發(fā)酵生產(chǎn)咖啡堿的工程菌、其構(gòu)建方法及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供一種發(fā)酵生產(chǎn)咖啡堿的工程菌，所述工程菌是通過將咖啡堿生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因?qū)牍劝彼岚魻顥U菌(Corynebacterium glutamicum)構(gòu)建而成的重組谷氨酸棒狀桿菌。本發(fā)明通過過量表達(dá)咖啡堿合成途徑中的關(guān)鍵酶基因，使谷氨酸棒狀桿菌具備生產(chǎn)咖啡堿的能力，且產(chǎn)物咖啡堿能夠大量分泌到胞外，分離純化步驟少，咖啡堿的得率高，搖瓶發(fā)酵結(jié)果顯示，咖啡堿的產(chǎn)量達(dá)3.75mg/L，表明該重組工程菌具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景，為利用谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵生產(chǎn)食品安全級(jí)咖啡堿奠定了理論基礎(chǔ)。
【專利說明】
發(fā)酵生產(chǎn)咖啡堿的工程菌、其構(gòu)建方法及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程及微生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體地說，涉及一種發(fā)酵生產(chǎn)咖啡堿的 工程菌、其構(gòu)建方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 咖啡堿即1，3，7-三甲基黃嘌呤，是風(fēng)靡世界的三大軟飲料植物（茶樹、咖啡和可 可）中嘌呤堿的主體成份。研究發(fā)現(xiàn)，世界上至少60多種植物含有咖啡堿，含量比較高的有 茶（Camellia sinensis)2%_5%、咖啡豆（Coffea arabica) 1 %_2%、可可（Theabronma cacao)0.03%、蘇丹可樂果（Cola acuminata)l .5%、爪拉拿泡林藤（Paullinia capana) 4% 以上、巴拉圭茶（Ilex paraguariensis)0 · 7%等。
[0003] 咖啡堿作為一種重要的植物次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有抗菌、抵御生物入侵等生理作用， 對(duì)富含咖啡堿的植物的生長而言，咖啡堿是不可或缺的一種物質(zhì)。同時(shí)，咖啡堿作為一種甲 基黃嘌呤衍生物，對(duì)人體的基本功能是對(duì)腺嘌呤受體的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗作用?？Х葔A對(duì)人體中 樞神經(jīng)系統(tǒng)有較強(qiáng)的興奮作用，適量攝入能夠改善思維活動(dòng)，振奮神經(jīng)，消除和抵抗疲勞 等?？Х葔A還具有增強(qiáng)肌體免疫功能，解熱鎮(zhèn)痛，強(qiáng)心利尿等多種藥理功能，因此被廣泛用 于復(fù)方阿司匹林、復(fù)方感冒藥等多種藥品和多種可樂型飲料工業(yè)中，是貴重的藥物原料和 飲料、食品添加劑。國際市場(chǎng)上咖啡堿的價(jià)格達(dá)到25美元/公斤左右，且供應(yīng)市場(chǎng)主要為西 方少數(shù)大企業(yè)壟斷控制。
[0004] 目前，市售咖啡堿的制備方法主要包括人工合成法、傳統(tǒng)溶劑萃取法、升華法和沉 淀法及新技術(shù)柱層析、微波萃取和超臨界流體萃取法等。其中化學(xué)合成方法最為常見，但存 在工藝繁瑣、附加產(chǎn)物多，產(chǎn)品純度低及毒害有機(jī)物質(zhì)殘留弊端，有些歐美國家在法律中明 文禁止將化學(xué)合成的咖啡堿添加到食品飲料中。超臨界CO 2萃取法因具備良好的選擇性、萃 取效率高、產(chǎn)品純度高等優(yōu)點(diǎn)而成為從茶葉中提取"天然咖啡堿"的主流技術(shù)。但是此方法 存在設(shè)備價(jià)格昂貴，生產(chǎn)成本相對(duì)較高等弊端。
[0005] 基于以上現(xiàn)狀，采用生物工程技術(shù)手段，通過構(gòu)建重組工程菌，利用微生物體外發(fā) 酵生產(chǎn)咖啡堿成為制備天然咖啡堿的發(fā)展趨勢(shì)，具有廣闊的應(yīng)用前景。而使原本不具備咖 啡堿代謝途徑的微生物能夠大量合成咖啡堿，提高咖啡堿的產(chǎn)量，需要對(duì)受體菌的生物合 成途徑進(jìn)行改造。最常用的方法是將咖啡堿生物合成中關(guān)鍵酶基因連接到合適的表達(dá)載體 上，再導(dǎo)入到微生物中，使這些基因能夠在微生物體內(nèi)實(shí)現(xiàn)過量表達(dá)。
