一種高產(chǎn)麥芽寡糖基海藻糖水解酶的基因工程菌及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高產(chǎn)麥芽寡糖基海藻糖水解酶的基因工程菌及其應(yīng)用，屬于基因工程和發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以E.coli Origami(DE3)為宿主，構(gòu)建了高產(chǎn)麥芽寡糖基海藻糖水解酶的基因工程菌pET?32a(+)?treZ/E.coli Origami(DE3)。以該菌株為生產(chǎn)菌株在發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶，酶活力可達(dá)204.0U·mL?1，約為搖瓶發(fā)酵的4.9倍。本發(fā)明降低了麥芽寡糖基海藻糖水解酶生產(chǎn)成本，為實(shí)現(xiàn)海藻糖的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】
一種高產(chǎn)麥芽寡糖基海藻糖水解酶的基因工程菌及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種高產(chǎn)麥芽寡糖基海藻糖水解酶的基因工程菌及其應(yīng)用，屬于基因 工程和發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 海藻糖(Trehalose)是由兩個(gè)P比喃環(huán)葡萄糖以1，1-糖苷鍵連結(jié)而成，是一種穩(wěn)定 的非還原性二糖，它有3種光學(xué)異構(gòu)體，即αα型、αβ型和邱型。
[0003] 海藻糖是一種安全的非還原性二糖，廣泛存在于自然界中，具有保濕性，抗凍抗干 燥性，熱酸穩(wěn)定性等特殊的生物學(xué)功能，對(duì)生物大分子有著非特異性的保護(hù)作用，因此在醫(yī) 學(xué)、農(nóng)業(yè)、化妝品、食品等行業(yè)應(yīng)用潛力巨大。自20世紀(jì)80年代后，各國相繼開展了海藻糖生 理生化和分子生物學(xué)的研究，該糖現(xiàn)已成為國際上最近開發(fā)的主要低聚糖之一。
[0004] 酶法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)海藻糖是上世界90年代逐漸興起的方法，主要有磷酸化酶法、海藻 糖合成酶法和雙酶法這三種方法。當(dāng)前以淀粉為底物經(jīng)過麥芽寡糖基海藻糖合成酶和麥芽 寡糖基海藻糖水解酶的共同作用生成海藻糖，即雙酶法生產(chǎn)海藻糖，受到廣泛關(guān)注。以該方 法生產(chǎn)海藻糖的轉(zhuǎn)化率高達(dá)80%以上，在一定程度上降低了海藻糖的生產(chǎn)成本并極大的推 動(dòng)了海藻糖的工業(yè)化生產(chǎn)進(jìn)程。
[0005] 麥芽寡糖基海藻糖水解酶（maltooligosyl trehalose trehalohydrolase, EC3.2.1.141)由基因 treZ編碼，是雙酶法生產(chǎn)海藻糖的其中一種酶。淀粉經(jīng)過高溫液化后 加入支鏈淀粉酶作用生成麥芽糊精，麥芽寡糖基海藻糖合成酶作用于底物還原性末端的α， α-l，4-糖苷，產(chǎn)生α，α-1，4-糖苷鍵到α，α-1，1-糖苷鍵的分子內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷作用，形成中間產(chǎn)物 麥芽寡糖基海藻糖。麥芽寡糖基海藻糖水解酶則專一的內(nèi)切該中間產(chǎn)物中麥芽寡糖基與海 藻糖相連的α，α-1，4-糖苷鍵，使之分解產(chǎn)生海藻糖和減少兩個(gè)葡萄糖單位的新麥芽寡糖， 減少兩個(gè)葡萄糖單位的新麥芽寡糖作為新底物進(jìn)行下一輪反應(yīng)，如此反復(fù)交替進(jìn)行，兩種 酶反應(yīng)就可以將麥芽寡糖轉(zhuǎn)化成海藻糖為主，以及少量葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖的產(chǎn)物。
[0006] 雙酶法生產(chǎn)海藻糖以淀粉為底物，轉(zhuǎn)化率高達(dá)80%以上，具有低成本的優(yōu)點(diǎn)，但是 麥芽寡糖基海藻糖水解酶基因在宿主菌中的可溶性表達(dá)很低，產(chǎn)生較多的包涵體，酶活力 低，不利于其工業(yè)化應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明第一個(gè)目的是提供一種高產(chǎn)麥芽寡糖基海藻糖水解酶的基因工程菌，該基 因工程菌是以pET-32a( + )載體，以E.coli 0rigami(DE3)為表達(dá)宿主，表達(dá)Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909來源的麥芽寡糖基海藻糖水解酶。
