生物材料及其制品的體外細胞毒性分級定量測定試劑盒的制作方法
【專利摘要】本實用新型涉及生物材料及其制品的體外細胞毒性分級定量測定試劑盒，包括試劑存放區(qū)和對照品存放區(qū)，所述試劑存放區(qū)內存放有裝有MTT無菌粉末或XTT無菌粉末的試劑瓶、裝有溶解MTT無菌粉末或XTT無菌粉末的溶液的試劑瓶、和裝有甲瓚溶解液的試劑瓶，或者試劑存放區(qū)內存放有裝有MTT或XTT無菌溶液的試劑瓶和裝有甲瓚溶解液的試劑瓶；所述對照品存放區(qū)存放有具明顯細胞毒性材料的陽性對照品或其獨立包裝、無細胞毒性或輕微細胞毒性材料的陰性對照品或其獨立包裝、和空白對照瓶。本實用新型的試劑盒使用非常方便，可以避免試驗過程中可能存在污染的風險，大大提高細胞毒性檢測的準確性和重復性。
【專利說明】
生物材料及其制品的體外細胞毒性分級定量測定試劑盒
技術領域
[0001] 本實用新型涉及生物學領域，特別是涉及生物材料及其制品的體外細胞毒性分級 定量測定試劑盒。
【背景技術】
[0002] 細胞毒性試驗是利用體外細胞培養(yǎng)的方法評價生物材料和醫(yī)療器械或浸提液潛 在的細胞毒性，是生物材料生物學評價體系中重要的測定指標之一，也是幾乎各種用途的 醫(yī)療器械和生物材料必須進行檢測的項目。細胞毒性試驗能在短期內測試生物材料對細胞 代謝功能的影響，可以快速篩選材料是否具有潛在的細胞毒性。
[0003] 細胞毒性試驗作為檢測生物材料毒性的手段，具有簡便、敏感性高、成本低、試驗 周期短等優(yōu)點，廣泛用于生物材料和醫(yī)療器械產(chǎn)品的生物相容性檢測和評價手段。對生物 材料細胞毒性的評價方法從觀察細胞的形態(tài)和數(shù)量變化，發(fā)展到對細胞的粘附、增殖、代謝 等方面的評價，以有活力的細胞數(shù)和細胞增殖能力作為評價生物材料細胞生物相容性的評 價方法。具體的試驗有中性紅攝取試驗、克隆形成試驗、MTT細胞毒性試驗和XTT細胞毒性試 驗等方法，其中以MTT和XTT細胞毒性試驗方法，由于可以定量測定材料的細胞毒性，因此更 為被大家接受并且應用也更為廣泛。
[0004] MTT和XTT細胞毒性試驗檢測原理為活細胞線粒體中琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT (3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide);或XTT(2，3-bis [2-methoxy-4-nitr0-5-sulfophenyI]-2H-tetrazolium-5-carboxyaniIine inner salt)]還原為水不溶性的藍紫色結晶甲臢(Formazan)并沉積在細胞中，而死細胞無此功 能。二甲基亞砜(DMSO)或異丙醇或吩嗪硫酸甲酯(PMS)能溶解細胞中的甲臢結晶，用酶標儀 在570nm波長處測定其光吸收值，在一定細胞數(shù)范圍內，結晶形成的量與細胞數(shù)成正比。根 據(jù)測得的吸光度值(0D值），來判斷活細胞數(shù)量，OD值越大，細胞活性越強，毒性越小。通過計 算細胞的增殖率，可以定量分級評價醫(yī)用材料及其制品的細胞毒性。也可以通過浸提液的 不同濃度稀釋情況下細胞的存活度計算IC 5Q(細胞活度抑制50%的濃度），評價生物材料及 其制品的細胞毒性。
