本發(fā)明涉及一種包含map30蛋白的脂質(zhì)體的制備及包載方法。
背景技術(shù)：
：map30即苦瓜ⅰ型核糖體失活蛋白，是苦瓜中相對(duì)分子質(zhì)量為30000的抗獲得性免疫缺陷綜合征病毒的蛋白質(zhì)，它屬于單鏈i型核糖體失活蛋白(ribosomeinhibitingprotein,rip)家族，具有抗病毒、抗腫瘤、抗菌等多種生物活性，近年已成為抗癌藥物研究的熱點(diǎn)。ⅰ型核糖體失活蛋白為單鏈蛋白，不能進(jìn)入正常細(xì)胞，map30是一個(gè)毒性較大的蛋白，在其未進(jìn)入細(xì)胞前就會(huì)對(duì)細(xì)胞包括正常細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性。上述問(wèn)題是在脂質(zhì)體的制備及包載過(guò)程中應(yīng)當(dāng)予以考慮并解決的問(wèn)題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種包含map30蛋白的脂質(zhì)體的制備及包載方法解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的ⅰ型核糖體失活蛋白為單鏈蛋白，不能進(jìn)入正常細(xì)胞，map30是一個(gè)毒性較大的蛋白，在其未進(jìn)入細(xì)胞前就會(huì)對(duì)細(xì)胞包括正常細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性的問(wèn)題。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是：一種包含map30的脂質(zhì)體的制備及包載方法，采用薄膜水化法制備，具體包括以下步驟：取10mg二棕櫚酰磷脂酰膽堿dppc、1mg膽固醇、1mg二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-甲氧基聚乙二醇2000dspe-mpeg2000溶于氯仿中，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成均勻的薄膜，真空過(guò)夜徹底揮發(fā)掉殘留的氯仿，加入1ml含蛋白的2mgml-1的pbs溶液，冰浴超聲20min使脂質(zhì)體膜脫落，在振蕩器上震蕩5min充分水化，形成濁液，然后將濁液轉(zhuǎn)移到ep管中，用探頭超聲15％的功率135w超聲30min，得到透明均一的藍(lán)色脂質(zhì)體懸液。進(jìn)一步地，用10kd的超濾管以12000g的轉(zhuǎn)速4℃超濾，每五分鐘取出吹打一次并補(bǔ)充pbs洗去游離蛋白，收集濾液以及脂質(zhì)體懸液，280紫外吸收測(cè)定濾液中的蛋白濃度以及加入的蛋白原液原始濃度，計(jì)算包封率：包封率=1-（濾液中蛋白含量-初始液蛋白含量）％。本發(fā)明的有益效果是：該種包含map30蛋白的脂質(zhì)體的制備及包載方法，采用薄膜水化法制備脂質(zhì)體并對(duì)map30蛋白進(jìn)行包載，工藝簡(jiǎn)單，條件溫和，重復(fù)性高，脂質(zhì)體的制備采用納米技術(shù)，將map30蛋白載入納米級(jí)別的脂質(zhì)體內(nèi)，脂質(zhì)體由二棕櫚酰磷脂酰膽堿、膽固醇、二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-甲氧基聚乙二醇2000dspe-mpeg2000組成；可以提高map30蛋白的溶解度和吸收或靶向性，脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，蛋白吸附容量大，脂質(zhì)體粒徑比較均勻，包封率高達(dá)78%。附圖說(shuō)明圖1是本發(fā)明實(shí)施例中脂質(zhì)體粒徑掃描示意圖。圖2是實(shí)施例中脂質(zhì)體粒徑分布示意圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例。