產(chǎn)生不良影響。因此我國(guó)2006年頒布的《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB 5749-2006)規(guī)定飲用水中草甘膦的含量不得超過
0.700mg/Lo《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法》(GB/T 5750— 2006)中草甘膦的檢測(cè)采用的是柱后衍生離子交換色譜法，在色譜柱后增加自動(dòng)衍生設(shè)備，操作繁瑣且不易掌握。
[0003]目前有關(guān)草甘膦殘留分析方法主要采用液相色譜和氣相色譜法，另外還有液-質(zhì)聯(lián)用、氣-質(zhì)聯(lián)用和離子色譜法等。但由于草甘膦極性強(qiáng)，易溶于水，難溶于大多數(shù)有機(jī)溶劑，沒有發(fā)色和突光基團(tuán)等特性，使得氣相色譜法常用的各種標(biāo)準(zhǔn)衍生技術(shù)的使用受到限制。利用色譜法進(jìn)行草甘膦殘留檢測(cè)實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜、難度大，無法滿足生產(chǎn)實(shí)踐中草甘膦快速檢測(cè)的需要。
[0004]中國(guó)專利200910247555.5公開了一種基于免疫反應(yīng)的生物檢測(cè)微流控芯片及其備做方法。該芯片以光學(xué)透明的聚二甲基硅氧烷為材料，由樣品通道層，閥門控制層及基片層構(gòu)成。芯片內(nèi)含樣品富集及免疫分析模塊，該模塊由一個(gè)或幾個(gè)納升體積的免疫色譜柱微分析室組成，每個(gè)分析室固定有抗體蛋白或抗原。該微流控芯片存在制備程序復(fù)雜，檢測(cè)需要復(fù)雜的信號(hào)采集模塊、微處理器及數(shù)據(jù)庫(kù)，檢測(cè)設(shè)備成本高昂，也使用了色譜分析方法，檢測(cè)程序復(fù)雜，難度大，檢測(cè)速度慢。
[0005]免疫分析法(Immunoassay, IA)是以抗原抗體特異性識(shí)別和結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)來獲得定性或定量結(jié)果的微量檢測(cè)技術(shù)。與傳統(tǒng)的微量檢測(cè)方法相比，具有特異性好、靈敏度高、分析容量大、成本低、方便快速、適于現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定等優(yōu)點(diǎn)。但是免疫檢驗(yàn)通常在96孔板上進(jìn)行，樣品和試劑消耗量大，且抗原-抗體的結(jié)合時(shí)間長(zhǎng)，這些不足限制了其進(jìn)一步的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種草甘膦檢測(cè)微流控芯片、草甘膦抗原固定方法及檢測(cè)方法，使微流控芯片能夠簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確檢測(cè)水中的草甘膦。
[0007]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的一種檢測(cè)草甘膦的微流控芯片，包括位于底部的基片和密封覆蓋于其上的蓋片，基片上設(shè)置有微流路，所述微流路包括衍生化通道和與其相連的免疫反應(yīng)檢測(cè)通道，免疫反應(yīng)檢測(cè)通道內(nèi)表面固定有草甘膦抗原，在衍生化通道的入口設(shè)置有水樣入口和衍生試劑入口，在免疫反應(yīng)檢測(cè)通道出口設(shè)置有廢液出口，在衍生化通道與免疫反應(yīng)檢測(cè)通道連接處附近設(shè)置有磷酸鹽緩沖液入口、草甘膦抗體溶液入口、Cy3熒光染料標(biāo)記二抗溶液入口和十二烷基磺酸鈉溶液入口。
[0008]作為優(yōu)選，所述基片和蓋片的材料為玻璃片，微流路采用光刻的方法刻出。
[0009]作為優(yōu)選，所述基片與蓋片采用熱鍵合技術(shù)鍵合。
[0010]作為優(yōu)選，所述衍生化通道設(shè)置成蛇形曲折通道。
[0011]作為優(yōu)選，所述免疫反應(yīng)檢測(cè)通道深40um，寬度為150um，長(zhǎng)度為35mm。
[0012]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的一種草甘膦抗原固定方法，應(yīng)用于權(quán)利要求1所述的草甘膦檢測(cè)微流控芯片，通過對(duì)微流控芯片的免疫反應(yīng)檢測(cè)通道內(nèi)表面進(jìn)行化學(xué)修飾引入活性基團(tuán)，再使免疫反應(yīng)檢測(cè)通道內(nèi)表面上的活性基團(tuán)與草甘膦抗原活性基團(tuán)結(jié)合，從而使草甘膦抗原固定在免疫反應(yīng)檢測(cè)通道的內(nèi)表面上。
[0013]作為優(yōu)選，所述免疫反應(yīng)檢測(cè)通道內(nèi)表面的化學(xué)修飾步驟如下:
[0014](I)用體積比為1:1甲醇和鹽酸的混合液在超聲波清洗機(jī)中超聲清洗微流控芯片30min,去離子水清洗后吹干；