[0008] 所述Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909來源的麥芽寡糖基海藻糖水解酶 的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0009] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種所述的基因工程菌的構(gòu)建方法是:將核苷酸序列 為SEQ ID N0.1的麥芽寡糖基海藻糖水解酶基因連接到表達(dá)載體pET-32a( + )上，然后再轉(zhuǎn) 化到大腸桿菌E.coli Origami(DE3)中，篩選正確的轉(zhuǎn)化子，即得到基因工程菌pET-32a (+)-treZ/E.coli 0rigami(DE3)〇
[0010] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種所述基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)麥芽寡糖基海藻糖水 解酶的方法。
[0011] 所述的方法包括：⑴分批發(fā)酵階段:將種子液以8%-10%接種量接種于發(fā)酵罐 中，控制溫度36-38°(：、初始轉(zhuǎn)速180-200印111、初始通氣量717111丨11、溶氧28-32%、？!16.8-7.2; (2)補(bǔ)料發(fā)酵階段:待溶氧上升至80-100%，以控制比生長速率以=0.21^的指數(shù)流加的 方式進(jìn)行補(bǔ)料培養(yǎng)，控制溫度36-38°C、溶氧28-32%、pH 6.8-7.2;(3)誘導(dǎo)培養(yǎng)階段：當(dāng)菌 體細(xì)胞濃度達(dá)到〇D6QQ為30-50時(shí)，以流速0.1-0.8g · I/1 · 1Γ1流加乳糖誘導(dǎo)產(chǎn)酶，控制溫度 25-35°C、溶氧28-32 %、pH 6 · 8-7 · 2，誘導(dǎo)0-27h。
[0012]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，誘導(dǎo)培養(yǎng)階段是當(dāng)菌體細(xì)胞濃度達(dá)到0D6QQ為40時(shí)， 開始流加乳糖誘導(dǎo)產(chǎn)酶。
[0013] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，誘導(dǎo)培養(yǎng)階段是以流速0.2g · I/1 · 1Γ1流加乳糖誘 導(dǎo)產(chǎn)酶。
[0014] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，誘導(dǎo)培養(yǎng)階段是控制溫度30°C。
[0015] 本發(fā)明所述誘導(dǎo)產(chǎn)酶的時(shí)間，無特殊說明的，是指從第一次加入誘導(dǎo)劑開始算起。
[0016] 本發(fā)明的有益效果：
[0017] (1)本發(fā)明將Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909來源的麥芽寡糖基海藻糖 水解酶與硫氧還蛋白（Thioredoxin，Trx)融合表達(dá)，構(gòu)建基因工程菌pET-32a( + )-treZ/ E · col i Origami (DE3)。與對(duì)照pET-24a( + )-treZ/E · coli BL21 (DE3)相比，融合蛋白在宿主 菌中的可溶性表達(dá)有一定程度的提高，融合蛋白Trx-MTHase搖瓶發(fā)酵酶活為42.0U · mL一1， 是對(duì)照的4.0倍(MTHase 10.4U · mL-3。用腸激酶（Enterokinase)切除N-端Trx蛋白后， MTHase酶活為切除前的1.31倍，為對(duì)照的5.2倍。
[0018] (2)本發(fā)明構(gòu)建的基因工程菌pET-32a( + )-treZ/E.coli 0rigami(DE3)，具有高產(chǎn) 麥芽寡糖基海藻糖水解酶的性質(zhì)，用于發(fā)酵罐生產(chǎn)，最高酶活力可達(dá)204.0U · ml/1，能夠解 決現(xiàn)有發(fā)酵工藝中酶活力較低、生產(chǎn)成本高的問題，在盡量不影響麥芽寡糖基海藻糖水解 酶酶學(xué)性質(zhì)和轉(zhuǎn)化率的基礎(chǔ)上提高其可溶性表達(dá)，為其工業(yè)化生產(chǎn)創(chuàng)造條件。
【附圖說明】
[0019] 圖1、50D重組菌發(fā)酵破壁上清及破壁沉淀(搖瓶)SDS-PAGE電泳圖。
[0020] M:分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1 :E · coli BL21 (DE3)/pET-24a( + )-treZ細(xì)胞破壁上清；2 : E.coli Origami (DE3)/pET-32a( + )-treZ 細(xì)胞破壁上清；3 :E. coli BL21(DE3)/pET-24a (+) -treZ細(xì)胞破壁沉淀;4: E · co 1 i Origarni (DE3) /pET-32a(+) -treZ細(xì)胞破壁沉淀.
