一種嗜堿性粒細胞的特異性免疫識別方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及過敏性疾病診斷的技術領域，具體為一種嗜堿性粒細胞的特異性識別方法。
【背景技術】
[0002]變態(tài)反應性疾病發(fā)病率占世界總?cè)丝诘?0%以上，被世界衛(wèi)生組織列為21世紀的四大非感染性疾病之一。隨著工業(yè)經(jīng)濟的發(fā)展，生態(tài)環(huán)境的改變，近年來此類疾病日益增多，成為常見病、多發(fā)病，是我國健康及經(jīng)濟發(fā)展領域需要解決的重大問題。
[0003]有史以來，疾病的定義及診斷方案絕大多數(shù)都是由發(fā)達國家提出的。2011年何韶衡、張慧云在東京舉行的首屆中-日-韓三國過敏年度交流會上，在國內(nèi)外率先對沿用了近40年的過敏性疾病的定義進行了修正商榷，將原來的“過敏性疾病是一組由IgE介導的疾病”修改為“是一組由肥大細胞/嗜堿性粒細胞(MC/Bas)介導的疾病”。而IgE介導的過敏性疾病只是其中的一個亞型，從而修正了人們對過敏性疾病認識的偏差。這是因為過敏反應(速發(fā)型超敏反應)的根本問題是激活后的初始效應細胞一MC/Bas釋放炎癥性介質(zhì)，從而啟動炎癥的病理生理過程，導致臨床癥狀的出現(xiàn)?；谠小斑^敏性疾病是一組由IgE介導的疾病”的定義，國外一些專家人為的把那些非IgE介導的過敏性疾病下了個“類過敏反應”的定義，即“類過敏反應”臨床表現(xiàn)與過敏反應相同、治療方法相同，但是血液中的IgE水平不增高。使人們對過敏性疾病認識的偏差進一步加大。我們對過敏性疾病的新定義必將使人們重新認識此類疾病，將會大大提高過敏性疾病的預防和診治水平。
[0004]也是基于“過敏性疾病是一組由IgE介導的疾病”的定義，目前臨床上血清中過敏原特異性IgE水平的檢測幾乎成了過敏性疾病的唯一診斷方法，甚至有人錯誤的認為這項檢測是過敏性疾病診斷的“金標準”，使人們對過敏性疾病認識的偏差進一步加大，完全忘記了過敏性疾病診斷的“金標準”是過敏原特異性激發(fā)試驗這一客觀事實。由于特異性IgE檢測的臨床意義在于告訴IgE依賴性過敏患者對哪一種常見過敏原過敏，而對非IgE依賴性過敏反應如絕大多數(shù)藥物過敏反應、80%以上的食物過敏、大多數(shù)哮喘的患者、自然環(huán)境中的小分子如汽車尾氣、乙醇等物質(zhì)過敏無任何診斷意義，因此臨床上急需研宄出對過敏性疾病有定性診斷價值的方法，從而幫助醫(yī)生對藥物過敏還是藥物不良反應，食物過敏還是其它原因的腹瀉、過敏性哮喘還是內(nèi)源性哮喘等進行鑒別診斷。
[0005]過敏原特異性激發(fā)試驗分為體內(nèi)激發(fā)試驗和體外激發(fā)試驗兩種，前者是過敏性疾病診斷的“金標準”，但是有一定風險，甚至能誘發(fā)重度過敏反應，臨床上很少開展；后者(包括過敏原特異性肥大細胞激發(fā)試驗和過敏原特異性嗜堿性粒細胞激發(fā)試驗兩種)在臨床意義上雖然不如前者直接，但是無風險，因此獲得廣泛的認可。但是，人們經(jīng)過數(shù)十年的無數(shù)次努力，始終無法獲得可靠的體外激發(fā)試驗方法。多年來，作為肥大細胞脫顆粒的特異性標記物，組胺受到了極大的關注，但是令人遺憾的是組胺檢測系統(tǒng)不僅較昂貴、功能單一，而且較難獲得穩(wěn)定數(shù)據(jù)，目前在臨床上很難開展。此外，由于肥大細胞位于組織中，而除過敏性鼻炎患者的鼻腔灌洗液外，很難獲取過敏患者的肥大細胞進行激發(fā)試驗，所以根本無法用于臨床診斷。