[0006] 谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)是呈短桿狀的非致病土壤細(xì)菌， 具有過量合成多種氨基酸的能力，被稱作食品級(jí)安全菌，其全基因組測(cè)序工作已完成。近年 來利用谷氨酸棒狀桿菌來發(fā)酵生產(chǎn)已清楚合成路徑的生化物質(zhì)的成功案例越來越多。目前 為止，尚未發(fā)現(xiàn)任何利用谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵生產(chǎn)咖啡堿的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種發(fā)酵生產(chǎn)咖啡堿的工程菌，特別是一種產(chǎn)咖啡堿的重組 谷氨酸棒狀桿菌工程菌。
[0008] 具體策略為通過在谷氨酸棒狀桿菌中過表達(dá)咖啡堿生物合成核心途徑中的關(guān)鍵 基因，實(shí)現(xiàn)利用工程菌發(fā)酵生產(chǎn)咖啡堿的目的。
[0009] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供的發(fā)酵生產(chǎn)咖啡堿的工程菌，所述工程菌是通 過將咖啡堿生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因?qū)牍劝彼岚魻顥U菌構(gòu)建而成的重組谷氨酸棒 狀桿菌，所述關(guān)鍵酶基因包括CaXMT (7-黃嘌呤核苷甲基轉(zhuǎn)移酶)基因、TCS1 (茶樹咖啡堿合 成酶)基因、TAMPD(AMP脫氨酶)和TIDHaMP脫氫酶)基因。
[0010] 優(yōu)選地，所述關(guān)鍵酶基因?yàn)閬碓从诓铇涞腡CSl基因、TAMPD基因、TIDH基因和來源 于咖啡果的CaXMT基因。
[0011] 更優(yōu)選地，通過將所述關(guān)鍵酶基因全部構(gòu)建到同一穿梭表達(dá)載體PZ8-1上，然后導(dǎo) 入谷氨酸棒狀桿菌(ATCC 13032)中得到重組菌。
[0012] 本發(fā)明還提供所述工程菌的構(gòu)建方法，將咖啡堿生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因構(gòu) 建到原核表達(dá)載體上，然后導(dǎo)入谷氨酸棒狀桿菌中，篩選陽性克隆。
[0013] 前述的方法，將CaXMT基因、TCSl基因、TAMH)基因和TIDH基因構(gòu)建到同一穿梭表達(dá) 載體PZ8-1上，然后導(dǎo)入谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032中，篩選陽性克隆。
[0014] 在本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，根據(jù)谷氨酸棒狀桿菌的密碼子使用頻率，對(duì)全 部四個(gè)目的基因的序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，再于目的基因序列前面各設(shè)計(jì)一段RBS序列。最終 構(gòu)建得到含有啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS序列）、操縱子和終止子四大表達(dá)元件以及優(yōu)化 的全部四個(gè)目的基因序列的表達(dá)盒（SEQ ID NO: 1)，然后將上述表達(dá)盒連接到載體pZ8-l 上，然后導(dǎo)入谷氨酸棒狀桿菌中得到重組菌。
[0015] 本發(fā)明進(jìn)一步提供所述工程菌在發(fā)酵生產(chǎn)咖啡堿中的應(yīng)用。
[0016] 所述應(yīng)用是在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，向發(fā)酵液中添加一定濃度的磷酸腺苷(AMP)，進(jìn)行 發(fā)酵生產(chǎn)咖啡堿。
[0017] 所用發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：（NH4)2S〇4 20g/L，K2HP〇4 lg/L，KH2P〇4 lg/L，MgS〇4.7H20 250mg/L，M0PS 42g/L，尿素5g/L，維生素 H 0 · 2mg/L，硫胺素500yg/L，微量元素0 · 2mg/L，葡 萄糖25g/L，pH值7.0-7.2。其中，微量元素的組成如下：FeS〇4 · 7H20 10g/L，MnS〇4 · 7H20 lOg/L,ZnSO4· 7H20 lg/L,CuSO4 0.2g/L,NiCl2· 6H2O 0.02g/L〇
[0018] 發(fā)酵條件為:250mL發(fā)酵罐內(nèi)盛放50mL發(fā)酵液，于30 °C轉(zhuǎn)速200rpm的條件下進(jìn)行發(fā) 酵。
[0019]前述的應(yīng)用，發(fā)酵培養(yǎng)Sh后，向發(fā)酵液中添加終濃度為O.Hmg/mL的磷酸腺苷(優(yōu) 選lmg/mL)，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)120h。采用超高效液相色譜(UPLC)定量測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)生的咖啡堿。
