專利名稱：Atrp法構(gòu)建以pgma為骨架的陽(yáng)離子基因載體的制作方法
ATRP法構(gòu)建以PGMA為骨架的陽(yáng)離子基因載體本發(fā)明屬于非病毒基因載體技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ATRP法構(gòu)建一系列以PGMA(聚甲基丙烯酸縮水甘油酯)為骨架，具有高的基因轉(zhuǎn)染效率低毒的陽(yáng)離子基因載體?；蛑委煼椒橄忍煨赃z傳疾病和嚴(yán)重后天獲得性疾病的治療提供了一條富有前景的新途徑。基因治療是一種將外源基因?qū)肽康募?xì)胞并有效表達(dá)，從而達(dá)到治病目的的治療方法。DNA分子通常以帶負(fù)電的疏松狀態(tài)存在，體積較大，滿負(fù)電荷與細(xì)胞表面之間存在排斥作用，難于進(jìn)入細(xì)胞；另外，血液及細(xì)胞內(nèi)存在大量的水解酶尤其是核酸酶，能將裸DNA分子破壞，因此單獨(dú)使用DNA轉(zhuǎn)染時(shí)，效率較低。為了使DNA有效轉(zhuǎn)染，需要借助物 理方法或使用基因載體輔助DNA轉(zhuǎn)染。物理方法需要使用專門的設(shè)備，不能進(jìn)行全身性使用，并且會(huì)對(duì)組織和細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p害，采用基因載體法有望克服物理方法的缺陷。應(yīng)用于基因治療的載體主要分為病毒載體(viral vector)和非病毒載體(non-viral vector)。病毒載體主要為逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒及單純皰疫病毒，其優(yōu)點(diǎn)是轉(zhuǎn)染率高，缺點(diǎn)是缺乏安全性，可能引起致癌作用與不希望的自身免疫反應(yīng)(unexpected immune response)和白細(xì)胞的病毒變化,甚至可能造成病人多器官衰竭導(dǎo)致死亡。此外病毒載體還會(huì)引起插入突變的現(xiàn)象，可能導(dǎo)致宿主細(xì)胞的惡行轉(zhuǎn)化，而且病毒載體攜帶DNA的能力有限，不利于大規(guī)模的生產(chǎn)。由于它的上述弱點(diǎn)，目前科學(xué)界已經(jīng)研究重心轉(zhuǎn)向非病毒載體技術(shù)的研究與開發(fā)。與病毒性載體相比，非病毒載體安全性高，并且具有低免疫原性、能夠攜帶大量DNA分子、容易大批量生產(chǎn)及費(fèi)用低廉等優(yōu)點(diǎn)，是一個(gè)有潛力的替代路線，故人們愈來(lái)愈重視人工合成的非病毒載體的研究。陽(yáng)離子聚合物是目前研究最廣泛的人工合成非病毒載體。陽(yáng)離子聚合物能夠自發(fā)與帶負(fù)電荷的基因通過電荷相互作用，可形成帶正電荷納米級(jí)的復(fù)合體(complex),從而協(xié)助基因穿過帶負(fù)電的細(xì)胞膜。此外，陽(yáng)離子聚合物載體也能夠保護(hù)質(zhì)粒，避免被核酸酶降解，加速基因的細(xì)胞轉(zhuǎn)染。近年來(lái)，隨著活性/可控自由聚合(living/controlled radicalpolymerization, LRP)研究的快速發(fā)展,LRP技術(shù)在制備具有新穎特定功能的生物高分子材料中也得到了巨大發(fā)展。LRP集活性可控聚合與自由基聚合的優(yōu)點(diǎn)為一身，不但可得到相對(duì)分子量分布極窄、相對(duì)分子量可控、結(jié)構(gòu)明晰的聞分子，而且可聚合的單體多，反應(yīng)條件溫和易控制。所以，LRP技術(shù)具有極高的實(shí)用價(jià)值，受到了高分子化學(xué)家們的重視。迄今為止，已有原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(atom transfer radical polymerization, ATRP)、穩(wěn)定自由基氮氧游離基調(diào)控(nitroxide mediated free radical polymerization, NMRP)體系和可逆加成-裂解鏈轉(zhuǎn)移聚合(reversible addition-fragmentation chain transfer,RAFT)等LRP體系問世。