[0005] 目前細胞毒性試驗采用的試劑都是有試驗人員自己分別進行配制，沒有配備陽性 和陰性對照品，因此使用不方便，并且試驗誤差較大，同一材料在不同實驗室間測定也會有 不同的結果。因此，需要規(guī)范統(tǒng)一的試劑盒可以大大提高檢測的準確性和重復性，并且使用 非常方便。

【發(fā)明內容】

[0006] 針對上述技術領域中的不足，本實用新型提供生物材料及其制品的體外細胞毒性 分級定量測定試劑盒。
[0007] 生物材料及其制品的體外細胞毒性分級定量測定試劑盒，其特征在于:包括試劑 存放區(qū)和對照品存放區(qū)，所述試劑存放區(qū)內存放有裝有MTT無菌粉末或XTT無菌粉末的試劑 瓶、裝有溶解MTT無菌粉末或XTT無菌粉末的溶液的試劑瓶、和裝有甲瓚溶解液的試劑瓶，或 者試劑存放區(qū)內存放有裝有MTT或XTT無菌溶液的試劑瓶和裝有甲瓚溶解液的試劑瓶;所述 對照品存放區(qū)存放有具明顯細胞毒性材料的陽性對照品或其獨立包裝、無細胞毒性或輕微 細胞毒性材料的陰性對照品或其獨立包裝、和空白對照瓶。
[0008] 所述試劑盒還包括樣品存放區(qū)，所述樣品存放區(qū)存放有用于浸提需檢測樣品的樣 品空瓶。
[0009] 所述試劑盒還包括移液管或帶刻度的注射器及其存放區(qū)。
[0010] 所述注射器為Iml-IOml-次性使用無菌注射器。
[0011] 所述陽性對照品區(qū)存放有至少一塊含有有機錫的聚氨酯或聚氯乙烯材料或者盛 裝有具有細胞毒性的無菌二甲基亞砜或無菌苯酚溶液的陽性對照試劑瓶，所述陰性對照品 為至少一塊無菌高密度聚乙烯材料。
[0012] 所述溶解MTT無菌粉末或XTT無菌粉末的溶液為PH7.4的無菌磷酸鹽緩沖液、無菌 生理鹽水或不含酚紅的MEM細胞培養(yǎng)液，所述溶液的濃度為lmg/ml或5mg/ml，所述甲瓚溶解 液為二甲基亞砜(DMSO)或異丙醇或吩嗪硫酸甲酯(PMS)。
[0013] 所述ΡΗ7·4的無菌磷酸鹽緩沖液的配方為8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HP〇4、 0.24g KH2PO4;調pH 7.4，定容1匕
[0014] 所述裝有MTT無菌粉末或XTT無菌粉末的試劑瓶有兩瓶，每瓶中MTT無菌粉末或XTT 無菌粉末的質量為5mg;所述裝有溶解MTT無菌粉末或XTT無菌粉末溶液的試劑瓶有兩瓶，每 瓶中溶解MTT無菌粉末或XTT無菌粉末的溶液的體積為Iml或5ml，所述裝有甲瓚溶解液的試 劑瓶有兩瓶，每瓶中甲瓚溶解液的體積為5ml異丙醇或7.5ml二甲基亞砜。
[0015] 所述空白對照瓶和樣品空瓶為容量為5ml-50ml的無菌玻璃瓶。
[0016]所述空白對照瓶一個，樣品空瓶5個。
[0017] 本實用新型的試劑盒設置有試劑及其存放區(qū)，對照品及其存放區(qū)，使將生物材料 及其制品的體外細胞毒性分級定量測定一致化并標準化，并且根據(jù)細胞毒性試驗過程需要 無菌的要求，采用了滅菌包裝的方式，使用非常方便，也可以避免試驗過程中可能存在污染 的風險，大大提高細胞毒性檢測的準確性和重復性。
【附圖說明】
[0018] 圖1本實用新型試劑盒平面布置圖，
[0019] 圖2本實用新型試劑盒立體圖，
