專利名稱：應(yīng)用LCM技術(shù)構(gòu)建細胞差異表達cDNA文庫及大鼠睪丸特異基因RSD-6的克隆和生物學(xué)功能的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為利用激光捕獲顯微切割技術(shù)構(gòu)建大鼠不同生精細胞差異表達cDNA文庫的新方法及利用此方法發(fā)現(xiàn)的大鼠圓形精子細胞特異表達的RSD-6基因/蛋白，涉及生物醫(yī)學(xué)高技術(shù)中新方法、新基因、新蛋白的開發(fā)與應(yīng)用領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
哺乳動物精子發(fā)生是一個高度有序的細胞分化過程。在短短的時間內(nèi)，精子發(fā)生經(jīng)歷了有絲分裂和減數(shù)分裂，從一個精原細胞到四個成熟精子，從二倍體細胞到單倍體細胞，從圓形精子細胞變形成為長形精子。在這一分化過程中的每一特定階段均有細胞特異性和發(fā)育階段特異性的結(jié)構(gòu)形成，而眾多階段特異性基因的轉(zhuǎn)錄和表達則是形成生精細胞特異性結(jié)構(gòu)及發(fā)揮細胞特定功能的基礎(chǔ)。研究精子發(fā)生過程基因的轉(zhuǎn)錄和表達，闡明精子發(fā)生的分子機制，對人類的生殖健康、避孕疫苗的研制以及男性不育的防治均有十分重要的意義。
大約半個世紀以前，Leblond和Clermont通過對曲細精管截面上不同發(fā)育階段的精細胞頂體進行Schiff酸性染色，描述了曲細精管上皮細胞的周期性變化。為了解釋這種同一細胞群的顯著形態(tài)學(xué)差異，誕生了細胞內(nèi)差異基因表達的概念。隨之而來的問題是，如何研究某一種特定的隨曲細精管上皮周期性時空變化而改變的細胞的基因表達？如何從復(fù)雜的異源性組織中獲得足夠數(shù)量和純度的特定細胞來進行進一步研究？這種組織異質(zhì)性一直困擾著精子發(fā)生不同階段的差異表達基因的研究。
本實驗方法是在世界上首次將激光捕獲顯微切割(Laser Capture Microdissection，LCM)技術(shù)與抑制性消減雜交(Suppressive Subtractive Hybridization，SSH)相結(jié)合并成功地應(yīng)用到精子發(fā)生的研究領(lǐng)域。
發(fā)明目的通過激光捕獲顯微切割技術(shù)在冰凍組織切片上分離獲得了大鼠的初級精母細胞和圓形精子細胞。在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了基于激光捕獲顯微切割技術(shù)的大鼠初級精母細胞和圓形精子細胞的雙向抑制性消減cDNA文庫。以篩選、克隆、鑒定精子發(fā)生過程中階段特異性表達基因，深入研究其在精子發(fā)生中的作用，以期更加深入地理解精子發(fā)生的機理，探索其用于控制生育及防治不育的前景。
克隆在大鼠精子發(fā)生過程中起作用的特異基因RSD-6，表達其編碼蛋白質(zhì)，闡明其生理生化功能，為深入了解精子細胞的發(fā)生機理以及基因表達調(diào)控規(guī)律奠定基礎(chǔ)。內(nèi)容與要求將激光捕獲顯微切割技術(shù)與抑制性消減雜交相結(jié)合建立了構(gòu)建細胞特異表達cDNA文庫的新方法。應(yīng)用斑點雜交、分子克隆、cDNA文庫篩選、基因組信息學(xué)原理、DNA序列測定技術(shù)、Northern印跡雜交、RT-PCR、基因表達與蛋白純化技術(shù)等，克隆鑒定編碼RSD-6蛋白的新基因全長cDNA，通過Northern印跡雜交和RT-PCR進行組織表達譜和睪丸發(fā)育階段表達分析，分析RSD-6基因在睪丸中的表達。
該方法及發(fā)現(xiàn)的新基因/蛋白質(zhì)達到的技術(shù)指標為
1.成功地利用激光捕獲顯微切割技術(shù)捕獲和分離了大鼠初級精母細胞和圓形精子細胞。
2.在此基礎(chǔ)上從分離的兩種細胞中提取RNA，合成雙鏈cDNA。
3.成功構(gòu)建了大鼠初級精母細胞和圓形精子細胞的雙向cDNA消減文庫。
4.所構(gòu)建文庫的滴度高達8.3×109/ml，重組質(zhì)?？寺￡栃月蕿?1.67％，插入片段大小分布于250bp～1.7kb，主要集中于500bp～1kb。
5.對772個陽性克隆進行核苷酸序列測定，共產(chǎn)生了610個質(zhì)量滿意的ESTs，總測序成功率達到79.02％。其中從初級精母細胞和圓形精子細胞中分別獲得403和207個質(zhì)量滿意的EST。
