本發(fā)明涉及一種用于生產(chǎn)2-羥基吩嗪的基因工程菌株及其制備方法和用途，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

吩嗪衍生物是一類含氮雜環(huán)化合物，一般都有一定顏色，具有特定的吸收波譜，這是由于雜環(huán)上存在不同的取代基所致，這決定了它們不同的理化性質(zhì)及抑制植物和動物病原菌的生物活性。幾乎所有的吩嗪化合物對細菌和真菌都有生物防治活性。吩嗪化合物具有一定的氧化還原活性，在細胞中可能作為電子載體，當(dāng)細胞進行氧化還原反應(yīng)時，將電子傳遞到靶細胞，導(dǎo)致靶細胞中超氧化物的氧自由基增加而使細胞死亡。

天然吩嗪化合物具有廣譜的抗菌活性，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了近100種具有相似結(jié)構(gòu)的天然吩嗪類化合物，不僅對小麥全蝕病、水稻枯萎病等病原菌有顯著的抑制作用，還可用于肺結(jié)核、白血病、結(jié)核桿菌和非典型耐酸桿菌及麻風(fēng)病等疾病的治療，已經(jīng)在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)領(lǐng)域越來越引起人們的重視。天然吩嗪化合物主要由細菌或放線菌產(chǎn)生合成，主要包括吩嗪-1-羧酸(PCA)、1-羥基吩嗪(1-hydroxyphenazine)、2-羥基吩嗪(2-hydroxyphenazine)，綠膿菌素(pyocyanin)和吩嗪-1-羧酰胺(phenazine-1-carboxamide)等。Kiprianova等人曾對PCA、2-羥基吩嗪-1-羧酸和2-羥基吩嗪的抗菌性進行過研究比較，發(fā)現(xiàn)在對細菌、真菌和動植物病菌的拮抗作用中，2-羥基吩嗪的抗菌性是最強的[Smirnov V V,Kiprianova E A.Bacteria of Psedunomonas genus.Naukova Dumka,Kiev,Ukraine,1990:100-111.]。Thomashow L.S.等人也做過相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)同時合成吩嗪-1-羧酸和2-羥基吩嗪的菌株比只產(chǎn)吩嗪-1-羧酸菌株的抗菌活性要強很多[Delaney S M,Mavrodi D V,Bonsall R F,et al.phzO,a gene for biosynthesis of2-hydroxylated phenazine compounds in Psedunomonas aureofaciens 30-84.Journal of Bacteriology,2001,183(1):318-327.]。本課題組張雪洪的專利CN200610117059.4中，綠針假單胞菌GP72的主要活性物質(zhì)即為吩嗪-1-羧酸、2-羥基吩嗪-1-羧酸和2-羥基吩嗪，其活菌制劑可用于對辣椒、黃瓜、冬瓜、南瓜、番茄、茄子、韭菜、大蒜、菜豆、豇豆的疫病防治；用于對油菜菌核病、黃瓜枯萎病、西瓜枯萎病、西瓜炭疽病、棉花立枯病、水稻紋枯病的防治；還可以作為蔬菜生長促進劑使用，提高蔬菜產(chǎn)量。由此可見，2-羥基吩嗪存在巨大的抗生潛力，因此大規(guī)模制備2-羥基吩嗪具有重大的意義

在人工培養(yǎng)條件下，部分微生物可以大量合成較高濃度的吩嗪化合物，比如綠針假單胞菌HT66能夠高水平合成吩嗪-1-甲酰胺(彭華松等，ZL 2013 1 0566864.5)。然而，研究發(fā)現(xiàn)目前能分泌2-羥基吩嗪的綠針假單胞菌菌株，其合成效率都不高，無法實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，對研究2-羥基吩嗪的抑菌作用、代謝調(diào)控及其工業(yè)化應(yīng)用等都造成了障礙。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種用于生產(chǎn)2-羥基吩嗪的基因工程菌株及其制備方法和用途。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

