一種免疫細(xì)胞庫(kù)構(gòu)建方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種建立細(xì)胞庫(kù)的構(gòu)建方法及應(yīng)用，特別涉及一種免疫細(xì)胞庫(kù)的構(gòu)建方法及應(yīng)用。
技術(shù)背景
[0002]外科手術(shù)、化療、放療是治療惡性腫瘤的常用手段，這些治療方法有一定的侵襲性，會(huì)損傷正常細(xì)胞，毒副作用大。免疫細(xì)胞治療腫瘤，能特異性殺傷腫瘤細(xì)胞，而不會(huì)損傷正常細(xì)胞，毒副作用小，因而被稱為抗腫瘤治療的第四種方法。
[0003]免疫細(xì)胞治療腫瘤的程序是，首先采集腫瘤患者靜脈血，送到細(xì)胞工廠，分離靜脈血中的免疫細(xì)胞，加入免疫細(xì)胞培養(yǎng)液，以及重組人白細(xì)胞介素2、r干擾素，CD3單克隆抗體等細(xì)胞因子激活免疫細(xì)胞，放置于C02培養(yǎng)箱中(或者生物反應(yīng)器)培養(yǎng)，免疫細(xì)胞開始增殖，2-3周后，免疫細(xì)胞可增殖數(shù)百倍到一千倍，免疫細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的能力也大大增強(qiáng)，殺傷性免疫細(xì)胞⑶3+⑶56+雙陽(yáng)性細(xì)胞比例由1%?2%上升到30%以上，最高可以達(dá)到50%，最后收集免疫細(xì)胞，通過(guò)一系列嚴(yán)格的檢測(cè)后，將擴(kuò)增的免疫細(xì)胞回輸給腫瘤患者，免疫細(xì)胞在腫瘤患者體內(nèi)發(fā)揮殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。
[0004]2010年，美國(guó)FDA批準(zhǔn)了世界上第一個(gè)免疫細(xì)胞治療前列腺癌的藥物，經(jīng)過(guò)512例的臨床試驗(yàn)，可以使前列腺癌患者生存期延長(zhǎng)4個(gè)月。國(guó)內(nèi)很多醫(yī)院也開展免疫細(xì)胞治療腫瘤的臨床研究，廣西醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院報(bào)道，采用⑶3單克隆抗體、白細(xì)胞介素2等激活的免疫細(xì)胞，治療23例小細(xì)胞肺癌，有效率78%，1年生存率82%，明顯高于對(duì)照組的有效率35%，1年生存率47%。
[0005]但是，現(xiàn)有的免疫細(xì)胞治療腫瘤的制備程序存在缺陷，因?yàn)椋委熌[瘤的免疫細(xì)胞來(lái)自腫瘤患者，腫瘤患者的免疫細(xì)胞功能受損，殺傷腫瘤細(xì)胞能力低下，盡管采用CD3單克隆抗體、白細(xì)胞介素2等細(xì)胞因子激活，免疫細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的能力獲得增強(qiáng)，但是依然低于健康人免疫細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的能力?？茖W(xué)研究也證明這一點(diǎn)。有學(xué)者比較了腫瘤患者和健康人靜脈血免疫細(xì)胞，經(jīng)過(guò)CD3單克隆抗體、r干擾素、白細(xì)胞介素2等細(xì)胞因子激活后，第14天，腫瘤患者的免疫細(xì)胞擴(kuò)增95倍，低于健康人145倍；腫瘤患者免疫細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞株K562的能力是44%，低于健康人的62%。這說(shuō)明，現(xiàn)有的免疫細(xì)胞治療的程序并不是最優(yōu)的方案。