6.將所發(fā)現(xiàn)的新EST提交NCBI，共獲得298個GenBank注冊號。
7.自圓形精子細胞差異表達的EST中獲得一全長1185bp的cDNA，命名為RSD-6，相應(yīng)編碼蛋白質(zhì)有254個氨基酸，GenBank接收號為AF2711558.RSD-6基因編碼蛋白質(zhì)的預(yù)測分子量為60Kd。搜索Prosite數(shù)據(jù)庫后發(fā)現(xiàn)它具有2個糖基化位點、1個PKC磷酸化位點、17個CK2磷酸化位點。
9.該基因的表達具有組織特異性和階段特異性，即該基因僅在大鼠睪丸組織有表達，表現(xiàn)為出生后30天內(nèi)的大鼠睪丸中未見RSD-6基因明顯表達，45天開始出現(xiàn)表達，60天表達量明顯升高，一直維持到120天。此結(jié)果表明，RSD-6基因的表達具有組織特異性和發(fā)育階段性特異性。
10.pEGFP-RSD-6真核表達載體轉(zhuǎn)染CHO細胞后48小時，在熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)綠色熒光出現(xiàn)于細胞的胞漿內(nèi)，表明RSD-6基因編碼的蛋白質(zhì)表達于CHO細胞的胞漿。
11.該基因及其編碼蛋白可能與圓形精子細胞到長形成熟精子的變態(tài)過程相關(guān)。可用于精子發(fā)育不全等不孕癥相關(guān)疾病的基因診斷和基因治療，對于抗生育領(lǐng)域以及新藥的設(shè)計與開發(fā)具有潛在應(yīng)用價值。


圖1.大鼠初級精母細胞的捕獲A.捕獲前；B.捕獲時膜與細胞粘合；C.細胞轉(zhuǎn)移后的空缺；D.捕獲的初級精母細胞圖2.大鼠圓形精子細胞的捕獲A.捕獲前；B.捕獲時膜與細胞粘合；C.細胞轉(zhuǎn)移后的空缺；D.捕獲的圓形精子細胞圖3.大鼠初級精母細胞和圓形精子細胞雙鏈cDNA瓊脂糖凝膠電泳MDL2000(TaKaRa)；1大鼠初級精母細胞雙鏈cDNA；2大鼠圓形精子細胞雙鏈cDNA圖4.消減雜交后兩次PCR擴增產(chǎn)物的分析MDL2000 Marker(TaKaRa)；1兩輪消減后樣品的初次PCR；2未消減對照樣品的初次PCR3試劑盒所提供的陽性對照的初次PCR；4兩輪消減后樣品的二次PCR；5未消減對照樣品的二次PCR；6試劑盒所提供的陽性對照的二次PCR圖5.pGEM-T Easy Vector轉(zhuǎn)化重組子的鑒定MDL2000 Marker(TaKaRa)
圖6.SSH克隆的斑點雜交分析根據(jù)抑制性消減的結(jié)果使用32P標記的正向和反向消減cDNA探針分別與初級精母細胞(A)和圓形精子細胞(B)差異表達的克隆雜交。使用管家基因G3PDH為內(nèi)對照，校正探針量。
圖7.大鼠RSD-6基因的組織表達譜Northern Blot分析1心2睪丸3腦4腸5脾6腎7肝8骨骼肌圖8.RSD-6基因在不同發(fā)育階段睪丸組織中的表達Northern Blot分析1-8分別為7、10、20、30、45、60、80和120天大鼠睪丸組織總RNA圖9.GST-RSD-6融合蛋白在大腸桿菌中的表達1誘導(dǎo)的DGEX4T3-RSD-6-BL21(DF3)菌體裂解液沉淀；2誘導(dǎo)的pGEX4T3-RSD-6-BL21(DE3)菌體裂解液上清；3誘導(dǎo)的pGEX4T3-RSD-6-BL21(DE3)菌體蛋白；4未誘導(dǎo)的pGEX4T3-RSD-6-BL21(DE3)菌體蛋白實施例1.應(yīng)用激光捕獲顯微分離技術(shù)分離大鼠初級精母細胞和圓形精子細胞將大鼠新鮮睪丸標本在15min之內(nèi)包埋在OCT中，液氮中凍存。現(xiàn)場進行組織包埋。制作睪丸冰凍切片，切片蘇木精染色。使用LCM儀分離細胞將染色并用二甲苯脫水干燥的切片放在LM200主機平臺上，把CapSureTM帽放置在切片上。調(diào)節(jié)好焦距和照明，通過監(jiān)視器中的數(shù)碼圖像進行操作。激光束直徑≈7.5μm，激光束能量在25mW-80mW。在捕獲細胞的過程中，根據(jù)捕獲效果和觀察需要調(diào)節(jié)以上各參數(shù)。根據(jù)初級精母細胞和圓形精子細胞在顯微鏡下的形態(tài)特點進行確認。分別捕獲初級精母細胞利圓形精子細胞(圖1，圖2)。一張轉(zhuǎn)移膜上捕獲約2000-3000個細胞后，使用轉(zhuǎn)帽把手取下CapSure帽，把它按緊在裝有Trizol的0.5ml Eppendorf管上。將Eppendorf管反復(fù)顛倒2分鐘，將膜上的細胞消化下來。