[0021]圖2、不同誘導(dǎo)時(shí)間，重組菌3.6L發(fā)酵罐發(fā)酵產(chǎn)酶曲線。
[0022 ]圖3、不同誘導(dǎo)溫度，重組菌3.6L發(fā)酵罐發(fā)酵產(chǎn)酶曲線。
[0023]圖4、不同乳糖流加速度，重組菌3.6L發(fā)酵罐發(fā)酵產(chǎn)酶曲線。
[0024]圖5、重組菌3L罐發(fā)酵破壁上清SDS-PAGE電泳圖，下劃線部分為目的蛋白。
[0025] M:分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1:誘導(dǎo)Oh細(xì)胞破壁上清;2-10:誘導(dǎo)3-27h細(xì)胞破壁上清.
【具體實(shí)施方式】 [0026] 培養(yǎng)基：
[0027] (1)LB固體培養(yǎng)基的組成為：分子級(jí)蛋白胨9-llg/L，分子級(jí)酵母粉4_6g/L，NaCl 9-1 lg/L，瓊脂粉 1.5-2 %。
[0028] (2)LB液體培養(yǎng)基的組成為：分子級(jí)蛋白胨9-1 lg/L，分子級(jí)酵母粉4-6g/L，NaCl 9-llg/L，pH 6·8-7·2。
[0029] (3)ΤΒ發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：甘油4-6g/L，工業(yè)級(jí)酵母粉23-25g/L，工業(yè)級(jí)蛋白胨 11 -13g/L，KH2P〇42 · 2-2 · 4g/L，K2HPO416-17g/L。
[0030] (4)種子培養(yǎng)基：（工業(yè)級(jí)蛋白胨10g/L，工業(yè)級(jí)酵母粉5g/L，NaCL 10g/L，100mg/L 卡那霉素 ，pH 7.00)
[0031] (5)發(fā)酵培養(yǎng)基為：甘油8g/L，蛋白胨 12g/L，酵母粉24g/L，（NH4)2HP〇44 · Og/L， KH2P〇4l3.5g/L，檸檬酸 1.7g/L，MgS〇4 · 7H20 1.4g/L，微量元素液 10mL/L。還可以添加 100μ g/mL卡那霉素。
[0032] (6)微量元素液為：FeS〇4 · 7H20 10.0g/L，ZnS〇4 · 7H20 5.3g/L，CuS〇4 · 5H20 3.0g/L，MnS〇4.4H20 0.5g/L，Na2B4〇7· IOH2O 0.23g/L，CaCl22.0g/L，（NH4)6M〇7〇24〇.lg/L〇
[0033] (7)補(bǔ)料培養(yǎng)基為:蛋白胨 12g/L，酵母粉24g/L，MgS〇4 · 7H20 15g/L，甘油300g/L。
[0034] 實(shí)施例l:pET-32a( + )-treZ/E·coli0rigami(DE3)的構(gòu)建
[0035] PCR擴(kuò)增麥芽寡糖基海藻糖水解酶基因 treZ(核苷酸序列是SEQ ID N0.1)，將所得 到的treZ基因片段與經(jīng)EcoR I和Hind III酶切純化后的載體pET-32a( + )，用T4DNAligase 4°C連接16h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化克隆宿主E.coli JM109涂布LB固體培養(yǎng)基(含100yg .1111/1氨芐 青霉素），37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)8h，挑取單菌落，經(jīng)LB液體培養(yǎng)基(含100yg ?ml/1氨芐青霉素)37 °C培養(yǎng)8h后，收集菌體抽提質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證，然后對(duì)驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒測(cè)定DNA序列，得到 重組質(zhì)粒pET-32a( + )-treZ。pET-32a( + )載體含有硫氧還蛋白（TrxA)融合標(biāo)簽，硫氧還蛋白 (thioredoxin A，TrxA)是一種序列保守的小分子蛋白，分子量約為12kDa。