其中，ATRP近幾年得到了迅速發(fā)展并有著重要應(yīng)用價(jià)值。其所用引發(fā)劑一般為鹵代烷烴，基本原理是通過一交替的“活化-去活”可逆反應(yīng)使體系中游離基濃度極低，迫使不可逆終止反應(yīng)降低到最低程度，而鏈增長(zhǎng)反應(yīng)仍可進(jìn)行，從而實(shí)現(xiàn)“活性”聚合。ATRP反應(yīng)溫度適中，適用單體范圍廣，甚至可以在少量氧存在下進(jìn)行，對(duì)高分子材料的分子設(shè)計(jì)不需復(fù)雜的合成路線，是現(xiàn)有NMRP、RAFT等其它活性聚合方法無(wú)法比擬的，因此可以說ATRP技術(shù)的出現(xiàn)開辟了活性聚合的新領(lǐng)域。隨著高分子科學(xué)、醫(yī)學(xué)、生物學(xué)以及工程學(xué)等多門學(xué)科的相互交融、相互滲透和迅速發(fā)展，高分子基因載體材料進(jìn)入一個(gè)快速發(fā)展的時(shí)期。目前，文獻(xiàn)中報(bào)道一系列非病毒陽(yáng)離子聚合物載體，包 括聚-L-賴氨酸(poly (L-Iysine)，PLL),聚乙二胺樹枝狀聚合物(poly (amidoamine)，PAMAM)、聚甲基丙烯酸N, N- 二甲氨基乙酯(poly(2-dimethylaminoethyl methacrylate), PDMAEMA)> 聚乙烯亞胺(polyethylenimine, PEI)等。其中PEI具有較高的轉(zhuǎn)染效率,是陽(yáng)離子非病毒載體中公認(rèn)的“金標(biāo)”。但是上述陽(yáng)離子聚合物仍具有相當(dāng)高的毒性，大大限制了它們的應(yīng)用。這樣，開發(fā)低毒而高效陽(yáng)離子聚合物是研究非病毒基因載體的核心內(nèi)容。目前較為流行的方案是在陽(yáng)離子聚合物中插入生物相容的成份，最常見的是聚乙二醇(PEG)。另一種常見的思路是多糖陽(yáng)離子化，包括殼聚糖(chitosan)、環(huán)糊精(cyclodextrin)、葡聚糖(dextran)等。但是上述報(bào)道的非病毒載體的性能(比如安全性和轉(zhuǎn)染效率)與實(shí)際應(yīng)用的要求還有相當(dāng)大的距離。近幾年研究者致力于ATRP理論和應(yīng)用的研究工作，在ATRP合成生物材料以及ATRP技術(shù)的生物材料應(yīng)用方面開展了廣泛的研究，取得了一定的研究成果。對(duì)多種單體(包括DMAEMA、PEGEEMA, PEGMA以及GMA)的ATRP進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，促進(jìn)了活性可控聚合在醫(yī)用生物高分子中的應(yīng)用。陽(yáng)離子基因載體與DNA通過電荷作用將DNA包裹成納米顆粒，這樣就減小了 DNA和細(xì)胞表面的排斥。同時(shí)陽(yáng)離子基因載體可以保護(hù)DNA防止核酸酶的分解，這樣有利于提高在細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率?，F(xiàn)在常用陽(yáng)離子基因載體有聚乙烯亞胺(PEI)，聚類氨酸(PLL)，聚乙二醇(PEG)等，其中PEI是目前應(yīng)用最廣泛的基因載體，由于它的高的轉(zhuǎn)染效率在陽(yáng)離子基因載體中PEI被作為黃金標(biāo)準(zhǔn)。但是對(duì)于大多數(shù)具有高轉(zhuǎn)染效率的基因載體往往具有較大的毒性。而成功的基因載體不僅要有高的轉(zhuǎn)染效率同時(shí)要具有低的毒性。而目前大多數(shù)陽(yáng)離子基因載體不僅轉(zhuǎn)染效率不高，毒性也很大。對(duì)于非病毒基因載體轉(zhuǎn)染效率的提高和毒性的降低，將在臨床上應(yīng)用有巨大的意義，最普遍的方法是通過引入非離子親水基團(tuán)，來(lái)屏蔽陽(yáng)離子聚合物毒性。最近，有研究發(fā)現(xiàn)環(huán)氧族PGMA可以與胺族開環(huán)反應(yīng)，并且合成的PGEA陽(yáng)離子基因載體通過它在不同細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率相當(dāng)于枝化PEI (25KD)甚至還高。