2.大鼠初級精母細胞和圓形精子細胞總RNA的提取利用TRIzol總RNA提取試劑分離LCM捕獲的大鼠初級精母細胞和圓形精子細胞總RNA。用DNase去除DNA，重新抽提RNA。
3.DNA第一鏈的合成及LD-PCR利用CloneTech的SMARTTMPCR cDNA Synthesis Kit合成cDNA第一鏈，并LD PCR擴增cDNA(圖3)。
4.PCR產(chǎn)物的純化使用CHROMA SPIN+TE-400Column層析純化SMARTTMPCR cDNA Synthesis Kit合成的大鼠初級精母細胞和圓形精子細胞cDNA。
5.大鼠初級精母細胞和圓形精子細胞抑制性消減cDNA文庫的構(gòu)建雙鏈cDNA的Rsa I酶切及純化。正向和反向?qū)嶒灧?tester)cDNA接頭的連接，分別用大鼠初級精母細胞和圓形精子細胞作為tester進行正向和反向消減。用G3PDH引物進行接頭連接效率的分析。第一次雜交，68℃孵育6～12小時。隨后立即進行第二次雜交反應(yīng)。用1.0μl第二次雜交產(chǎn)物進行第一次PCR擴增。取第一次PCR產(chǎn)物3μl進行第二次PCR擴增(圖4)。利用PCR擴增的方法通過比較已知cDNA在消減前后豐度的差別來進行消減效率的分析。這里所檢測的已知cDNA是管家基因G3PDH。消減后PCR產(chǎn)物的克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，所用質(zhì)粒載體為pGEM-T Easy vector，Promega；轉(zhuǎn)化重組子的鑒定；克隆片段的PCR擴增，隨機挑取多個克隆，利用T Easy載體克隆位點兩端的通用引物直接進行PCR擴增，觀察是否有片段插入以及插入片段的大小(圖5)。
6.cDNA文庫質(zhì)量鑒定利用適量的LB液體培養(yǎng)基將轉(zhuǎn)化后形成的菌落從瓊脂培養(yǎng)板上洗脫下來，合并后即為所構(gòu)建的人初級精母細胞和圓形精子細胞cDNA消減文庫。加入甘油至終濃度為20％，分裝于多個1ml微量離心管中，取部分進行文庫質(zhì)量的鑒定，其余-70℃凍存。
7.抑制性消減雜交克隆的斑點雜交分析cDNA克隆插入片段的PCR擴增及雜交膜的制備，點膜量為1μl變性樣本。雜交探針的制備，使用Promega的Prime-a-GeneLabeling System，對雜交探針進行50μCi[α-32p]dCTP同位素標記。72℃預(yù)雜交40-60分鐘。將探針混合液加入每個雜交管中，注意不要將探針直接加到膜上。72℃雜交過夜。將洗過的雜交膜于X-ray底片盒中壓片，置-70℃放射自顯影48小時。暗室內(nèi)將曝光48小時的X-ray底片先后浸于顯影液2分鐘，定影液20分鐘，常規(guī)顯像。于Molecular Dynamics公司的Storm680掃描儀中掃描，分析膜上各點雜交信號(圖6)。
8.大鼠初級精母細胞和圓形精子細胞差異表達基因的生物信息學(xué)分析根據(jù)抑制性消減雜交和Dot-Blotting的結(jié)果，從大鼠初級精母和圓形精子雙向消減cDNA文庫中選擇有顯著表達差異(表達強度相差3倍以上)克隆進行DNA序列自動分析，將測序結(jié)果進行同源性比較、EST拼接等相應(yīng)的生物信息學(xué)分析，并參考互聯(lián)網(wǎng)上相關(guān)的公共數(shù)據(jù)庫進行相應(yīng)的比較和分析，初步探討大鼠精子發(fā)生過程中差異表達基因的作用和意義。
9.大鼠睪丸cDNA文庫的篩選選取以上所獲取的差異表達的EST，進行放射性標記并用作探針篩選大鼠睪丸λgt10 5’-stretch cDNA文庫(Clontech Laboratories公司)。斑點雜交法共篩選了1×106個克隆，采用噬菌體載體通用引物擴增陽性克隆的插入片段，并將產(chǎn)物克隆入Promega公司的pGEM-T Easy載體，進行序列測定。應(yīng)用BLAST軟件查詢GenBank數(shù)據(jù)庫進行最大同源性比較，通過DNASIS軟件分析所測序列的酶切位點及開放閱讀框等，利用Prosite，SignalP及PC gene軟件進行編碼蛋白質(zhì)序列分析。
10.RNA的制備和Northern印跡分析將成年Wistar雄性大鼠引頸處死，于無菌條件下分別快速切取睪丸、肌肉、腸、肝、脾、腦、心、腎等8種組織，各約100mg，采用Trizol試劑(Life Technologies)提取總RNA。同樣分別提取出生7天、10天、20天、30天、45天、60天、80天和120天的大鼠睪丸組織總RNA。
