本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，特別涉及一株高產(chǎn)琥珀酸的基因工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

琥珀酸，又名丁二酸，是三羧酸循環(huán)(tca)的中間產(chǎn)物，同時(shí)也是許多厭氧微生物能量代謝的主要末端產(chǎn)物。作為一種優(yōu)秀的c4平臺(tái)化合物，琥珀酸具有重要的應(yīng)用價(jià)值，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、染料、香料、油漆、塑料等行業(yè)，同時(shí)也可合成一些重要的化工產(chǎn)品如丁二醇、四氫呋喃、γ-丁內(nèi)酯、2-吡咯烷酮等；另外，琥珀酸還可用來(lái)合成可降解的生物聚合物，如聚丁烯琥珀酸酯(pbs)和聚酰胺。

微生物法生產(chǎn)丁二酸具有高效率和環(huán)保性等特點(diǎn)，因而被廣泛研究。在琥珀酸生產(chǎn)菌株中，大腸桿菌由于其遺傳背景清楚，易操作易調(diào)控，培養(yǎng)基要求簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)被廣泛用于研究以獲得高產(chǎn)琥珀酸生產(chǎn)菌株。目前，利用重組e.coli發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸發(fā)酵模式主要包括有氧發(fā)酵、有氧-厭氧兩階段發(fā)酵以及一步厭氧發(fā)酵三種模式。與其他兩種相比，采用一步厭氧發(fā)酵時(shí)，琥珀酸的比生產(chǎn)強(qiáng)度及理論最大收率均高于其它兩種模式，并且可全過(guò)程固定co2。然而目前生產(chǎn)菌株的琥珀酸收率僅為80％左右，遠(yuǎn)低于理論收率113％。這是由于在厭氧合成琥珀酸的代謝過(guò)程中，1mol葡萄糖經(jīng)糖酵解至c3產(chǎn)生2mol的nadh，而從c3至形成2mol琥珀酸需要消耗4mol的nadh，還原力不足是厭氧條件下琥珀酸收率較低的主要原因。此外，生物法制備琥珀酸主要是以糖類作為碳源，但這些糖類物質(zhì)的成本較高，限制了微生物法制備丁二酸的工業(yè)化。因此，若能以廉價(jià)的還原性底物為原料，不僅能有效提高還原力的供給，還能在一定程度上降低成本。

甲醇是煤化工產(chǎn)業(yè)中的重要產(chǎn)品，近年來(lái)，隨著甲醇生產(chǎn)工藝的發(fā)展，使得甲醇的價(jià)格持續(xù)走低，因而利用甲醇作為發(fā)酵原料成為生物轉(zhuǎn)化過(guò)程降低成本的重要突破口。此外，在甲醇利用的磷酸核酮糖循環(huán)途徑中每同化一分子甲醇即可產(chǎn)生一分子nadh，因而可以為琥珀酸的合成提供足夠的還原力，進(jìn)而提高代謝速率，增加產(chǎn)物的濃度。因此，若能通過(guò)合成生物學(xué)手段，將甲醇代謝模塊引入大腸桿菌中，以葡萄糖和甲醇作為共同碳源，可在細(xì)胞水平上增強(qiáng)還原力的供給，驅(qū)動(dòng)琥珀酸的高效合成。

技術(shù)方案

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種利用合成生物學(xué)方法構(gòu)建可以利用甲醇作為碳源進(jìn)行代謝的菌株，并利用該菌株厭氧發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸，解決了傳統(tǒng)發(fā)酵存在的琥珀酸收率低的技術(shù)問(wèn)題。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一株高產(chǎn)琥珀酸的基因工程菌，它是在宿主菌中導(dǎo)入甲醇脫氫酶基因mdh2、3-己糖-6-磷酸合酶基因hps和3-己糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因phi；其中甲醇脫氫酶基因mdh2將甲醇氧化成甲醛，并產(chǎn)生nadh，甲醛和核酮糖-5磷酸在3-己糖-6-磷酸合酶基因hps的催化下轉(zhuǎn)化成己糖-6-磷酸，隨后己糖-6-磷酸在3-己糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因phi的催化下異構(gòu)成果糖-6-磷酸，進(jìn)而進(jìn)入糖酵解途徑參與物質(zhì)循環(huán)和能力代謝。