[0036] 將重組質(zhì)粒pET-32a( + )-treZ化轉(zhuǎn)表達(dá)宿主E.coli 0rigami(DE3)，涂布LB固體培 養(yǎng)基(含lOOyg · ml/1氨芐青霉素），37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h，挑取單菌落，經(jīng)LB液體培養(yǎng)基(含 100yg · ml/1氨芐青霉素)37°C培養(yǎng)8h后保甘油菌。
[0037] PCR擴(kuò)增treZ基因所用引物：
[0038] F:5 '-CGGAATTCATGTTTAGCTTTGGCGGCAA-3' 28bp
[0039] R:5 '-CCAAGCTTATTCCAGTTGATACACGC-3' 26bp
[0040] 實(shí)施例2搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酶
[0041 ] 1、將以pET-24a( + )為載體、E.coli BL21(DE3)為宿主構(gòu)建的重組菌pET-24a( + )_ treZ/E.coli BL21(DE3)和pET-32a( + )-treZ/E.coli 0rigami(DE3)，用移液槍吸取 10μ1 菌 液分別接種于10mL LB液體培養(yǎng)基（加入終濃度30yg · ml/1卡那霉素或100yg · ml/1氨芐青 霉素）中，置于37 °C恒溫?fù)u床，200r · mirT1，培養(yǎng)8-10h，作為種子液。
[0042]將培養(yǎng)好的種子液以4%的接種量接入40mL TB培養(yǎng)基（加入終濃度30yg · mL-1卡 那霉素或l〇〇yg · mL-1氨芐青霉素）中，置于37°C恒溫?fù)u床，轉(zhuǎn)速200r · min-S培養(yǎng)2h;加入 終濃度0.05-0.4mmol · L-hPTGJSr，轉(zhuǎn)速200r · min-1，培養(yǎng)24-48h。發(fā)酵液離心去上清， 收集菌體，用等體積20mmol · I^pH 8.0 Tris-HCl緩沖液復(fù)溶，經(jīng)超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)破碎細(xì) 胞，離心取上清液，得到粗酶液。
[0043] 2、麥芽寡糖基海藻糖水解酶酶活力分析
[0044] (1)酶活單位定義
[0045]采用3,5_二硝基水揚(yáng)酸法(DNS法)測(cè)定麥芽寡糖基海藻糖合成酶酶活時(shí)，每分鐘 轉(zhuǎn)化麥芽三糖基海藻糖生成lymol海藻糖所需的酶量作為一個(gè)活力單位。
[0046] (2)酶活力測(cè)定步驟
[0047] 預(yù)熱:取0.49mL的1 %麥芽五糖溶液(50mM pH5.5磷酸鹽緩沖液)于試管中，置于60 °C水浴鍋中預(yù)熱1 Omin。
[0048]反應(yīng):加入0.05mL麥芽寡糖基海藻糖合成酶酶液，振蕩均勻，60°C反應(yīng)lh，沸水浴 煮沸l(wèi)Omin終止反應(yīng)，冷卻;加入0.05mL麥芽寡糖基海藻糖水解酶發(fā)酵胞內(nèi)粗酶液，振蕩均 勻，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)lOmin，加入lmL DNS振蕩均勻，沸水浴煮沸7min，冷卻。
[0049] 測(cè)量：向上述反應(yīng)體系中加入蒸餾水并定容至10mL，混勻。在540nm波長下測(cè)定吸 光值并計(jì)算酶活力。
[0050] 3、圖1為搖瓶發(fā)酵24h時(shí)重組菌破壁上清的SDS-PAGE蛋白電泳圖，蛋白電泳結(jié)果顯 示在約59kDa和71kDa處有一條明顯條帶，與理論麥芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)和融合 表達(dá)麥芽寡糖基海藻糖水解酶(Trx-MTHase)分子量相符。經(jīng)酶活檢測(cè)，融合表達(dá)麥芽寡糖 基海藻糖水解酶(Trx-MTHase)胞內(nèi)酶活為42.0U ?mL-1(胞外未檢測(cè)到酶活），為非融合表 達(dá)麥芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)的4.0倍。用腸激酶(Enterokinase)切除N-端Trx蛋 白，麥芽寡糖基海藻糖水解酶酶活力提高，為切除前的1.31倍，為非融合表達(dá)時(shí)酶活5.2倍。 此時(shí)，麥芽寡糖基海藻糖水解酶酶活力為55.0U · ml/1。