[0015](2)將體積比為7:3的硫酸和雙氧水的混合液通入到芯片通道內(nèi)，靜置30min，使通道表面將產(chǎn)生羥基，反應(yīng)結(jié)束用去離子水沖洗，再用氮?dú)獯蹈尚酒?br>[0016](3)將體積比為1:9的3-氨丙基三乙氧基硅烷和丙酮的混合液通入到芯片通道內(nèi)，50°C反應(yīng)24h，使芯片內(nèi)表面氨基化，用去離子水清洗后60°C干燥2h，將含有過量戊二醛的磷酸緩沖液通入芯片通道內(nèi)中，4°C反應(yīng)lh，20°C反應(yīng)lh，反應(yīng)結(jié)束后用去離子水沖洗干凈。
[0017]作為優(yōu)選，所述使免疫反應(yīng)檢測(cè)通道內(nèi)表面上的活性基團(tuán)與草甘膦抗原活性基團(tuán)結(jié)合的步驟如下:
[0018](I)將草甘膦加入到7.5ml 0.1M的4-嗎啉乙磺酸緩沖液中，使溶液中草甘膦濃度為0.019mM ;同時(shí)將200mg牛血清白蛋白溶解到5ml 0.1M的4-嗎啉乙磺酸緩沖液中；將39mgl-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺用0.1M的4-嗎啉乙磺酸緩沖液配制成0.019mM溶液；將上述三種溶液混合后室溫下反應(yīng)2h，用分子截留量為6000-8000的Spectrapor I透析膜在4°C下持續(xù)透析24h ；
[0019](2)將250 μ L濃度為lmg/ml透析后的草甘膦-牛血清白蛋白溶液通入免疫反應(yīng)檢測(cè)通道，4°C下反應(yīng)24h，通入2mg/ml牛血清白蛋白溶液，靜置20min，磷酸鹽緩沖液清洗，
氮?dú)獯蹈伞?br>[0020]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的一種草甘膦檢測(cè)方法，采用權(quán)利要求1所述的微流控芯片檢測(cè)草甘膦，該檢測(cè)方法包括如下步驟:
[0021 ] (I)同時(shí)抽取水樣和衍生試劑琥珀酸酐，在衍生化通道中，使水樣中的草甘膦與衍生試劑琥珀酸發(fā)生反應(yīng)，從而對(duì)水樣中草甘膦進(jìn)行衍生；
[0022](2)將衍生后的水樣與草甘膦單克隆抗體泵入到芯片免疫反應(yīng)檢測(cè)通道，37°C條件下孵育15min，使水樣及免疫反應(yīng)檢測(cè)通道上固定的草甘膦競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合溶液中抗體結(jié)合位點(diǎn)；
[0023](3)泵入Cy3熒光染料標(biāo)記的二抗，37°C條件下孵育15min，抗體與二抗發(fā)生免疫反應(yīng)，形成草甘膦-抗體-二抗復(fù)合物；
[0024](4)用磷酸鹽緩沖液清洗芯片免疫反應(yīng)檢測(cè)通道，將沒有結(jié)合在芯片上的復(fù)合物沖出檢測(cè)通道，用光電倍增管檢測(cè)熒光讀數(shù)F，根據(jù)用不含草甘膦的去離子水空白對(duì)照測(cè)得的熒光值Fe和公式F' = (Fc-F)/Fe計(jì)算得到F'，通過該微流控芯片關(guān)于樣品中草甘膦濃度C與相對(duì)熒光強(qiáng)度F'的線性方程計(jì)算出水樣中的草甘膦濃度C。
[0025]作為優(yōu)選，將檢測(cè)后的微流控芯片用pHl.9濃度5%的十二烷基磺酸鈉溶液清洗，使抗體變性后脫離芯片上的草甘膦固定抗原，實(shí)現(xiàn)微流控芯片再生使用。
[0026]本發(fā)明一種草甘膦檢測(cè)微流控芯片、草甘膦抗原固定方法及檢測(cè)方法的有益效果是:
[0027](I)本發(fā)明中將免疫分析和微流控技術(shù)結(jié)合，利用了免疫分析法具有的特異性好、靈敏度高、分析容量大、成本低、方便快速、適于現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定等優(yōu)點(diǎn)，也利用了微流控芯片具有的分析速度快，工作效率高、試劑耗量少、系統(tǒng)高度集中、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)，不僅提高了檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性、抗原與抗體的反應(yīng)速度，也降低了樣品和試劑的消耗量，能夠簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確檢測(cè)水中的草甘膦。
[0028](2)采用玻璃片作為微流控芯片的材料，是由于玻璃片具有廉價(jià)、表面光滑、熒光背景低、性能穩(wěn)定等諸多優(yōu)點(diǎn)。微流路采用光刻的方法刻出，在于采用光刻的方法刻制方法簡(jiǎn)便，可以精確控制微流路的大小和深度，而且形狀整齊規(guī)則。
[0029](3)基片與蓋片采用熱鍵合技術(shù)鍵合，可以實(shí)現(xiàn)基片與蓋片的嚴(yán)密密封，保證微流路流動(dòng)的準(zhǔn)確有效性，并防止雜質(zhì)的帶入，避免影響檢測(cè)結(jié)果。
[0030](4)將衍生化通道設(shè)置成蛇形曲折通道，是為增加衍生試劑與草甘膦接觸時(shí)間，使水樣中的草甘膦能夠完全被衍生化，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。
[0031 ] (5)將免疫反應(yīng)檢測(cè)通道設(shè)置成深40um，寬度為150um，長(zhǎng)度為35mm，可以使草甘膦抗原充分的固定在免