[0020] 咖啡堿樣品的制備：向4mL發(fā)酵液中加入等體積的乙酸乙酯或氯仿，充分振蕩并靜 置分層后，取有機(jī)層，30 °C真空離心干燥后，重懸于無菌水中，0.22μπτ2?|膜過濾后，濾液用于 UPLC檢測(cè)分析。
[0021] 本發(fā)明通過過量表達(dá)咖啡堿合成途徑中的關(guān)鍵酶基因，使谷氨酸棒狀桿菌具備生 產(chǎn)咖啡堿的能力，且產(chǎn)物咖啡堿能夠大量分泌到胞外，分離純化步驟少，咖啡堿的得率高， 搖瓶發(fā)酵結(jié)果顯示，咖啡堿的產(chǎn)量達(dá)到3.75mg/L，表明該重組工程菌具有良好的工業(yè)應(yīng)用 前景，為利用谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵生產(chǎn)食品安全級(jí)咖啡堿奠定了理論基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0022]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中構(gòu)建的重組表達(dá)載體的質(zhì)粒圖譜。
[0023]圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中重組谷氨酸棒狀桿菌工程菌的發(fā)酵液UPLC檢測(cè)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0024]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例 均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)（Sambrook J&Russell DW, Molecular Cloning:a Laboratory Manual ,2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。 [0025]以下實(shí)施例中所用的限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、PCR試劑、In-f us ion試劑盒等 均購自TaKaRa生物公司，質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒均購自Axygen公司，大腸桿菌感受 態(tài)細(xì)胞trans T1、DNA marker均購自北京全式金生物科技有限公司。所用引物由通用生物 公司合成，全基因合成由南京金斯瑞生物科技公司完成。
[0026] 實(shí)施例1產(chǎn)咖啡堿的谷氨酸棒狀桿菌重組工程菌的構(gòu)建
[0027] 1、茶樹咖啡堿生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因的克隆
[0028]本實(shí)施例中四個(gè)目的基因的原始序列來自于GenBank，其中基因 TAMPD登錄號(hào)為 AB480359963,基因 TIDH 登錄號(hào)為 AB156763654,基因 CaXMT 登錄號(hào)為 AB048793,基因 TCSl 登 錄號(hào)為AB031280。
[0029] 首先，為使插入的TAMPD、TIDH、CaXMT和TCSl基因能夠在谷氨酸棒狀桿菌中正常表 達(dá)，需構(gòu)建含有啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS序列）、操縱子和終止子四大表達(dá)元件的表達(dá) 盒。同時(shí)，根據(jù)谷氨酸棒狀桿菌的密碼子使用頻率，對(duì)四個(gè)目的基因的序列進(jìn)行密碼子優(yōu) 化，再于四個(gè)目的基因序列前面各設(shè)計(jì)一段RBS序列。
[0030] 此外，為了使其定向插入表達(dá)載體PZ8-1中，分別在TAMPD基因序列的5'端加入 EcoRI酶切位點(diǎn)，在TIDH基因序列的3 '端加入BamHI酶切位點(diǎn)，在CaXMT基因序列的5 '端前加 入新的Ptac啟動(dòng)子，Ptac序列的5'端加入BamHI酶切位點(diǎn)，在TCSl基因序列的3'端加入PstI 酶切位點(diǎn)。最后將優(yōu)化后的基因片段交由南京金斯瑞生物科技公司人工合成。構(gòu)建得到的 表達(dá)盒的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0031] 2、重組表達(dá)載體的構(gòu)建
[0032] 純化后的表達(dá)盒，利用T4DNA連接酶將其與經(jīng)EcoRI和PstI消化處理的表達(dá)質(zhì)粒 PZ8-1在16°C水浴條件下過夜連接，并將連接液轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞trans Tl中，取 IOOyL轉(zhuǎn)化液涂布于含有50yg/mL卡那霉素的LB平板上，37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10-12h，并通過 菌落PCR篩選陽性單克隆，得到的陽性單克隆送公司測(cè)序，進(jìn)一步驗(yàn)證目的基因序列的正確 性，從而得到重組表達(dá)載體pZ8-TAMPD-TIDH-CaXMT-TCSl，質(zhì)粒圖譜如圖1所示（即pZ8-A-B-C-D) 〇