[0006]為了克服免疫細(xì)胞治療腫瘤過(guò)程中，免疫細(xì)胞來(lái)自腫瘤病人殺傷腫瘤細(xì)胞功能低下的缺點(diǎn)；因此，在健康狀態(tài)下，將高質(zhì)量的免疫細(xì)胞儲(chǔ)存起來(lái)，建立免疫細(xì)胞庫(kù)，待將來(lái)患腫瘤時(shí)用于自體免疫細(xì)胞治療，是一種可行的方法。
[0007]目前，建立免疫細(xì)胞庫(kù)的方法有2種，一是采用淋巴細(xì)胞分離液提取靜脈血中的免疫細(xì)胞，其原理是淋巴細(xì)胞分離液的比重是1.077，靜脈血中的紅細(xì)胞比重大于1.077，免疫細(xì)胞(單個(gè)核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞)的比重低于1.077，所以，通過(guò)離心，離心機(jī)轉(zhuǎn)速為每分鐘1800-2000轉(zhuǎn)，時(shí)間20分鐘，紅細(xì)胞會(huì)沉淀，免疫細(xì)胞會(huì)浮在淋巴細(xì)胞分離液面上，這樣就把免疫細(xì)胞分離出來(lái)。這種方法的缺點(diǎn)是，(1)免疫細(xì)胞回收率低，低于80% ；(2)離心轉(zhuǎn)速每分鐘高達(dá)1800-2000轉(zhuǎn)，對(duì)免疫細(xì)胞有損傷。
[0008]另外一種方法是，采用血細(xì)胞分離機(jī)免疫細(xì)胞。這種方法的缺點(diǎn)是，1.血細(xì)胞分離機(jī)及其耗材價(jià)格昂貴，單采一次免疫細(xì)胞成本高達(dá)2000元；2.單采免疫細(xì)胞需要給健康人輸入大劑量抗凝劑(1000mL以上)，有相當(dāng)大的副作用，不適合60歲以上的老人，以及14歲以下的兒童；3.單采免疫細(xì)胞耗時(shí)長(zhǎng)，大約2小時(shí)以上，1個(gè)工作日只能采集2個(gè)病人或者健康人，不適合大量人群使用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]為了克服免疫細(xì)胞建庫(kù)中，現(xiàn)有的分離免疫細(xì)胞方法的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種6%羥乙基淀粉生理鹽水溶液分離免疫細(xì)胞建庫(kù)的方法及應(yīng)用，6%羥乙基淀粉生理鹽水溶液是臨床常用藥品，用于失血病人補(bǔ)充血容量，羥乙基淀粉與靜脈血混勻后，羥乙基淀粉中和紅細(xì)胞膜負(fù)電荷，紅細(xì)胞聚集，沉淀，免疫細(xì)胞不會(huì)沉淀，從而分離出免疫細(xì)胞。
[0010]本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下:
[0011](1)采集健康人靜脈血50-100mL，肝素抗凝，取其中靜脈血5mL，檢測(cè)乙型肝炎病毒表面抗原、丙型肝炎病毒抗體、艾滋病病毒抗體、梅毒螺旋體特異性抗體、厭氧菌培養(yǎng)、需氧菌培養(yǎng)、血細(xì)胞三分類檢測(cè)、免疫細(xì)胞⑶3、⑶4、⑶56、⑶8檢測(cè)。
[0012](2)步驟⑴所獲得的靜脈血，按照質(zhì)量/體積比1: 1/4的比例，加入1/4體積的生理鹽水，充分混勻。
[0013](3)步驟⑵所獲得的生理鹽水稀釋的靜脈血，按照質(zhì)量/體積比1: 1/4?1/5的比例，加入1/4?1/5體積的6%羥乙基淀粉生理鹽水溶液，充分混勻。
[0014](4)步驟(3)所獲得的含羥乙基淀粉的靜脈血稀釋液，置4°C離心，離心機(jī)轉(zhuǎn)速為700?800轉(zhuǎn)/分鐘，時(shí)間為8?10分鐘。靜脈血稀釋液分2層，下層沉淀是紅細(xì)胞，上層是血漿，血漿層中含有大量的免疫細(xì)胞，收集上層。