通過一系列的轉(zhuǎn)染和毒性試驗(yàn)表明了 PGEA系列作為具有高轉(zhuǎn)染效率和低毒性，安全的基因載體對(duì)與將來(lái)臨床上基因治療具有深遠(yuǎn)的意義。綜上所述，盡管在利用活性可控自由基聚合法制備基因載體方面已經(jīng)做了很多工作，但是在技術(shù)方面還有以下問題需要解決I、在制備高性能陽(yáng)離子基因載體時(shí)，隨著單體不斷的接枝到PGMA骨架上，陽(yáng)離子基因載體的分子量隨之增大，細(xì)胞內(nèi)吞作用增大，轉(zhuǎn)染效率增加，但是細(xì)胞的毒性也隨之增大，如何最大限度的降低基因載體的毒性成為需要解決的問題。2、在制備高性能陽(yáng)離子基因載體時(shí)，接枝不同單體，可以得到不同性能的陽(yáng)離子聚合物，但是不同單體的質(zhì)子化能力不同，導(dǎo)致載體的轉(zhuǎn)染效率高低不同，如何篩選出具有高效高性能的單體是需要考慮的問題。
3、在制備高性能陽(yáng)離子基因載體時(shí)，接枝相同的單體，在不同的細(xì)胞包括癌細(xì)胞和普通細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染高低不同，如何提高在確定細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率是需要研究的問題。本發(fā)明的目的是提供一種活性可控自由基聚合法(ATRP法)構(gòu)建的以PGMA (聚甲基丙烯酸縮水甘油酯)為骨架的，其中包括線性PGEA、PGAP1、PGAP2、P( ED4^W PGEAJ^wpgeapeg的生物可還原高效陽(yáng)離子基因載體。該陽(yáng)離子基因載體分子量可控，分布窄、可剪切、毒性低，轉(zhuǎn)染效率高，高效無(wú)毒的特點(diǎn)使其具備了投入臨床試驗(yàn)的可能。所述的線性的以PGEA為骨架的陽(yáng)離子基因載體的制備方法為I)0-60°C無(wú)氧條件下,將O. lg-0. 2g五甲基二乙烯三胺、5g_10g四氫呋喃、6g_12gGMA、0. 08g-0. 26g配體、O. 033g-0. 15g Cufc混合，各組分添加順序?yàn)橄葘MA溶于四氫呋喃，然后加入五甲基二乙烯三胺，再加入配體，最后加入CuBr引發(fā)活性可控自由基聚合，或者先將GMA溶于四氫呋喃，然后加入五甲基二乙烯三胺，再加入CuBr，最后加入配體引發(fā)活性可控自由基聚合；聚合反應(yīng)時(shí)間為l_9h,反應(yīng)完成后加入水或者甲醇,或者暴露在空氣中，使引發(fā)體系失活和終止聚合，然后用乙醚或者甲醇沉淀直到形貌變?yōu)楣腆w，放入真空干·燥箱中除去乙醚或者甲醇，所得產(chǎn)物為線性PGMA ；所述的配體為2，2-聯(lián)吡啶(BPY)、1，1,4, 7, 10，10-六甲基三乙烯四胺(HMTETA)、五甲基二乙烯三胺(PMDTETA)、4，4-聯(lián)吡啶中的一種或幾種；2)0_60°C無(wú)氧條件下，將O. 2g-0. 5g步驟I)得到的線性PGMA溶于4g_10g四氫呋喃或N-N-二甲基甲酰胺中，加入2g-4g醇胺和lg_2g三乙胺，開環(huán)反應(yīng)72-168h ;然后用乙醚沉淀直到產(chǎn)物形貌為固體，放入真空干燥箱中除去乙醚；然后將產(chǎn)物溶于水中，加水量與產(chǎn)物的比例為100-300 ml/g ;產(chǎn)物溶解后放入截留分子量為2500-4500MW的透析袋中，在去離子水中透析3-6h ;最后將透析袋中的產(chǎn)物冷凍干燥直至除去所有水分即得到線性的以PGEA為骨架的陽(yáng)離子基因載體。步驟2)所述的醇胺為乙醇胺(EA)、2-氨基-I-丙醇(API )、3-氨基-I-丙醇(AP2 )、N-N- 二甲基乙二胺(DED )、胱胺中的一種或幾種。所述的梳狀的以PGEA為骨架的陽(yáng)離子基因載體的制備方法為I. 0_60°C無(wú)氧條件下，將O. 05g_0. 2g五甲基二乙烯三胺、5g_10g四氫呋喃、6g-12g GMA、0. 08g-0. 26g 配體、0. 033g-0. 