[0051 ]實(shí)施例3不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)重組菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響
[0052] 1、種子培養(yǎng):將-80°C甘油管保存的pET-32a( + )-treZ/E.coli Origami(DE3)菌株 接入種子培養(yǎng)基中，使用恒溫?fù)u床進(jìn)行培養(yǎng)，溫度37°C，轉(zhuǎn)速200rpm，培養(yǎng)8h。
[0053] 2、發(fā)酵產(chǎn)酶：
[0054]將種子液以8 %接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基。通過控制攪拌轉(zhuǎn)速和通風(fēng)量使溶氧維持 30%，控制溫度為37°C，流加25 % (v/v)的氨水控制pH在7.0。待最初的甘油消耗完后，溶氧 上升至80-100%，則分批發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束。以比生長速率以=0.21^指數(shù)流加的方式補(bǔ)加補(bǔ)料 培養(yǎng)基。選擇在菌濃OD600達(dá)到30、40和50時(shí)開始以0.4g · I/1 · 1Γ1流速恒速流加乳糖進(jìn)行誘 導(dǎo)。在30°C下誘導(dǎo)產(chǎn)酶，溶氧維持在30%，pH控制在7.0左右。誘導(dǎo)24h左右。發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束 后，0D 6QQ等于40條件下誘導(dǎo)時(shí)，麥芽寡糖基海藻糖水解酶酶活最高，達(dá)到184.0U · ml/1(圖 2)〇
[0055] 實(shí)施例4不同誘導(dǎo)溫度對(duì)重組菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響
[0056] 1、種子培養(yǎng):將-80°C甘油管保存的pET-32a( + )-treZ/E.coli Origami(DE3)菌株 接入種子培養(yǎng)基中，使用恒溫?fù)u床進(jìn)行培養(yǎng)，溫度37°C，轉(zhuǎn)速200rpm，培養(yǎng)8h。
[0057] 2、發(fā)酵產(chǎn)酶：
[0058]將種子液以8 %接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基。通過控制攪拌轉(zhuǎn)速和通風(fēng)量使溶氧維持 30%，控制溫度為37°C，流加25 % (v/v)的氨水控制pH在7.0。待最初的甘油消耗完后，溶氧 上升至80-100%，則分批發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束。以比生長速率以=0.21^指數(shù)流加的方式補(bǔ)加補(bǔ)料 培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到〇D6Q() = 40時(shí)，開始以0.4g · I/1 · IT1流速恒速流加乳糖進(jìn)行誘導(dǎo)， 誘導(dǎo)溫度分別35°C、30 °C、25 °C，溶氧維持在30 %，pH控制在7.0左右。誘導(dǎo)24h左右。發(fā)酵培 養(yǎng)結(jié)束后，30°C誘導(dǎo)24h，麥芽寡糖基海藻糖水解酶酶活力最高，達(dá)到193.0U · mL-1 (圖3)。
[0059] 實(shí)施例5不同乳糖流加速度對(duì)重組菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響
[0060] 1、種子培養(yǎng):將-80°C甘油管保存的pET-32a( + )-treZ/E.coli Origami(DE3)菌株 接入種子培養(yǎng)基中，使用恒溫?fù)u床進(jìn)行培養(yǎng)，溫度37°C，轉(zhuǎn)速200rpm，培養(yǎng)8h。
[0061 ] 2、發(fā)酵產(chǎn)酶：