[0020] 1 一試劑存放區(qū)，2-對照品存放區(qū)，3-樣品存放區(qū)，4 一試劑瓶A，5-試劑瓶B，6- 試劑瓶C，7-陽性對照品，8-陰性對照品，9 一空白對照瓶，10-樣品空瓶。
【具體實施方式】
[0021 ]下面結合附圖對本實用新型做進一步的詳細說明。
[0022]如圖所示，生物材料及其制品的體外細胞毒性分級定量測定試劑盒，包括試劑存 放區(qū)1、對照品存放區(qū)2和樣品存放區(qū)3。對于分區(qū)的大小和格式，可以不按附圖中的形式來 設計，只要能滿足存放區(qū)內存放空間需要就可以。
[0023]所述試劑存放區(qū)1內存放有裝有MTT無菌粉末或XTT無菌粉末的試劑瓶A4、裝有溶 解MTT無菌粉末或XTT無菌粉末的溶液的試劑瓶B5、和裝有甲瓚溶解液的試劑瓶C6;所述試 劑瓶A4有兩瓶，每瓶中MTT無菌粉末或XTT無菌粉末的質量為5mg;所述試劑瓶B有兩瓶，每瓶 中溶解MTT無菌粉末或XTT無菌粉末的溶液的體積為5ml或Iml，所述試劑瓶C有兩瓶，每瓶中 甲瓚溶解液的體積為5ml異丙醇或7.5ml二甲基亞砜。所述溶解MTT無菌粉末或XTT無菌粉末 的溶液為PH7.4的無菌磷酸鹽緩沖液、無菌生理鹽水或不含酚紅的MEM細胞培養(yǎng)液，其濃度 為lmg/ml或5mg/ml;所述甲瓚溶解液為二甲基亞砜(DMSO)或異丙醇或吩嗪硫酸甲酯(PMS); 所述PH7.4的無菌磷酸鹽緩沖液的配方為NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HP〇4 1.44g、KH2P〇4 0.248;調口!17.4，定容1匕
[0024]將試劑瓶A中的無菌粉末與試劑瓶B瓶中的溶液配制成無菌溶液裝在試劑瓶中也 可以，為防止配制時間過長，溶液變質，優(yōu)選將無菌粉末和溶解無菌粉末的溶液分別裝在兩 個試劑瓶中。
[0025]所述對照品存放區(qū)2存放有具明顯細胞毒性材料的陽性對照品7或其獨立包裝、無 細胞毒性或輕微細胞毒性材料的陰性對照品8或其獨立包裝、和空白對照瓶9。所述陽性對 照品7為至少一塊含有有機錫的聚氨酯或聚氯乙烯材料，或者盛裝在陽性對照試劑瓶內具 有細胞毒性的無菌二甲基亞砜或無菌苯酚溶液，或者帶包裝的至少一塊含有有機錫的聚氨 酯或聚氯乙烯材料，此后兩者為陽性對照品的獨立包裝;所述陰性對照品8為至少一塊無菌 高密度聚乙烯材料，或者帶包裝的至少一塊無菌高密度聚乙烯材料。
[0026] 所述樣品存放區(qū)3存放有用于浸提需檢測樣品的樣品空瓶10。所述空白對照瓶9和 樣品空瓶10為容量為5ml-50ml的無菌玻璃瓶。所述空白對照瓶9為一個，樣品空瓶10為五 個。
[0027] 樣品存放區(qū)3和樣品空瓶10可以設置，也可以不設置，樣品空瓶可以利用實驗室中 的任意無菌空瓶即可。
[0028] 所述試劑盒還包括移液管或帶刻度的注射器及其存放區(qū)。（未示出）
[0029] 所述注射器為Iml-IOml-次性使用無菌注射器。
[0030] 本實用新型的試劑盒設置有試劑及其存放區(qū)，對照品及其存放區(qū)，使將生物材料 及其制品的體外細胞毒性分級定量測定一致化并標準化，并且根據(jù)細胞毒性試驗過程需要 無菌的要求，采用了滅菌包裝的方式，使用非常方便，也可以避免試驗過程中可能存在污染 的風險，大大提高細胞毒性檢測的準確性和重復性。
[0031] 實施例1.