15g CuBr 混合，各組分添加順序?yàn)橄葘?GMA溶于四氫呋喃，然后加入五甲基二乙烯三胺，再加入配體，最后加入CuBr引發(fā)活性可控自由基聚合，或者先將GMA溶于四氫呋喃，然后加入五甲基二乙烯三胺，再加入CuBr，最后加入配體引發(fā)活性可控自由基聚合；聚合反應(yīng)時(shí)間為l_9h，反應(yīng)完成后加入水或者甲醇，或者暴露在空氣中，使引發(fā)體系失活和終止聚合，然后用乙醚或者甲醇沉淀直到形貌變?yōu)楣腆w，放入真空干燥箱中除去乙醚或者甲醇，所得產(chǎn)物為線性PGMA ;所述的配體為2，2-聯(lián)吡啶(BPY)、1，1,4, 7，10，10-六甲基三乙烯四胺(HMTETA)、五甲基二乙烯三胺(PMDTETA)、4，4-聯(lián)吡啶中的一種或幾種；2. 0-60°C無(wú)氧條件下，將1.5g-2. 5g步驟I中制備的線性PGMA溶于7g-10g四氫呋喃或N-N- 二甲基甲酰胺中，再加入O. 36g-0. 37ga -溴異丁酸(BIBA);反應(yīng)12_48h，優(yōu)選24-48h，用乙醚沉淀直到形貌變?yōu)楣腆w，放入真空干燥箱中除去乙醚，所得產(chǎn)物為PGMA-Br ；3. 0-60°C無(wú)氧條件下，將O. 2g-0. 5g步驟2得到的PGMA-Br、5g-1Og有機(jī)溶劑、3g_6g單體、O. 082g-0. 15g配體、O. 033g-0. Ig Cufc混合，各組分加入順序?yàn)橄葘GMA-Br溶于有機(jī)溶劑，然后加入單體，再加入配體，最后加入CuBr弓I發(fā)活性可控自由基聚合，或者先將PGMA-Br溶于有機(jī)溶劑中，然后加入單體，再加入CuBr，最后加入配體引發(fā)活性可控自由基聚合；反應(yīng)l_500min，優(yōu)選l_450min，然后加入甲醇，或者暴露在空氣中，使引發(fā)體系失活和終止聚合，最后用乙醚或者甲醇沉淀直到形貌變?yōu)楣腆w，放入真空干燥箱中除去乙醚或甲醇，即得到梳狀的以PGMA為骨架的聚合物；4. 0_60°C無(wú)氧條件下，將O. 1-0. 5g步驟3得到的梳狀的以PGMA為骨架的聚合物溶于5g-10g四氫呋喃或N-N- 二甲基甲酰胺中，加入2g-4g醇胺和lg_2g三乙胺，開環(huán)反應(yīng)72-168h ;然后用乙醚沉淀直到產(chǎn)物形貌為固體，放入真空干燥箱中除去乙醚；然后將產(chǎn)物溶于水中，加水量與產(chǎn)物的比例為100-300 ml/g;產(chǎn)物溶解后放入截留分子量為2500-4500MW的透析袋中，在去離子水中透析3_6h ;最后將透析袋中的產(chǎn)物冷凍干燥直至 除去所有水分即得到梳狀的以PGEA為骨架的陽(yáng)離子基因載體。步驟3所述的有機(jī)溶劑為N-N- 二甲基甲酰胺或二甲基亞砜。步驟3所述的單體為甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)、甲基丙烯酸N，N- 二甲氨基乙酯(DMEMA)、N-異丙基丙烯酰胺(NIPAAm)、聚(乙二醇)乙醚甲基丙烯酸酯(PEGEEMA)、聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEGMA)、聚乙二醇(PEG)中的一種或幾種。步驟3所述的配體為2，2-聯(lián)吡啶(BPY)、1，1,4, 7, 10, 10-六甲基三乙烯四胺(HMTETA)、五甲基二乙烯三胺(PMDTETA)、4，4-聯(lián)吡啶中的一種或幾種。步驟4所述的醇胺為乙醇胺(EA)、2_氨基_1_丙醇(API )、3_氨基_1_丙醇(AP2)、N-N- 二甲基乙二胺(DED )、胱胺中的一種或幾種。有益效果本發(fā)明利用活性可控自由基聚合法制得分子量大小從20000-100000，分子量分布I. 6-2. I的聚合物。該聚合反應(yīng)平穩(wěn)，易于調(diào)控，并可根據(jù)需要制備出多種不同分子量系列的、窄分子量分布的高性能陽(yáng)離子基因載體。該基因載體儲(chǔ)存穩(wěn)定性好，放置幾天或幾個(gè)月后仍可保持原有性能；并且在Ifepg2、Hela、C6、COS7、HEK293等細(xì)胞中具有高于PEI (25 Kda)的轉(zhuǎn)染效率，使用方法簡(jiǎn)單，具有商業(yè)化潛力。