第一方面，本發(fā)明提供了一種用于生產(chǎn)2-羥基吩嗪的基因工程菌株，其特征在于，可通過如下方法獲得：

將綠針假單胞菌HT66(Psedunomonas chlororaphis HT66)CCTCCNO:M2013467及其衍生物基因組中的phzH基因(phzH的基因的堿基序列和對應(yīng)蛋白質(zhì)的氨基酸序列分別如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示)替換為外源的phzO基因，即得。

作為優(yōu)選方案，所述phzO基因來自綠針假單胞菌株GP72(參見Liu H,He Y,Jiang H,et al.Characterization of a phenazine-producing strain Psedunomonas chlororaphis GP72 with broad-spectrum antifungal activity from green pepper rhizosphere[J].Current microbiology,2007,54(4):302-306.)、菌株30-84(參見Pierson L S,Keppenne V D,Wood D W.Phenazine antibiotic biosynthesis in Psedunomonas aureofaciens 30-84is regulated by PhzR in response to cell density[J].Journal of Bacteriology,1994,176(13):3966-3974.)、菌株P(guān)a40(參見Jiao Z,Wu N,Hale L,et al.Characterisation of Psedunomonas chlororaphis subsp.aurantiaca strain Pa40with the ability to control wheat sharp eyespot disease[J].Annals of applied biology,2013,163(3):444-453.)或菌株O6(參見Cho S M,Kang B R,Han S H,et al.2R,3R-butanediol,a bacterial volatile produced by Psedunomonas chlororaphis O6,is involved in induction of systemic tolerance to drought in Arabidopsis thaliana[J].Molecular plant-microbe interactions,2008,21(8):1067-1075.)。

來源于綠針假單胞菌株GP72、30-84、Pa40、O6的phzO基因的堿基序列分別如SEQ ID NO3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示。

第二方面，本發(fā)明提供了一種如前述的用于生產(chǎn)2-羥基吩嗪的基因工程菌株的制備方法，其包括如下步驟：

1)重組質(zhì)粒的構(gòu)建；

2)雙親雜交；

3)基因替換突變株的篩選。

作為優(yōu)選方案，所述重組質(zhì)粒的構(gòu)建包括如下操作：

分別設(shè)計用于擴增phzH的上游同源臂引物F1和R1、下游同源臂引物F3和R3，以及phzO及其啟動子區(qū)域總片段的正反向引物F2和R2，并擴增相關(guān)片段；

通過Infusion體系連接質(zhì)粒pK18mobsacB，將phzO基因與phzH基因的上游片段和下游片段整合在一起；

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞；

其中，所述F1、R1、F2、R2、F3和R3的基因序列分別如SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12所示。

作為優(yōu)選方案，所述Infusion體系的用量為10μL，且Infusion體系中，pK18mobsacB質(zhì)粒3uL、infusion酶2μL、水2μL、phzO基因1μL、phzH上游同源臂1μL和phzH下游同源臂1μL。

作為優(yōu)選方案，所述雙親雜交包括如下操作：

將測序驗證正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌S17感受態(tài)細胞并測序驗證；

將綠針假單胞菌株HT66活化后，接種于液體KB培養(yǎng)基中，在28℃下培養(yǎng)12h；將攜帶質(zhì)粒的大腸桿菌S17接種于含50mg/L的Kan的LB培養(yǎng)基中，置37℃下180rpm的搖床中培養(yǎng)12h；

分別將綠針假單胞菌HT66和大腸桿菌S17菌液離心，以LB培養(yǎng)基分別重懸菌體，將二者以1:1的比例混合，并置于28℃培養(yǎng)箱中1h，使其發(fā)生接合轉(zhuǎn)移。

作為優(yōu)選方案，所述基因替換突變株的篩選依次采用單交換陽性克隆的篩選和雙交換陽性克隆篩選。

作為優(yōu)選方案，所述單交換陽性克隆篩選包括如下操作：

將菌株HT66與S17的混合菌液離心，棄去部分上清液，將菌體重懸后稀釋涂布于含濃度分別為100mg/L的Amp和50mg/L的Kan的LB平板上，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，挑取菌落以PCR擴增融合片段進行驗證。