[0032] MTT 粉末：5mg
[0033] MTT 溶劑：5ml
[0034] 甲瓚溶解液(異丙醇）：5ml
[0035] 陽性對照:6cm2含有有機錫的聚氨酯。
[0036] 陰性對照:6cm2高密度聚乙烯。
[0037] 空白瓶：5ml-個。
[0038]浸提瓶：10ml 5個。
[0039] 5ml注射器：一個。
[0040] 實施例2.
[0041 ] MTT 粉末：5mg
[0042] MTT 溶劑：5ml
[0043] 甲瓚溶解液(異丙醇）：5ml
[0044] 陽性對照:6cm2含有有機錫的聚氯乙烯。
[0045] 陰性對照:6cm2高密度聚乙烯。
[0046] 空白瓶：5ml-個。
[0047] 浸提瓶：10ml 5個。
[0048] 5ml注射器：一個。
[0049] 實施例3.
[0050] MTT粉末：IOmg
[0051] MTT 溶劑：10ml
[0052] 甲瓚溶解液(異丙醇）：IOml
[0053]陽性對照A: 6cm2含有有機錫的聚氨酯。
[0054]陽性對照B: 12cm2含有低含量有機錫的聚氨酯。
[0055] 陰性對照:6cm2高密度聚乙烯。
[0056] 空白瓶：5ml-個。
[0057] 浸提瓶：10ml 10 個。
[0058] IOml 注射器：一個。
[0059] 實施例4.
[0060] MTT 溶液：5mg/5ml
[0061 ]甲瓚溶解液(DMSO) :7.5ml
[0062]陽性對照:6cm2含有有機錫的聚氨酯。
[0063] 陰性對照:6cm2高密度聚乙烯。
[0064] 空白瓶：5ml-個。
[0065] 浸提瓶:10ml 5個。
[0066] 實施例5.
[0067] XTT 粉末：5mg
[0068] XTT 溶劑：5ml
[0069] 甲瓚溶解液(吩嗪硫酸甲酯）：5ml
[0070] 陽性對照：DMSO 0.1ml。
[0071] 陰性對照:6cm2高密度聚乙烯。
[0072] 空白瓶：5ml-個。
[0073]浸提瓶：10ml 5個。
[0074] 5ml注射器：一個。
[0075]實驗例:效果評價
[0076]以實施例1為例應用情況如下；
[0077] 1、陰性、陽性對照和空白瓶:分別用注射器或移液管注入Iml和樣品浸提相同浸提 介質(含有牛血清的MEM培養(yǎng)基)并在相同溫度條件下(37°C，24小時)浸提，制成陰性對照浸 提液、陽性對照浸提液和空白對照液。樣品1:硅橡膠;樣品2:聚氨酯;樣品3:聚甲基丙烯酸 甲酯;樣品4:聚乙烯;樣品5:納米銀。樣品按照0.2克/ml比例，在37°C，24小時浸提。
[0078] 2、MTT溶液的配制：用注射器抽取MTT溶劑(5ml)溶解MTT粉末(5mg)，配制成lmg/ml 的MTT溶液。配制后即可使用。
[0079] 3將配制好的I X IO5AiL細胞懸液(可采用L929成纖維細胞)接種于96孔培養(yǎng)板，設 空白對照、陰性對照、陽性對照和供試材料組，每組各設至少6孔，每孔接種100μΙ細胞懸液。 [0080] 4、置⑶2培養(yǎng)箱(含體積分數(shù)5%的二氧化碳氣體，濕度大于90%，下同）37°C培養(yǎng) 24h后，棄去原培養(yǎng)液?？瞻讓φ战M加入新鮮細胞培養(yǎng)液，陰性對照組加入陰性對照品浸提 液，陽性對照組加入陽性對照品浸提液，供試材料組加入試驗樣品浸提液，每孔100μΙ，置 CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24h。
[0081 ] 于更換培養(yǎng)液后的24h，置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。每孔加入50μ1質量濃度為lmg/ mL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄去孔內液體，加入100μΙ甲瓚溶解液，置振蕩器上振蕩30min.