以隨機引物法標記的RSD-6 cDNA全長序列為探針，進行Northern Blot雜交分析。同時，以哺乳動物組織恒定表達的β-actin基因為對照，監(jiān)測所用RNA質(zhì)量及Northern Blot結(jié)果(圖7，圖8)。
11.RSD-6基因原核表達載體的構(gòu)建為構(gòu)建原核表達質(zhì)粒，以RSD-6第132-153位堿基序列為5’端引物，以878-895位相對應(yīng)的堿基序列為3’端引物，擴增RSD-6閱讀框全長，并在5’及3’端分別加上BamHI和XhoI酶切位點。用以上引物對以前環(huán)化的pBK-CMV-RSD-6質(zhì)粒進行PCR擴增，擴增片段長度為762bp。將擴增后的PCR產(chǎn)物首先克隆到pGEM-T載體上，再篩選陽性重組體。經(jīng)BamHI、XhoI雙酶切后，回收插入片段，然后將其定向克隆到同樣雙酶切處理的pGEX-4T-3載體上，重組質(zhì)粒命名為pGEX4T3-RSD-6。
12.重組蛋白的大量表達將重組質(zhì)粒pGEX4T3-RSD-6轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)宿主菌中。挑轉(zhuǎn)化了表達質(zhì)粒的單菌落分別加入含100ml新鮮LB(含Amp50μg/ml)的500ml錐形瓶中。37℃，200rpm，培養(yǎng)過夜；將上述培養(yǎng)物按1/25(16ml)的比例轉(zhuǎn)移接入四個含400ml LB(含Amp50μg/ml)的2000ml錐形瓶；37℃，250rpm，培養(yǎng)1-1.5小時，使菌液的OD600值達到0.6-0.8；加入終濃度為0.2mmol/L'TG誘導(dǎo)表達3小時。培養(yǎng)物用250ml離心杯收集，離心，5000rpm，15分鐘，棄凈上清培養(yǎng)基。將誘導(dǎo)后菌體沉淀以1×PBS液25ml/400ml菌液重懸，冰浴下超聲破碎細胞(工作12秒/冷卻25秒/200-400W)25×4次。12,000rpm離心20分鐘。取少量進行SDS-PAGE鑒定(圖9)。
13.RSD-6的真核表達利用以下引物擴增RSD-6-PBK-CMV質(zhì)粒5’引物5’-CCCTCGAGAACATGGCGAAGGAAGATATC-3’；3’引物5’-CGGGATCCCGCATCATGAGTTCATCTGG-3’。PCR產(chǎn)物電泳后回收擴增片段。將回收后的PCR擴增產(chǎn)物與pGEM-T Easy載體室溫連接2-3小時后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞。挑6個菌落，培養(yǎng)過夜后，常規(guī)提質(zhì)粒，行BamH I/Xho I雙酶切，37℃3小時，電泳分析酶切片段大小。將經(jīng)鑒定陽性的RSD-6-T easy vector質(zhì)粒與真核表達載體pEGFP-N1分別用BamH I/XhoI雙酶切，37℃5小時。取酶切回收的適量目的DNA與同樣處理的pEGFP-N1質(zhì)?；旌?，使片段與載體摩爾比達5-8∶1。16℃連接16-20h后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞。挑6個菌落，培養(yǎng)過夜后，各樣保留0.5ml菌種，余菌常規(guī)提質(zhì)粒并行BamH I/Xho I雙酶切，37℃3小時，電泳分析酶切片段大小。保留BamH I/Xho I雙酶切鑒定為陽性的菌種。將陽性菌種轉(zhuǎn)接至15ml新鮮LB培養(yǎng)液(Kana+)，37℃，200rpm，培養(yǎng)過夜。采用GIBCO公司質(zhì)粒提取試劑盒提取pEGFP-N1-RSD-6質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染時細胞應(yīng)處于對數(shù)生長期。轉(zhuǎn)染前一天傳代。35mm2的培養(yǎng)皿接種1-3×105個細胞。待細胞長至50-80％匯合時，進行轉(zhuǎn)染。取提取的pEGFP-N1及RSD-6-pEGFP-N1質(zhì)粒1-5μl(1μg)加到含無血清培養(yǎng)液及1μl FuGENE轉(zhuǎn)染試劑的離心管內(nèi)，輕彈混勻。室溫孵育15-30min。分別向待轉(zhuǎn)染細胞中加入上述混合試劑，輕輕旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿以混勻。37℃，5％CO2孵育箱中培養(yǎng)。