圖I不同的以PGMA為骨架的梳狀陽(yáng)離子基因載體的合成圖。圖2以PGMA為骨架的線性陽(yáng)離子基因載體的開環(huán)反應(yīng)圖。圖3轉(zhuǎn)染效率圖；PEI為金標(biāo)，I-PGEA為實(shí)施例I得到的線性的以PGMA為骨架的陽(yáng)離子基因載體PGEA ；c-PGEA, c-PGEAPEG分別為實(shí)施例3和是實(shí)施例4得到的梳狀的以PGMA為骨架的陽(yáng)離子基因載體。圖4細(xì)胞內(nèi)毒性曲線圖；PEI為金標(biāo)，I-PGEA為實(shí)施例I得到的線性的以PGMA為骨架的陽(yáng)離子基因載體PGEA ;c-PGEA、c-PGEAPEG分別為實(shí)施例3和實(shí)施例4得到的梳狀的以PGMA為骨架的陽(yáng)離子基因載體。
為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。實(shí)施例I1)50°C氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下連續(xù)反應(yīng)，將12gGMA (甲基丙烯酸縮水甘油酯)加入小燒瓶中，然后依次加入IOg的THF(四氫呋喃)、120mg五甲基二乙烯三胺、213. 6mg PMDETA，最后加入86.4mg CuBr來(lái)引發(fā)活性可控自由基聚合；3h后打開瓶塞加速攪拌lOmin，與空氣充分接觸停止反應(yīng)，聚合產(chǎn)物用甲醇反復(fù)沉淀直到形貌變?yōu)楣腆w，放入真空干燥箱中除去甲醇，即得到線性PGMA，該聚合物數(shù)均分子量(Mn)為580000g/mol，PDI (Mw/Mn)為I. 23。2) 50°C氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下連續(xù)反應(yīng)，將O. 3g步驟I)得到的線性PGMA加入5. 6g的THF溶解，然后加入3g乙醇胺(或使用2-氨基-I-丙醇、3-氨基-I-丙醇、N-N- 二甲基乙二 胺、或者O. 15g乙醇胺和O. 15g N-N-二甲基乙二胺)，Ig的三乙胺后進(jìn)行開環(huán)反應(yīng)168h，聚合產(chǎn)物用乙醚反復(fù)沉淀直到形貌變?yōu)楣腆w，放入真空干燥箱中除去乙醚；然后將產(chǎn)物溶于40ml水放入截留分子量為3500MW的透析袋中，之后轉(zhuǎn)入5L大燒杯中加滿去離子水開始透析，透析6h ;之后放入冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥直至除去所有水分，得到線性的以PGMA為骨架的陽(yáng)離子基因載體，記為PGEA (使用2-氨基-I-丙醇得到的產(chǎn)物記為PGAP1，使用3-氨基-I-丙醇得到的產(chǎn)物記為PGAP2，使用N-N- 二甲基乙二胺得到的產(chǎn)物記為P⑶ED，使用
O.15g乙醇胺和O. 15g N-N- 二甲基乙二胺得到的產(chǎn)物記為PGEADED)。實(shí)施例2I) 37°C氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下連續(xù)反應(yīng)，在燒瓶中取I. 5克實(shí)施例I的步驟I)中得到的線性 PGMA 溶于 IOg 的 THF 中，加入 O. 36 克 BIBA (2-Bromoisobutyric acid)，反應(yīng) 24h后，乙醚沉淀，真空干燥后得到PGMA-Br (PGMA/BIBA為5:1，分子鏈上每6個(gè)GMA鏈段中有一個(gè)上面接Br)。2) 50°C氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下連續(xù)反應(yīng)，將O. 3g上述步驟I)得到的PGMA-Br加入5gTHF中溶解，然后依次加入4gGMA，82mg的HMTETA，最后加入33. 5mg的CuBr引發(fā)活性可控自由基聚合，待反應(yīng)4h后打開瓶塞加速攪拌lOmin，與空氣充分接觸停止反應(yīng)；聚合產(chǎn)物用甲醇反復(fù)沉淀直到產(chǎn)物變?yōu)楣腆w，放入真空干燥箱中除去甲醇后得到梳狀PGMA。