[0082] 5、在酶標儀測試波長570nm和參比630nm波長下測定吸光度，計算相對增殖率：
[0083]
[0084] XV1+1:
[0085] RGR--相對增殖率，％ ;
[0086] A--供試品組（陰性、陽性組)吸光度平均值；
[0087] Ao--空白對照組吸光度平均值。
[0088] 6、細胞毒性分級
[0089] 根據(jù)RGR按分級標準判定，陰性對照的反應應不大于1級，陽性對照組至少為3級反 應。如陰性對照組和陽性對照組反應不成立時應重新試驗。
[0090]細胞毒性反應分級 L〇〇92」7、試驗結采
[0093]陽性對照:相對增殖度9.5%，細胞毒性4級。
[0094]陰性對照:相對增殖度95%，細胞毒性1級。
[0095]樣品1:相對增殖度90.5%，細胞毒性1級。
[0096]樣品2:相對增殖度98%，細胞毒性1級。
[0097]樣品3:相對增殖度97%，細胞毒性1級。
[0098]樣品4:相對增殖度87%，細胞毒性1級。
[0099]樣品5:相對增殖度11%，細胞毒性4級。
[0100]以實施例3為例應用情況如下；
[0101] 1、陰性、陽性對照和空白瓶:分別注入Iml(陽性對照B加入2ml)和樣品浸提相同浸 提介質(含有牛血清的MEM培養(yǎng)基)并在相同溫度條件下(37°C，24小時)浸提，制成陰性對照 浸提液、陽性對照浸提液和空白對照液。樣品1:硅橡膠;樣品2:納米銀。樣品按照0.2克/ml 比例，在37°C，24小時浸提。陽性對照A用培養(yǎng)基稀釋成6%、3 %、1.5%和0.75 %，陽性對照B 稀釋成100 %、75 %、50 %和25 %的濃度。
[0102] 2、MTT溶液的配制：用注射器抽取MTT溶劑(5ml)溶解MTT粉末(5mg)，配制成lmg/ml 的MTT溶液。配制后即可使用。
[0103] 3、將配制好的IX IO5AiL細胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，設空白對照、陰性對照、陽 性對照和供試材料組，每組各設至少3孔，每孔接種100μΙ細胞懸液。
[0104] 4、置⑶2培養(yǎng)箱(含體積分數(shù)5%的二氧化碳氣體，濕度大于90%，下同）37°C培養(yǎng) 24h后，棄去原培養(yǎng)液?？瞻讓φ战M加入新鮮細胞培養(yǎng)液，陰性對照組加入陰性對照品浸提 液，陽性對照組加入陽性對照品浸提液，供試材料組加入試驗樣品浸提液，每孔100μΙ，置 CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24h。
[0105] 于更換培養(yǎng)液后的24h，置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。每孔加入50μ1質量濃度為lmg/ mL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄去孔內液體，加入100μΙ甲瓚溶解液，置振蕩器上振蕩30min.