全長RSD-6 cDNA序列及其編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列1G2 GCA CCA GCC ACT CCG ACT GAA ACT ACC AAC TCC AAA CCT AAG GAA47 TCA ATT ACT GAA AAT TTC ATT CCG GTG AAA ATT GGA AAT ATC TCA92 TCC CCA GTT GGC ACT GTT TCT TTA ATT GAT TTT TCC AGT AAC ATG1 M137GCG AAG GAA GAT ATC CTC TTA GCC ACC ATT GAC GCA GAA GAC AAA2 A K E D I L L A T I D A E D K182GAA GTC AAA CCC ACT ACT GAG CTC TCT GAA ACA CAG GAG GAC AGC17 E V K P T T E L S E T Q E D S227TCT GCC AAT GAT GAG GAT ACC TCT GTA CCT CCA GAT GAG AAT ACT32 S A N D E D T S V P P D E N T272GAA ACT GAT GTT AGT TCT TCA ACT AGC TCT GAC GTT CCT GAT GAT47 E T D V S S S T S S D V P D D317GGA GCT GTC CAG GTC ACT GAC TCC TTT AGT CCT GAG TCT GAC GTC62 G A V Q V T D S F S P E S D V362CCT CCC TCT ACT GAA AAG GAG GTC ACC ACC ATT CCA GAC AAC GTT77 P P S T E K E V T T I P D N V407GCA GAA GAC AAA GTA ACT AAG ATT GAC TTG ATT GTT TCA GAA GAT92 A E D K V T K I D L I V S E D452AGG CCC AAA ACT GTG ACT AAA TTA AGT GAC TCC GAA GAA GAA AAA107 R P K T V T K L S D S E E E K497TTT ATC ACT GTT TTT GAA CTC ACT AAC TCA GCT GAA AAA GCC AAA122 F I T V F E L T N S A E K A K542GAT AAC CCA GAA GAT CCT TTA ACT GAT GAG GAG CCA GCT GAC GGA137 D N P E D P L T D E E P A D G587GTT AAT ACT TGG GTG GAA AAA GAT GCT GCA AAT GAG GCA GAG TCT152 V N T W V E K D A A N E A E S632CAT GCT GTT CTG CTT ACC GCC GTT GAA TCT AGG TAC GAC TTC GTT167 H A V L L T A V E S R Y D F V677GTC ACT GCC TCC GAA ACT AAC AGC GTC GTC GTG GAG GAA CCA CAC182 V T A S E T N S V V V E E P H722GTT GAC ACA AAG AAT TCG CCT GAA AAG GAT GCA GCA GAG TCT GTC197 V D T K N S P E K D A A E S V
767 ACT AAT GTC ACA GAG GAA TTT CCT TCA GTG ACC TCT GTA GTA GAA212T N V T E E F P S V T S V V E812 CAG AGT GGG AAC AAG GAG GAC TTA TCT ACC AAT GAC TCC GGT ATC227Q S G N K E D L S T N D S G I857 TTT AAA CTG CTC AAA GAA GAA CCA GAT GAA CTC ATG ATG TAA AAC242F K L L K E E P D E L M M *902 CAG TAA CAT AAG GGA AGC CAC ATA GAC ACA CAT