[0062]將種子液以8%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基。通過控制攪拌轉(zhuǎn)速和通風(fēng)量使溶氧維持 30%，控制溫度為37°C，流加25 % (v/v)的氨水控制pH在7.0。待最初的甘油消耗完后，溶氧 上升至80-100%，則分批發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束。以比生長速率以=0.21^指數(shù)流加的方式補(bǔ)加補(bǔ)料 培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到〇D_ = 40時(shí)，分別采用O.lg · I/1 · h'OJg · I/1 · h'Odg · L 一1 · h-So.Sg · L-1 · h-1恒速流加乳糖進(jìn)行誘導(dǎo)。溶氧維持在30%，pH控制在7.0左右。誘導(dǎo) 24h左右。當(dāng)乳糖流加速率為0.2g · I/1 · 1Γ1時(shí)，麥芽寡糖基海藻糖水解酶酶活達(dá)到最高值 204U · mL-1(圖4)。
[0063]雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范 圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種高產(chǎn)麥芽寡糖基海藻糖水解酶的基因工程菌，其特征在于，以pET-32a( + )載體， 以E. coli Origami(DE3)為表達(dá)宿主，表達(dá)麥芽寡糖基海藻糖水解酶。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，編碼所述麥芽寡糖基海藻糖水解酶 的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。3. -種構(gòu)建權(quán)利要求1或2所述的基因工程菌的方法，其特征在于，將核苷酸序列為SEQ ID NO. 1的麥芽寡糖基海藻糖水解酶基因連接到表達(dá)載體pET-32a( + )上，然后再轉(zhuǎn)化到大 腸桿菌E · coli Origami (DE3)中，得到基因工程菌pET_32a(+ )_treZ/E · coli Origami (DE3)〇4. 一種應(yīng)用權(quán)利要求1或2所述基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)麥芽寡糖基海藻糖水解酶的方法， 其特征在于，包括：（1)分批發(fā)酵階段:將種子液以8%-10%接種量接種于發(fā)酵罐中，控制溫 度36-38 °C、初始轉(zhuǎn)速 180-200rpm、初始通氣量7L/min、溶氧28-32 %、pH 6.8-7.2; (2)補(bǔ)料 發(fā)酵階段:待溶氧上升至80-100%，以控制比生長速率以=0.21^的指數(shù)流加的方式進(jìn)行補(bǔ) 料培養(yǎng)，控制溫度36-38°(：、溶氧28-32%、？!16.8-7.2;(3)誘導(dǎo)培養(yǎng)階段 ：當(dāng)菌體細(xì)胞濃度 達(dá)到OD600為30-50時(shí)，以流速0.1-0.8g · I/1 · 1Γ1流加乳糖誘導(dǎo)產(chǎn)酶，控制溫度25-35 °C、溶 氧28-32%、口!16.8-7.2，誘導(dǎo)0-2711。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，誘導(dǎo)培養(yǎng)階段是當(dāng)菌體細(xì)胞濃度達(dá)到0D_ 為40時(shí)，開始流加乳糖誘導(dǎo)產(chǎn)酶。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，誘導(dǎo)培養(yǎng)階段控制溫度30°C。7. 權(quán)利要求1或2所述的基因工程菌在生產(chǎn)海藻糖中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12P19/12GK105969713SQ201610343218
【公開日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年5月23日
【發(fā)明人】吳敬, 宿玲恰, 吳世雄
【申請(qǐng)人】江南大學(xué)