[0106] 5、在酶標儀測試波長570nm和參比630nm波長下測定吸光度，計算存活率：
[0107]
[0108] 式中：
[0109] A5TOe--供試品組（陰性、陽性組)吸光度平均值；
[0110] A57Ob--空白對照組吸光度平均值。
[0111] 6、細胞毒性分級 LUl丨。」 （、訊誕拓禾
[0114]根據(jù)濃度一細胞存活率的關系曲線計算出檢驗樣品的IC5Q值。
[0115] 陽性對照A的IC5Q為3 %。
[0116] 陽性對照B的IC5Q為45%。
[0117] 樣品1的IC5q為425%，無細胞毒性。
[0118] 樣品2的IC5q為4%，重度細胞毒性。
【主權項】
1. 生物材料及其制品的體外細胞毒性分級定量測定試劑盒，其特征在于:包括試劑存 放區(qū)和對照品存放區(qū)，所述試劑存放區(qū)內存放有裝有MTT無菌粉末或XTT無菌粉末的試劑 瓶、裝有溶解MTT無菌粉末或XTT無菌粉末的溶液的試劑瓶、和裝有甲瓚溶解液的試劑瓶，或 者試劑存放區(qū)內存放有裝有MTT或XTT無菌溶液的試劑瓶和裝有甲瓚溶解液的試劑瓶;所述 對照品存放區(qū)存放有具明顯細胞毒性材料的陽性對照品或其獨立包裝、無細胞毒性或輕微 細胞毒性材料的陰性對照品或其獨立包裝、和空白對照瓶。2. 根據(jù)權利要求1所述的生物材料及其制品的體外細胞毒性分級定量測定試劑盒，其 特征在于:所述試劑盒還包括樣品存放區(qū)，所述樣品存放區(qū)存放有用于浸提需檢測樣品的 樣品空瓶。3. 根據(jù)權利要求1或2所述的生物材料及其制品的體外細胞毒性分級定量測定試劑盒， 其特征在于:所述試劑盒還包括移液管或帶刻度的注射器及其存放區(qū)。4. 根據(jù)權利要求3所述的生物材料及其制品的體外細胞毒性分級定量測定試劑盒，其 特征在于:所述注射器為-次性使用無菌注射器。5. 根據(jù)權利要求1或2所述的生物材料及其制品的體外細胞毒性分級定量測定試劑盒， 其特征在于:所述陽性對照品區(qū)存放有至少一塊含有有機錫的聚氨酯或聚氯乙烯材料或者 盛裝有具有細胞毒性的無菌二甲基亞砜或無菌苯酚溶液的陽性對照試劑瓶，所述陰性對照 品為至少一塊無菌高密度聚乙烯材料。6. 根據(jù)權利要求1或2所述的生物材料及其制品的體外細胞毒性分級定量測定試劑盒， 其特征在于:所述溶解MTT無菌粉末或XTT無菌粉末的溶液為pH7.4的無菌磷酸鹽緩沖液、無 菌生理鹽水或不含酚紅的MEM細胞培養(yǎng)液，所述溶液的濃度為lmg/ml或5mg/ml，所述甲瓚溶 解液為二甲基亞砜或異丙醇或吩嗪硫酸甲酯。7. 根據(jù)權利要求1或2所述的生物材料及其制品的體外細胞毒性分級定量測定試劑盒， 其特征在于:所述裝有MTT無菌粉末或XTT無菌粉末的試劑瓶有兩瓶，每瓶中MTT無菌粉末或 XTT無菌粉末的質量為5mg;所述裝有溶解MTT無菌粉末或XTT無菌粉末溶液的試劑瓶有兩 瓶，每瓶中溶解MTT無菌粉末或XTT無菌粉末的溶液的體積為lml或5ml，所述裝有甲瓚溶解 液的試劑瓶有兩瓶，每瓶中甲瓚溶解液的體積為5ml異丙醇或7.5ml二甲基亞砜。8. 根據(jù)權利要求1或2所述的生物材料及其制品的體外細胞毒性分級定量測定試劑盒， 其特征在于:所述空白對照瓶和樣品空瓶為容量為5ml-50ml的無菌玻璃瓶。9. 根據(jù)權利要求1或2所述的生物材料及其制品的體外細胞毒性分級定量測定試劑盒， 其特征在于:所述空白對照瓶一個，樣品空瓶5個。
【文檔編號】G01N33/52GK205426918SQ201620135601
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年2月23日
【發(fā)明人】張清
【申請人】張清