其中，所述的宿主菌為大腸桿菌e.colibl21或大腸桿菌cctccno:m2012351，優(yōu)選大腸桿菌cctccno:m2012351。本發(fā)明中使用的大腸埃希氏菌(escherichiacoli)ber208的保藏日期為2012年09月14日，保藏單位全稱為中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，簡(jiǎn)稱cctcc，地址為：中國(guó).武漢.武漢大學(xué)，其保藏編號(hào)為cctccno:m2012351，其具體信息已經(jīng)在申請(qǐng)?zhí)枮?01210392035.5的中國(guó)專利中詳細(xì)公開(kāi)。

其中，所述甲醇脫氫酶基因mdh2來(lái)源于甲醇芽孢桿菌bacillusmethanolicus，其基因序列如seqidno:3所示。

其中，所述3-己糖-6-磷酸合酶基因hps來(lái)源于枯草芽孢桿菌bacillussubtilis168，其genbank登記號(hào)為cab12140.1。

其中，所述3-己糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因phi來(lái)源于枯草芽孢桿菌bacillussubtilis168，其genbank登記號(hào)為cab12139.1。

上述高產(chǎn)琥珀酸的基因工程菌的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

(1)將seqidno:3和seqidno:8所示的序列克隆至表達(dá)載體中，得到重組質(zhì)粒；

(2)將步驟(1)得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞中，得到高產(chǎn)琥珀酸的基因工程菌。

優(yōu)選，所述表達(dá)載體為optptrc99a。

優(yōu)選，所述宿主菌為大腸桿菌cctccno:m212315。

具體的構(gòu)建方法如下：

(1s)以表達(dá)載體ptrc99a為模板，設(shè)計(jì)具有一系列同尾酶酶切位點(diǎn)的一對(duì)引物，將pcr產(chǎn)物自連，獲得符合biobrick標(biāo)準(zhǔn)的表達(dá)載體optptrc99a；

(2s)利用基因合成的方法合成甲醇芽孢桿菌bacillusmethanolicus來(lái)源的甲醇脫氫酶基因mdh2(seqidno:3)，并對(duì)其進(jìn)行密碼子優(yōu)化；設(shè)計(jì)引物，將其連接到表達(dá)載體optptrc99a中，構(gòu)建質(zhì)粒optptrc99a-mdh2；

(3s)以枯草芽孢桿菌bacillussubtilis168基因組為模板，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增3-己糖-6-磷酸合酶基因hps和3-己糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因phi，將其連接到質(zhì)粒optptrc99a，構(gòu)建質(zhì)粒optptrc99a-si；

(4s)對(duì)質(zhì)粒optptrc99a-mdh2進(jìn)行nhei、sali雙酶切，質(zhì)粒optptrc99a-si進(jìn)行avrii、sali雙酶切，將酶切后的片段做t4連接，轉(zhuǎn)化至e.colidh5α中，經(jīng)質(zhì)粒酶切和菌落pcr驗(yàn)證，獲得optptrc99a-msi。

(5s)將質(zhì)粒optptrc99a-msi和optptrc99a分別導(dǎo)入到實(shí)驗(yàn)室自主優(yōu)化的大腸桿菌ber208中，獲得重組大腸桿菌ber308和重組大腸桿菌ber408，以實(shí)現(xiàn)基因的同時(shí)表達(dá)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)甲醇的代謝，以大腸桿菌ber308作為對(duì)照菌株進(jìn)行發(fā)酵性能考察。

上述高產(chǎn)琥珀酸的基因工程菌在發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸中的應(yīng)用。

優(yōu)選地，發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸包括以下步驟：

(1a)種子培養(yǎng)：將高產(chǎn)琥珀酸的基因工程菌接種到種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)10～12h，獲得種子培養(yǎng)液；

(2a)發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸：將種子培養(yǎng)液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至od550＝0.8～1.2，添加終濃度為0.1mm的誘導(dǎo)劑iptg和終濃度為200mm的甲醇，再厭氧發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間為48h。

優(yōu)選地，所述種子培養(yǎng)基為nbs培養(yǎng)基，其配方如下：甜菜堿0.12g/l，三水磷酸氫二鉀6.54g/l，磷酸二氫鉀3.5g/l，磷酸氫二銨3.5g/l，七水硫酸鎂0.25g/l，二水氯化鈣15.0mg/l，維生素b10.5mg/l，六水氯化鐵1.6mg/l，六水氯化鈷0.2mg/l，二水氯化銅0.1mg/l，四水氯化鋅0.2mg/l，二水鉬酸鈉0.2mg/l，硼酸0.05mg/l，葡萄糖30g/l，溶劑為水。