GAT GGG TTA AGA947 GAT AGT CAT AAT ATC TAA GAA GTT ACT CAT CAA GAA AAA TCT TTA992 AAA GAA AAA AAA TAC TGT GAG CAT TTA AGA TCT TAA ACG TTG ACT1037 ATT GTA CTC TTC TTA GAC AGT TGG TTA GCA ATT CAA GGA CAC ATA1082 TCT TCA TTC TTT TCT GAT ACA GAC TTT TCA AGT GGG TCT GTT GTC1127 ACT GGG CTG ATT CTT CTC AAT AAA TTA TTC TGG CAG CAA CTG AAA1172 AAA AAA AAA AAA AA
權(quán)利要求
1.本發(fā)明涉及構(gòu)建一個全新的大鼠不同生精細胞差異表達cDNA文庫的方法以及應(yīng)用此方法發(fā)現(xiàn)的大鼠圓形精子細胞特異表達的基因/蛋白，RSD-6基因/蛋白，包括其互補脫氧核糖核酸(cDNA)序列，編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列。其特征在于RSD-6的cDNA全長為1185bp，相應(yīng)編碼蛋白質(zhì)有254個氨基酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述之構(gòu)建cDNA文庫的方法，其特征在于可以構(gòu)建單一細胞cDNA文庫。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述之RSD-6基因/蛋白，其特征在于該基因編碼的蛋白質(zhì)序列無典型跨膜結(jié)構(gòu)。它具有2個糖基化位點、1個PKC磷酸化位點、17個CK2磷酸化位點。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、3所述之RSD-6基因/蛋白，其特征在于該基因的表達具有組織特異性和發(fā)育階段特異性，即該基因僅在大鼠睪丸組織有表達，且出生后30天內(nèi)的大鼠睪丸RSD-6基因未見表達，45天開始出現(xiàn)表達，60天表達量明顯升高，一直維持到120天。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、3、4所述之RSD-6基因/蛋白，其特征在于該基因編碼的蛋白質(zhì)表達于CHO細胞的胞漿。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、3、4、5所述之RSD-6基因/蛋白，其特征在于該基因及其編碼蛋白與圓形精子細胞到長形成熟精子的變態(tài)過程相關(guān)?？捎糜谙嚓P(guān)疾病的基因診斷和基因治療，還可用于抗生育領(lǐng)域以及新藥的設(shè)計與開發(fā)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一個全新的構(gòu)建大鼠不同生精細胞差異表達cDNA文庫的方法以及應(yīng)用此方法發(fā)現(xiàn)的大鼠圓形精子細胞特異表達的基因/蛋白，RSD－6基因/蛋白。包括互補脫氧核糖核酸(cDNA)序列，編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列。它具有2個糖基化位點、1個PKC磷酸化位點、17個CK2磷酸化位點。RSD－6基因的表達具有組織特異性和發(fā)育階段特異性，即該基因僅在大鼠睪丸組織有表達，且出生后30天內(nèi)的大鼠睪丸RSD－6基因未見表達，45天開始出現(xiàn)表達，60天表達量明顯升高，一直維持到120天。該基因編碼的蛋白表達于CHO細胞的胞漿。該基因及其編碼蛋白與圓形精子細胞到長形成熟精子的變態(tài)過程相關(guān)。可用于相關(guān)疾病的基因診斷和基因治療，還可用于抗生育領(lǐng)域以及新藥的設(shè)計與開發(fā)。
文檔編號C07H21/00GK1508143SQ0215730
公開日2004年6月30日 申請日期2002年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月19日
發(fā)明者梁剛, 繆時英, 王琳芳, 宗書東, 張曉東, 茍大為, 王魯京, 梁 剛 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所