[0006]過敏原特異性嗜堿性粒細胞激發(fā)試驗是目前唯一有潛力應用于過敏性疾病臨床檢測的激發(fā)試驗方法。不難理解，這個激發(fā)試驗方法有兩個基本要求，其一為嗜堿性粒細胞的特異性識別，其二為特異性的過敏原。但是令人遺憾的是到目前為止尚未有一種可靠的、重復性好的在全血中特異性識別嗜堿性粒細胞的免疫學方法，導致過敏原特異性嗜堿性粒細胞激發(fā)試驗無法開展。近十年來，人們發(fā)現(xiàn)CC-趨化因子受體3 (CCR3)，又名嗜酸性粒細胞趨化因子受體及CD193，穩(wěn)定表達于人嗜堿性粒細胞上，但是由于血液中僅有大約70%左右的CCR3表達于人嗜堿性粒細胞上，而其他30%表達于嗜酸性粒細胞，、血小板、Th2淋巴細胞上，所以單獨CCR3的表達是不能代表嗜堿性粒細胞的。⑶123(IL-3受體α鏈)表達陽性，HLA-DR陰性細胞能夠?qū)?0%左右的外周血嗜堿性粒細胞與其它細胞區(qū)分開來，但是也不能完全代表嗜堿性粒細胞。我們最近的研宄發(fā)現(xiàn)如果同時檢測⑶123、HLA-DR、CCR3，CCR3+⑶123+HLA-DR-細胞群98-100%是嗜堿性粒細胞，從而率先基本上解決了嗜堿性粒細胞的特異性免疫識別問題，為過敏原特異性嗜堿性粒細胞激發(fā)試驗打下了堅實基礎，為嗜堿性粒細胞的鑒定提供了方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明所解決的技術問題在于提供一種嗜堿性粒細胞的特異性識別方法，以解決上述【背景技術】中的問題。
[0008]本發(fā)明所解決的技術問題采用以下技術方案來實現(xiàn):一種嗜堿性粒細胞的特異性識別方法，其特征在于:包括如下步驟:
[0009]①首先按照9:1的比例，用9倍的超純水將試劑盒中的濃縮的紅細胞裂解液儲存液稀釋到工作狀態(tài)；同樣地用9倍的超純水將試劑盒中的濃縮的磷酸鹽緩沖液的儲存液稀釋到工作狀態(tài)；
[0010]②按順序?qū)⒃囼灅颖揪幪枺擞浐迷囼炈璧牧魇缴蠘庸埽?br>[0011]③在每個流式上樣管內(nèi)加入所需的抗人⑶123、抗人CCR3和抗人HLA-DR熒光標記流式抗體組合，如FITC標記的抗人⑶123、APC標記的抗人CCR3、APC/Cy7標記的抗人HLA-DR，用量為每人份三種抗體各5 μ L ;
[0012]④患者全血低速漩渦混勻后，用加樣槍吸取混合好的25 μ L至125 μ L全血加到標記好的流式管內(nèi)，漩渦振蕩器上低速漩渦混勻3?5s，室溫避光孵育15min ;
[0013]⑤孵育結(jié)束后，每個樣本管內(nèi)加入ImL的紅細胞裂解液，漩渦振蕩器上低速漩渦混勻3?5s，室溫避光孵育1min ；
[0014]⑥孵育結(jié)束后，1200rpm/min轉(zhuǎn)速離心6min，離心結(jié)束后，棄去上清液，加入ImL的PBS緩沖液，以同樣的速度離心，(離心結(jié)束取樣操作時，應避免劇烈晃動引起細胞沉淀懸浮);
[0015]⑦離心后，以同樣的方式去上清液，加入300 UL的PBS緩沖液，用流式細胞儀檢測；
[0016]⑧用不同流式細胞儀相應的分析軟件分析嗜堿性粒細胞的計數(shù)及平均熒光強度。
[0017]所述紅細胞裂解液由美國BD公司提供，如用其他公司的紅細胞裂解液請根據(jù)試劑說明書進行稀釋。
[0018]所述熒光標記流式抗體包括FITC、APC、APC/Cy7、PE、PE/Cy7或PerCP熒光標記的抗人CD 123、抗人CCR3和抗人HLA-DR抗體。
[0019]所述的抗體組合為任何熒光標記的抗人⑶123、抗人CCR3、抗人HLA-DR三種抗體組合。
[0020]所述的抗體組合為任何分子標記的抗人⑶123、抗人CCR3、抗人HLA-DR三種抗體組合。
[0021]與已公開技術相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點:
[0022](I)能將外周血98-100%的嗜堿性粒細胞與其他種類細胞分辨出來；
[0023](2)無需分離純化嗜堿性粒細胞；
[0024](3)每例樣本檢測僅需不超過100 μ L的全血；
[0025](4)本發(fā)明方法重復性好，誤差