優(yōu)選地，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方如下：磷酸二氫銨0.87g/l，磷酸氫二銨2.6g/l，氯化鉀0.15g/l，七水硫酸鎂0.37g/l，六水氯化鐵2.4mg/l，六水氯化鈷0.3mg/l，二水氯化銅0.15mg/l，四水氯化鋅0.5mg/l，二水鉬酸鈉0.5mg/l，硼酸0.075mg/l，四水氯化錳0.5mg/l，葡萄糖30g/l，溶劑為水。

具體的種子液培養(yǎng)過(guò)程如下：將重組大腸桿菌ber208/optptrc99a-msi按1～2％(v/v)接種量從凍存管接種到種子培養(yǎng)基中，100ml三角瓶裝液量20ml，35～37℃有氧培養(yǎng)10～12h，獲得種子培養(yǎng)液。

搖瓶發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸具體過(guò)程如下：將種子培養(yǎng)液按10％(v/v)接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃，200rpm培養(yǎng)至od550＝1.0，添加終濃度為0.1mm的誘導(dǎo)劑iptg和200mm的甲醇，充二氧化碳3～5min，發(fā)酵溫度37℃，發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間為48h。

發(fā)酵罐中發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸的具體過(guò)程如下：將種子培養(yǎng)液接種到裝有1.5l發(fā)酵培養(yǎng)基的3l發(fā)酵罐中，接種量10％(v/v)，初始葡萄糖100g/l，連續(xù)通入二氧化碳，發(fā)酵溫度37℃，至od550＝1.0時(shí)添加終濃度為0.1mm的iptg和200mm的甲醇，連續(xù)通入二氧化碳，發(fā)酵溫度37℃，發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間為106h。

有益效果：

通過(guò)本發(fā)明的方法可實(shí)現(xiàn)大腸桿菌以非食品級(jí)原料甲醇作為輔助碳源生產(chǎn)琥珀酸，并為琥珀酸的生物合成提供充足的還原力，不僅可提高琥珀酸的產(chǎn)量和收率，還在一定程度上降低了生產(chǎn)成本，具有重大的社會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

附圖說(shuō)明：

圖1重組質(zhì)粒optptrc99a-msi構(gòu)建圖。

圖2原始菌和重組菌在3l發(fā)酵罐中原料消耗趨勢(shì)圖。

圖3原始菌和重組菌在3l發(fā)酵罐中產(chǎn)物合成趨勢(shì)圖。

圖4不同甲醇濃度下，重組菌株的生長(zhǎng)和產(chǎn)酸情況。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑獲得。

ptrc99a載體：本實(shí)驗(yàn)室自主保存。

大腸桿菌ber208保藏日期為2012年09月14日，保藏單位全稱為中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，簡(jiǎn)稱cctcc，地址為：中國(guó).武漢.武漢大學(xué)，其保藏編號(hào)為cctccno:m2012351，其具體信息已經(jīng)在申請(qǐng)?zhí)枮?01210392035.5的中國(guó)專利中詳細(xì)公開(kāi)。

實(shí)施例1：表達(dá)載體optptrc99a的獲得

為了能夠快速有效的實(shí)現(xiàn)多基因的表達(dá)，本實(shí)施方式根據(jù)biobrick標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)一對(duì)引物p1(seqidno.1)、p2(seqidno.2)，以載體optptrc99apcr為模板，將擴(kuò)增獲得的片段做t4連接，導(dǎo)入e.colidh5α后篩選獲得優(yōu)化后的表達(dá)載體optptrc99a。實(shí)施例2：利用合成生物學(xué)方法構(gòu)建重組大腸桿菌ber208-optptrc99a-msi。

1、甲醇脫氫酶mdh2來(lái)源于甲醇芽孢桿菌bacillusmethanolicus，并根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性對(duì)基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，其優(yōu)化后的核苷酸序列如seqidno.3所示，送至蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行基因合成,。

2、根據(jù)人工合成獲得密碼子優(yōu)化的甲醇脫氫酶基因，設(shè)計(jì)上游引物p3(seqidno.4)、下游引物p4(seqidno.5)，經(jīng)pcr擴(kuò)增后利用onestepcloningkit(vazyme,c112-02)連接到表達(dá)載體optptrc99a上，轉(zhuǎn)化至e.colidh5α中，經(jīng)質(zhì)粒酶切和菌落pcr驗(yàn)證，獲得質(zhì)粒optptrc99a-mdh2。