3) 50°C氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下連續(xù)反應(yīng)，將O. 3g步驟2)得到的梳狀PGMA加入5. 6g的THF溶解，然后加入3g乙醇胺，Ig的三乙胺后進(jìn)行開環(huán)反應(yīng)168h，聚合產(chǎn)物用乙醚反復(fù)沉淀直到形貌變?yōu)楣腆w，放入真空干燥箱中除去乙醚；然后將產(chǎn)物溶于40ml水放入截留分子量為3500Mw的透析袋中，之后轉(zhuǎn)入5L大燒杯中加滿去離子水開始透析，透析6h ;之后放入冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥直至除去所有水分，得到梳狀的以PGMA為骨架的陽(yáng)離子基因載體。實(shí)施例3I)37°C氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下連續(xù)反應(yīng)，在燒瓶中取2. 5克實(shí)施例I的步驟I)中得到的線性 PGMA 溶于 IOg 的 THF 中，加入 O. 37 克 BIBA (2-Bromoisobutyric acid)反應(yīng) 24h 后，乙醚沉淀，真空干燥后得到PGMA-BKPGMA/BIBA為8:1，分子鏈上每8個(gè)GMA鏈段中有一個(gè)上面接Br)。2) 50°C氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下連續(xù)反應(yīng)，將O. 3g上述步驟I)得到的PGMA-Br加入5gTHF中溶解，然后依次加入4gGMA，82mg的HMTETA，最后加入33. 5mg的CuBr引發(fā)活性可控自由基聚合，待反應(yīng)4h后打開瓶塞加速攪拌lOmin，與空氣充分接觸停止反應(yīng)；聚合產(chǎn)物用甲醇反復(fù)沉淀直到產(chǎn)物變?yōu)楣腆w，放入真空干燥箱中除去甲醇后得到梳狀PGMA。3) 50°C氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下連續(xù)反應(yīng)，將O. 3g步驟2)得到的梳狀PGMA加入5. 6g的THF溶解，然后加入3g乙醇胺，Ig的三乙胺后進(jìn)行開環(huán)反應(yīng)168h，聚合產(chǎn)物用乙醚反復(fù)沉淀直到形貌變?yōu)楣腆w，放入真空干燥箱中除去乙醚；然后將產(chǎn)物溶于40ml水放入截留分子量為3500Mw的透析袋中，之后轉(zhuǎn)入5L大燒杯中加滿去離子水開始透析，透析6h ;之后放入冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥直至除去所有水分，得到梳狀的以PGMA為骨架的陽(yáng)離子基因載體。實(shí)施例4I) 50°C氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下連續(xù)反應(yīng)，將O. 3g實(shí)施例3中步驟I)得到的PGMA-Br加Λ 3. 6gTHF 中溶解，然后依次加入 3. 7gGMA,0. 3g PEGEEMA，82mg 的HMTETA，最后加入 33. 5mg的CuBr引發(fā)活性可控自由基聚合，待反應(yīng)4h后打開瓶塞加速攪拌lOmin，與空氣充分接觸停止反應(yīng)；聚合產(chǎn)物用甲醇反復(fù)沉淀直到產(chǎn)物顏色變淺為止，放入真空干燥箱中除去甲醇后得到梳狀P (GMA-PEGEEMA)。 2)50°C氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下連續(xù)反應(yīng)，將O. 3g步驟I)得到的梳狀P(GMA-PEGEEMA)加入5. 6g的THF溶解，然后加入3g乙醇胺，Ig的三乙胺后進(jìn)行開環(huán)反應(yīng)168h，聚合產(chǎn)物用乙醚反復(fù)沉淀直到形貌變?yōu)楣腆w，放入真空干燥箱中除去乙醚；然后將產(chǎn)物溶于40ml水放入截留分子量為3500MW的透析袋中，之后轉(zhuǎn)入5L大燒杯中加滿去離子水開始透析，透析6h ；之后放入冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥直至除去所有水分，得到梳狀的以PGMA為骨架的陽(yáng)離子基因載體，記為PGEAPEG。