[0015](5)步驟(4)所獲得的免疫細(xì)胞血漿，再離心，離心機(jī)轉(zhuǎn)速為1000?1300轉(zhuǎn)/分鐘，時(shí)間10?15分鐘，免疫細(xì)胞沉淀，棄上清，即獲得免疫細(xì)胞。
[0016](6)步驟(5)獲得免疫細(xì)胞中，加入冷凍保護(hù)劑，經(jīng)過(guò)程序降溫，降溫速率為-1°C?-3°c /分鐘，溫度降至-80°c?-90°c后，置于液氮中冷凍保存，并建立可供檢索的免疫細(xì)胞信息檔案，即構(gòu)建人免疫細(xì)胞庫(kù)。
[0017]其中，冷凍保護(hù)劑是含10% (體積百分比)二甲基亞砜免疫細(xì)胞培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基是由90 %的(體積百分比)無(wú)血清免疫細(xì)胞培養(yǎng)基和10 % (體積百分比)10 %白蛋白構(gòu)成。
[0018]以上全過(guò)程均在無(wú)菌環(huán)境中進(jìn)行操作。
[0019]本發(fā)明所獲得的免疫細(xì)胞，解凍后，免疫細(xì)胞活力達(dá)到90 %以上，按照免疫細(xì)胞濃度0.5?lX106/mL，接種于塑料培養(yǎng)袋，用無(wú)血清免疫細(xì)胞培養(yǎng)基，加入白細(xì)胞介素2、r干擾素、⑶3單克隆抗體，10%白蛋白，置37°C，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，免疫細(xì)胞開始擴(kuò)增，每培養(yǎng)3?4天檢測(cè)免疫細(xì)胞數(shù)量，添加新鮮免疫細(xì)胞培養(yǎng)基，使免疫細(xì)胞終濃度0.5?1 X 106/mL, 20天后，免疫細(xì)胞擴(kuò)增800?1000倍，在原始免疫細(xì)胞接種10X 106情況下，可收集高達(dá)1 X 101°免疫細(xì)胞，用于臨床治療腫瘤。
[0020]本發(fā)明所述的一種免疫細(xì)胞庫(kù)構(gòu)建方法，可以從健康人靜脈血中獲得免疫細(xì)胞，建立免疫細(xì)胞儲(chǔ)存庫(kù)，根據(jù)本發(fā)明的方法，儲(chǔ)存于庫(kù)內(nèi)的免疫細(xì)胞，可以經(jīng)過(guò)激活、擴(kuò)增、獲得大量具有強(qiáng)大殺傷腫瘤細(xì)胞的能力，用于治療自身腫瘤。并且，能夠長(zhǎng)時(shí)間保存而不喪失活性，操作簡(jiǎn)便，建庫(kù)成本低，具有應(yīng)用前景。
【具體實(shí)施方式】
[0021]以下實(shí)施例中，所用的原料或者試劑除特別說(shuō)明外，均為市售可得。
[0022]實(shí)施例1
[0023]免疫細(xì)胞分離:
[0024](1)采集健康人靜脈血50-100mL，肝素抗凝，取其中靜脈血5mL，檢測(cè)乙型肝炎病毒表面抗原、丙型肝炎病毒抗體、艾滋病病毒抗體、梅毒螺旋體特異性抗體、厭氧菌培養(yǎng)、需氧菌培養(yǎng)、血細(xì)胞三分類檢測(cè)、免疫細(xì)胞⑶3、⑶4、⑶56、⑶8檢測(cè)。
[0025](2)步驟⑴所獲得的靜脈血，按照質(zhì)量/體積比1: 1/4的比例，加入1/4體積的生理鹽水，充分混勻。
[0026](3)步驟(2)所獲得的稀釋靜脈血，按照質(zhì)量/體積比1: 1/4?1/5的比例，加入1/4?1/5體積的6%的羥乙基淀粉生理鹽水溶液，充分混勻。
[0027](4)步驟(3)所獲得的含羥乙基淀粉的靜脈血稀釋液，置4°C離心，