[0033] 3、轉(zhuǎn)化宿主及重組工程菌的篩選
[0034] 利用化學(xué)方法制備C.glutamicum ATCC 13032感受態(tài)細(xì)胞，并將上述重組表達(dá)質(zhì) 粒電轉(zhuǎn)化至C.glutamicum ATCC 13032感受態(tài)細(xì)胞中，取IOOyL轉(zhuǎn)化液涂布于含有25yg/mL 卡那霉素的LB平板上，30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36-48h至長出單菌落，并通過菌落PCR篩選目的重 組菌株。同時(shí)，為了排除表達(dá)載體PZ8-1的干擾，將不含有目的基因的空質(zhì)粒pZ8-l也電轉(zhuǎn)入 ATCC 13032感受態(tài)細(xì)胞中作為對(duì)照組CK，最終成功構(gòu)建得到重組工程菌C.glutamicum ATCC 13032/pZ8-TAMPD-TIDH-CaXMT-TCSl〇
[0035]實(shí)施例2重組谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵生產(chǎn)咖啡堿
[0036] 1、種子液的制備
[0037]所用種子培養(yǎng)基配方為：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH值7 · 0，121°C 高溫滅菌20min。
[0038] 種子液的制備方法:挑取活化后的新鮮重組工程菌接種于含有25yg/mL卡那霉素 的種子培養(yǎng)基中，30°C，200rpm條件下振蕩培養(yǎng)12h，即得種子液。
[0039] 2、重組谷氨酸棒狀桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)
[0040] 所用發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：（NH4)2S〇4 20g/L，K2HP〇4 lg/L，KH2P〇4 lg/L，MgS〇4 · 7H20 250mg/L，M0PS 42g/L，尿素 5g/L，維生素 H 0 · 2mg/L，硫胺素 500yg/L，微量元素 0 · 2mg/L，葡 萄糖25g/L，pH值7.0-7.2。其中，微量元素的組成如下：FeS〇4 · 7H20 10g/L，MnS〇4 · 7H20 lOg/L,ZnSO4· 7H20 lg/L,CuSO4 0.2g/L,NiCl2· 6H2O 0.02g/L〇
[0041] 發(fā)酵條件為:將上述種子液在4°C，6000rpm條件下冷凍離心收集菌體沉淀，并將所 有菌體沉淀接入盛放有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL發(fā)酵罐內(nèi)，于30°C轉(zhuǎn)速200rpm的條件下進(jìn) 行發(fā)酵。
[0042]發(fā)酵培養(yǎng)8h后，即OD6(K)nm值為2.0-2.5時(shí)，向發(fā)酵液中添加終濃度為lmg/mL的磷酸 腺苷，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)120h。
[0043]發(fā)酵結(jié)束后，采用超高效液相色譜(UPLC)定量測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)生的咖啡堿。
[0044]咖啡堿樣品的制備：向4mL發(fā)酵液中加入等體積的乙酸乙酯或氯仿，充分振蕩并靜 置分層后，取有機(jī)層，30 °C真空離心干燥后，重懸于無菌水中，0.22μπτ2?|膜過濾后，濾液用于 UPLC檢測(cè)分析。
[0045] 儀器:Waters ACQUITY超高效液相色譜儀
[0046] 色譜柱：Phenomenex kinetex 2· 6μηι XB-C18 100A
[0047] 流動(dòng)相:Α:0·2%乙酸水;Β:純乙腈
[0048] 梯度洗脫條件：0-8min，A:98%-90% ;8-10min，A:90%-75% ; 10-11.5min;
[0049] A：75% ；11.5min-14min,75%-98% ；14min-18min,A：98%
[0050] 色譜條件:流速，0.4mL/min;柱溫，30 °C ;進(jìn)樣量，IOyL;紫外檢測(cè)波長，274nm。