通過X射線光電子能譜(XPS)表征聚合物主要組分的含量，用核磁共振譜儀(NMR)對(duì)原料、反應(yīng)中間體和產(chǎn)物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析和驗(yàn)證。使用激光粒度及電位分析儀表征所得產(chǎn)物的粒徑、zeta電位，用凝膠滲透色譜(GPC)對(duì)產(chǎn)物的可剪切性和分子量進(jìn)行了表征。最后，通過凝膠電泳實(shí)驗(yàn)測(cè)試所得基因載體包埋DNA的能力，細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)測(cè)試了產(chǎn)物載體的轉(zhuǎn)染效率和生物相容性。所得到的陽(yáng)離子基因載體的轉(zhuǎn)染效率和毒性如圖3和圖4。
權(quán)利要求
1.一種有關(guān)ATRP法采用線性的以PGEA為骨架的陽(yáng)離子基因載體的制備方法，其特征在于，其具體制備步驟為 1)0-60°C無(wú)氧條件下，將0. lg-0. 2g五甲基二乙烯三胺、5g-10g四氫呋喃、6g-12gGMA、0. 08g-0. 26g配體、0. 033g-0. 15g CuBr混合，各組分添加順序?yàn)橄葘MA溶于四氫呋喃，然后加入五甲基二乙烯三胺，再加入配體，最后加入CuBr引發(fā)活性可控自由基聚合，或者先將GMA溶于四氫呋喃，然后加入五甲基二乙烯三胺，再加入CuBr，最后加入配體引發(fā)活性可控自由基聚合；聚合反應(yīng)時(shí)間為l_9h，反應(yīng)完成后加入水或者甲醇，或者暴露在空氣中，使引發(fā)體系失活和終止聚合，然后用乙醚或者甲醇沉淀直到形貌變?yōu)楣腆w，放入真空干燥箱中除去乙醚或者甲醇，所得產(chǎn)物為線性PGMA ;所述的配體為2，2-聯(lián)吡啶、1，1,4, 7，10，10-六甲基三乙烯四胺、五甲基二乙烯三胺、4，4-聯(lián)吡啶中的一種或幾種； 2)0-60°C無(wú)氧條件下，將上述步驟I)得到的線性PGMA 0. 2-0. 5g溶于4g_10g四氫呋喃或N-N-二甲基甲酰胺中，加入2g-4g醇胺和lg_2g三乙胺，開環(huán)反應(yīng)72-168h ;然后用乙醚沉淀直到產(chǎn)物形貌為固體，放入真空干燥箱中除去乙醚；然后將產(chǎn)物溶于水中，加水量與產(chǎn)物的比例為100-300 ml/g ;產(chǎn)物溶解后放入截留分子量為2500-4500MW的透析袋中，在去離子水中透析3-6h;最后將透析袋中的產(chǎn)物冷凍干燥直至除去所有水分即得到線性的以PGEA為骨架的陽(yáng)離子基因載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種有關(guān)ATRP法采用線性的以PGEA為骨架的陽(yáng)離子基因載體的制備方法，其特征在于上述步驟2)所述的醇胺為乙醇胺、2-氨基-I-丙醇、3-氨基-I-丙醇、N-N- 二甲基乙二胺、胱胺中的一種或幾種。
3.一種有關(guān)ATRP法采用梳狀的以PGEA為骨架的陽(yáng)離子基因載體的制備方法，其特征在于，其具體制備步驟為 1)0-60°C無(wú)氧條件下，將0. 05g-0. 2g五甲基二乙烯三胺、5g-10g四氫呋喃、6g_12gGMA、0. 08g-0. 26g配體、0. 033g-0. 15g Cufo■混合，各組分添加順序?yàn)橄葘MA溶于四氫呋喃，然后加入五甲基二乙烯三胺，再加入配體，最后加入CuBr弓丨發(fā)活性可控自由基聚合，或者先將GMA溶于四氫呋喃，然后加入五甲基二乙烯三胺，再加入CuBr，最后加入配體引發(fā)活性可控自由基聚合；聚合反應(yīng)時(shí)間為l_9h,反應(yīng)完成后加入水或者甲醇,或者暴露在空氣中，使引發(fā)體系失活和終止聚合，然后用乙醚或者甲醇沉淀直到形貌變?yōu)楣腆w，放入真空干燥箱中除去乙醚或者甲醇，所得產(chǎn)物為線性PGMA ； 2)0-60°C無(wú)氧條件下，將上述步驟I)中制備的線性PGMA I. 5-2. 