實(shí)施例一種包含map30的脂質(zhì)體的制備及包載方法，采用薄膜水化法制備，具體包括以下步驟：取10mg二棕櫚酰磷脂酰膽堿dppc、1mg膽固醇、1mg二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-甲氧基聚乙二醇2000dspe-mpeg2000溶于氯仿中，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成均勻的薄膜，真空過(guò)夜徹底揮發(fā)掉殘留的氯仿，加入1ml含蛋白的2mgml-1的pbs溶液，冰浴超聲20min使脂質(zhì)體膜脫落，在振蕩器上震蕩5min充分水化，形成濁液，然后將濁液轉(zhuǎn)移到ep管中，用探頭超聲15％的功率135w超聲30min，得到透明均一的藍(lán)色脂質(zhì)體懸液。該種包含map30蛋白的脂質(zhì)體的制備及包載方法，采用薄膜水化法制備，工藝簡(jiǎn)單、條件溫和、重復(fù)性高，蛋白質(zhì)吸附容量大，脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。實(shí)施例可以提高map30蛋白的溶解度和吸收或靶向性。為了提高ⅰ型核糖體失活蛋白膜的通透性；對(duì)其采用納米級(jí)的脂質(zhì)體包裹能夠使得該蛋白在胞外不產(chǎn)生細(xì)胞毒性，順利地導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，降低map30蛋白的胞外毒性，增加其胞內(nèi)毒性，增加map30的腫瘤細(xì)胞靶向作用，待轉(zhuǎn)運(yùn)至腫瘤細(xì)胞胞內(nèi)后再產(chǎn)生細(xì)胞毒性，從而高效地殺傷靶細(xì)胞。用10kd的超濾管以12000g的轉(zhuǎn)速4℃超濾，每五分鐘取出吹打一次并補(bǔ)充pbs洗去游離蛋白，收集濾液以及脂質(zhì)體懸液，280紫外吸收測(cè)定濾液中的蛋白濃度以及加入的蛋白原液原始濃度，計(jì)算包封率：包封率=1-（濾液中蛋白含量-初始液蛋白含量）％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果及表征脂質(zhì)體制備結(jié)果及表征如圖1和圖2中，透射電鏡結(jié)果顯示所制備的脂質(zhì)體粒徑比較均一，動(dòng)態(tài)光散射結(jié)果表明脂質(zhì)體的水合粒徑約為132.6nm。map30蛋白包封率測(cè)定將脂質(zhì)體進(jìn)行map30蛋白的包載，通過(guò)測(cè)定超濾后濾液中的蛋白計(jì)算包封率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，包封率約為78％。表1測(cè)定超濾后濾液中的蛋白計(jì)算包封率的結(jié)果原液濾液a2800.9870.0737體積（ml）12.95包封率=（1-0.0737×2.95/0.987）×100％=78%。實(shí)施例的保存條件為：液態(tài)，-20℃保存。技術(shù)特征：技術(shù)總結(jié)本發(fā)明提供一種包含MAP30的脂質(zhì)體的制備及包載方法，采用薄膜水化法制備，具體包括以下步驟：取10?mg二棕櫚酰磷脂酰膽堿DPPC、1?mg膽固醇、1?mg二硬脂酰磷脂酰乙酰胺?甲氧基聚乙二醇2000DSPE?mPEG2000溶于氯仿中，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成均勻的薄膜，真空過(guò)夜徹底揮發(fā)掉殘留的氯仿，加入1ml含蛋白的2mg?ml?1的PBS溶液，冰浴超聲20min使脂質(zhì)體膜脫落，在振蕩器上震蕩5min充分水化，形成濁液，然后將濁液轉(zhuǎn)移到EP管中，用探頭超聲15％的功率135W超聲30min，得到透明均一的藍(lán)色脂質(zhì)體懸液。本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單，條件溫和，重復(fù)性高，脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，蛋白吸附容量大，脂質(zhì)體粒徑比較均勻，包封率高達(dá)78%。技術(shù)研發(fā)人員：張培影;韓從輝;呂茜;郝林;劉穎受保護(hù)的技術(shù)使用者：徐州市中心醫(yī)院技術(shù)研發(fā)日：2017.02.16技術(shù)公布日：2017.09.29