[0051] 重組谷氨酸棒狀桿菌工程菌的發(fā)酵液UPLC檢測(cè)結(jié)果見圖2。其中，標(biāo)準(zhǔn)品是指黃嘌 呤核苷、7-甲基黃嘌呤、可可堿和咖啡堿四種標(biāo)準(zhǔn)品的UPLC檢測(cè)結(jié)果;樣品組是指重組谷氨 酸棒狀桿菌工程菌發(fā)酵液的UPLC檢測(cè)結(jié)果；對(duì)照組1是指含有空載體pZ8-l的出發(fā)菌株 C. glutamicum ATCC 13032發(fā)酵液的UPLC檢測(cè)結(jié)果；對(duì)照組2是指出發(fā)菌株C. glutamicum ATCC 13032發(fā)酵液的UPLC檢測(cè)結(jié)果。
[0052]搖瓶發(fā)酵結(jié)果顯示，重組工程菌中咖啡堿的產(chǎn)量達(dá)到3.75mg/L，而兩個(gè)對(duì)照組菌 株在整個(gè)發(fā)酵過程中均檢測(cè)不到咖啡堿的積累。本發(fā)明的重組谷氨酸棒狀桿菌工程菌適合 用于大規(guī)模工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)咖啡堿，具有良好的應(yīng)用前景。
[0053]雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 發(fā)酵生產(chǎn)咖啡堿的工程菌，其特征在于，所述工程菌是通過將咖啡堿生物合成途徑 中的關(guān)鍵酶基因?qū)牍劝彼岚魻顥U菌(Corynebacterium glutamicum)構(gòu)建而成的重組谷 氨酸棒狀桿菌，所述關(guān)鍵酶基因包括CaXMT基因、TCS1基因、TAMH)基因和TIDH基因。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述關(guān)鍵酶基因?yàn)閬碓从诓铇涞腡CS1基 因、TAMH)基因、TIDH基因和來源于咖啡果的CaXMT基因。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的工程菌，其特征在于，其是將所述關(guān)鍵酶基因構(gòu)建到同一 穿梭表達(dá)載體PZ8-1上，然后導(dǎo)入谷氨酸棒狀桿菌中得到的重組菌。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的工程菌，其特征在于，所述谷氨酸棒狀桿菌為ATCC 13032。5. 權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，將咖啡堿生物合成途徑中 的關(guān)鍵酶基因構(gòu)建到原核表達(dá)載體上，然后導(dǎo)入谷氨酸棒狀桿菌中，篩選陽性克隆。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，將CaXMT基因、TCS1基因、TAMPD基因和TIDH 基因構(gòu)建到同一穿梭表達(dá)載體PZ8-1上，然后導(dǎo)入谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032中，篩選陽性 克隆。7. 權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述工程菌在發(fā)酵生產(chǎn)咖啡堿中的應(yīng)用。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，向發(fā)酵液中添加一定 濃度的磷酸腺苷，進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)咖啡堿。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所用發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：（NH4)2S〇4 20g/L， K2HP〇4 lg/L，KH2P〇4 lg/L，MgS〇4*7H20 250mg/L，M0PS 42g/L，尿素5g/L，維生素 H 0.2mg/ L，硫胺素 500yg/L，微量元素 0 · 2mg/L，葡萄糖 25g/L，pH值 7 · 0-7 · 2; 發(fā)酵條件為:250mL發(fā)酵罐內(nèi)盛放50mL發(fā)酵液，于30 °C轉(zhuǎn)速200rpm的條件下進(jìn)行發(fā)酵。10. 根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的應(yīng)用，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)8h后，向發(fā)酵液中添加終濃 度為0.1-lmg/mL的磷酸腺苷，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)120h。
【文檔編號(hào)】C12N15/77GK105861408SQ201610475914
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年6月22日
【發(fā)明人】張正竹, 李萌萌, 鄧威威, 寧井銘, 鄧騁
【申請(qǐng)人】安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)