5g溶于7g-10g四氫呋喃或N-N- 二甲基甲酰胺中，再加入0. 36g-0. 37g a -溴異丁酸；反應(yīng)12_48h，優(yōu)選24-48h，用乙醚沉淀直到形貌變?yōu)楣腆w，放入真空干燥箱中除去乙醚，所得產(chǎn)物為PGMA-Br ； 3)0-60°C無(wú)氧條件下，將上述步驟2)得到的PGMA-Br 0. 2g_0. 5g、5g_10g有機(jī)溶劑、3g_6g單體、0. 082g-0. 15g配體、0. 033g-0. Ig Cufo■混合，各組分加入順序?yàn)橄葘GMA-Br溶于有機(jī)溶劑，然后加入單體，再加入配體，最后加入CuBr引發(fā)活性可控自由基聚合，或者先將PGMA-Br溶于有機(jī)溶劑中，然后加入單體，再加入CuBr，最后加入配體引發(fā)活性可控自由基聚合；反應(yīng)l_500min，優(yōu)選l_450min，然后加入甲醇，或者暴露在空氣中，使引發(fā)體系失活和終止聚合，最后用乙醚或者甲醇沉淀直到形貌變?yōu)楣腆w，放入真空干燥箱中除去乙醚或甲醇，即得到梳狀的以PGMA為骨架的聚合物；所述的有機(jī)溶劑為N-N-二甲基甲酰胺或~■甲基亞諷； 4)0-60°C無(wú)氧條件下，將上述步驟3)得到的梳狀的以PGMA為骨架的聚合物0. 1-0. 5g溶于5g-10g四氫呋喃或N-N- 二甲基甲酰胺中，加入2g-4g醇胺和lg_2g三乙胺，開環(huán)反應(yīng)72-168h ;然后用乙醚沉淀直到產(chǎn)物形貌為固體，放入真空干燥箱中除去乙醚；然后將產(chǎn)物溶于水中，加水量與產(chǎn)物的比例為100-300 ml/g;產(chǎn)物溶解后放入截留分子量為2500-4500MW的透析袋中，在去離子水中透析3_6h ;最后將透析袋中的產(chǎn)物冷凍干燥直至除去所有水分即得到梳狀的以PGEA為骨架的陽(yáng)離子基因載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種有關(guān)ATRP法采用梳狀的以PGEA為骨架的陽(yáng)離子基因載體的制備方法，其特征在于所述的配體為2，2-聯(lián)吡啶、1，1,4, 7，10，10-六甲基三乙烯四胺、五甲基二乙烯三胺、4，4-聯(lián)吡啶中的一種或幾種。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種有關(guān)ATRP法采用梳狀的以PGEA為骨架的陽(yáng)離子基因載體的制備方法，其特征在于上述步驟3)所述的單體為甲基丙烯酸縮水甘油酯、甲基丙烯酸N，N-二甲氨基乙酯、N-異丙基丙烯酰胺、聚(乙二醇)乙醚甲基丙烯酸酯、聚乙二醇甲基丙烯酸酯、聚乙二醇中的一種或幾種。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種有關(guān)ATRP法采用梳狀的以PGEA為骨架的陽(yáng)離子基因載體的制備方法，其特征在于上述步驟4)所述的醇胺為乙醇胺、2-氨基-I-丙醇、3-氨基-I-丙醇、N-N- 二甲基乙二胺、胱胺中的一種或幾種。
全文摘要
本發(fā)明公開了屬于非病毒基因載體技術(shù)領(lǐng)域的一種以ATRP法構(gòu)建一系列以PGMA(聚甲基丙烯酸甘油酯)為骨架，低毒且高效的陽(yáng)離子基因載體。該ATRP法聚合反應(yīng)平穩(wěn)，易于調(diào)控，并可根據(jù)需要制備出多種不同分子量的、窄分子量分布的高性能陽(yáng)離子基因載體。制得的陽(yáng)離子基因載體儲(chǔ)存穩(wěn)定性好，并且在Hepg2、C6、Cos7、HEK293等細(xì)胞中具有高于金標(biāo)PEI的轉(zhuǎn)染效率，使用方法簡(jiǎn)單，具有商業(yè)化潛力。
文檔編號(hào)C08F265/04GK102702407SQ20121020894
公開日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2012年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月21日
發(fā)明者孫文海, 李展, 羅波 申請(qǐng)人:薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司