3、3-己糖-6-磷酸合酶(hps)和3-己糖-6-磷酸異構(gòu)酶(phi)總是相輔相成的，兩者的表達(dá)與作用會(huì)相互影響，而且兩者的基因也緊鄰，因此本實(shí)施方式將二者作為一個(gè)整體來(lái)設(shè)計(jì)引物。根據(jù)ncbi上公布的基因序列，設(shè)計(jì)上游引物p5(seqidno.6)、下游引物p6(seqidno.7)，以枯草芽孢桿菌bacillussubtilis168基因組為模板，pcr擴(kuò)增得到目的基因，其核苷酸序列如seqidno.8所示。利用onestepcloningkit(vazyme,c112-02)將pcr產(chǎn)物連接到表達(dá)載體optptrc99a上，轉(zhuǎn)化至e.colidh5α中，經(jīng)質(zhì)粒酶切和菌落pcr驗(yàn)證，獲得質(zhì)粒optptrc99a-si。

4、對(duì)質(zhì)粒optptrc99a-mdh2進(jìn)行nhei、sali雙酶切，質(zhì)粒optptrc99a-si進(jìn)行avrii、sali雙酶切，將酶切后的片段做t4連接，轉(zhuǎn)化至e.colidh5α中，經(jīng)質(zhì)粒酶切和菌落pcr驗(yàn)證，獲得optptrc99a-msi。

5、將optptrc99a-msi導(dǎo)入大腸桿菌ber208中，經(jīng)質(zhì)粒酶切和菌落pcr驗(yàn)證，獲得重組大腸桿菌ber208/optptrc99a-msi(大腸桿菌ber308)。

實(shí)施例3：重組菌株的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

1.種子培養(yǎng)：將重組大腸桿菌ber308按1～2％(v/v)接種量從凍存管接種到種子培養(yǎng)基中，100ml三角瓶裝液量20ml，35～37℃有氧培養(yǎng)10～12h，獲得種子培養(yǎng)液。

2.發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸：將種子培養(yǎng)液按10％(v/v)接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃，200rpm培養(yǎng)至od550＝1.0，添加終濃度為0.1mm的誘導(dǎo)劑iptg和200mm的甲醇，充二氧化碳3～5min，發(fā)酵溫度37℃，發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間為48h。

3.重組大腸桿菌ber308在3l發(fā)酵罐中生產(chǎn)琥珀酸：將種子培養(yǎng)液接種到裝有1.5l發(fā)酵培養(yǎng)基的3l發(fā)酵罐中，接種量10％(v/v)，初始葡萄糖100g/l，連續(xù)通入二氧化碳，發(fā)酵溫度37℃，至od550＝1.0時(shí)添加終濃度為0.1mm的iptg和200mm的甲醇，連續(xù)通入二氧化碳，發(fā)酵溫度37℃，發(fā)酵培養(yǎng)106h，發(fā)酵結(jié)果如圖2和圖3所示。結(jié)果表明，重組大腸桿菌ber308的甲醇消耗量、琥珀酸產(chǎn)量和收率為25mm、68.7g/l和0.976g/g，分別是對(duì)照菌株大腸桿菌ber208的1.92倍、1.12和1.08倍。

實(shí)施例4：重組菌株的甲醇耐受實(shí)驗(yàn)。

1.種子培養(yǎng)：將大腸桿菌ber308、大腸桿菌ber208按1～2％(v/v)接種量從凍存管分別接種到種子培養(yǎng)基中，100ml三角瓶裝液量20ml，35～37℃有氧培養(yǎng)10～12h，獲得種子培養(yǎng)液。

2.發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸：將種子培養(yǎng)液按10％(v/v)接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃，200rpm培養(yǎng)至od550＝1.0，添加終濃度為0.1mm的誘導(dǎo)劑iptg和不同濃度的甲醇，充二氧化碳3～5min，發(fā)酵溫度37℃，發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間為48h。結(jié)果如圖4所示，在不同甲醇濃度條件下，表達(dá)甲醇代謝途徑的重組大腸桿菌ber308的最大細(xì)胞密度和琥珀酸產(chǎn)量都明顯高于對(duì)照菌株，并具有較好的甲醇耐受性，即使甲醇濃度達(dá)到600mm，菌體仍具有良好的生長(zhǎng)性能。

sequencelisting

<110>南京工業(yè)大學(xué)

<120>一株高產(chǎn)琥珀酸的基因工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用

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