作為優(yōu)選方案，所述雙交換陽性克隆篩選包括如下操作：

挑取單交換克隆以LB培養(yǎng)基重懸，并稀釋涂布于含有15％(w/v)蔗糖的LB平板上，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；將生長的菌落分別接種于LB平板和含50mg/L的Kan的LB平板中，接種位置一一對應(yīng)，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；選擇在Kan平板上不能長而在LB平板生長的菌落，使用外部引物F1和R3進行PCR驗證。

第三方面，本發(fā)明還提供了一種如前述的基因工程菌株在制備2-羥基吩嗪中的用途。

所述基因工程菌株在制備2-羥基吩嗪時的條件為：好氧培養(yǎng)；溫度：28～32℃；pH：6～8；轉(zhuǎn)速150～300rpm。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：

本發(fā)明基于一株高產(chǎn)吩嗪-1-甲酰胺的綠針假單胞菌HT66，該菌屬于植物根際細菌，安全可靠，營養(yǎng)需求簡單，副產(chǎn)物，發(fā)酵周期短，經(jīng)改造后其吩嗪化合物的產(chǎn)量達到3500mg/L的水平，具有良好的工業(yè)化應(yīng)用潛力。本專利將其中的phzH基因替換為外源的phzO基因，高濃度的吩嗪-1-羧酸不再轉(zhuǎn)為吩嗪-1-甲酰胺，而是作為底物在PhzO蛋白在作用下轉(zhuǎn)化為高水平的2-羥基吩嗪。

附圖說明

通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點將會變得更明顯：

圖1為phzO基因與phzH上下游同源臂的擴增產(chǎn)物電泳圖：a、phzO基因的擴增片段(L2)和phzH基因的上下游同源臂(分別為L1和L3)；b、以外部引物F1和R3對重組質(zhì)粒進行PCR驗證；c、以內(nèi)部引物F2和R2對此質(zhì)粒進行PCR驗證；

圖2為突變株中phzO基因的PCR產(chǎn)物電泳圖；

圖3為不同綠針假單胞菌株發(fā)酵液的HPLC圖譜：A、HT66菌株；B、GP72菌株；C、HT66-S菌株；

圖4為菌株HT66-O與HT66生長曲線對比圖；

圖5為菌株HT66-O中吩嗪-1-羧酸的發(fā)酵曲線；

圖6為菌株HT66-O中2-羥基吩嗪的發(fā)酵曲線。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明。以下實施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進。這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。

本發(fā)明的綠針假單胞菌(Psedunomonas choloraphis)HT66，該菌株已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)保藏，保藏單位地址為：中國.武漢.武漢大學(xué)，郵編為：430072，保藏日期為：2013年10月12日，保藏編號為：CCTCC NO∶M 2013467。

實施例1

本實施例涉及一種用于生產(chǎn)2-羥基吩嗪的基因工程菌株的制備方法，包括如下步驟：

根據(jù)綠針假單胞菌GP72基因組中phzO序列設(shè)計引物F2(5'GGTACCGAGATAAACATGCTTTGAAGTGC 3'，如SEQ ID NO.9)和R2(5'CTATTTGGCGTTGAGCCCCACCATA 3'，如SEQ ID NO.10)，通過PCR擴增phzO基因并純化；

根據(jù)綠針假單胞菌HT66基因組中phzH基因的上下游序列設(shè)計引物。上游引物為F1(5'ACATGATTACGAATTAGCCGCTGTTGGGTAAAGG 3'，如SEQ ID NO.7)和R1(5'GTTTATCTCGGTACCTCAGGGTTGCAAACGCC3'，如SEQ ID NO.8)，下游引物為F3(5'CTCAACGCCAAATAGTACGAGCCTGAGGGAGCCACGGCAG 3'，如SEQ ID NO.11)和R3(5'CGACTCTAGAGGATCATGGCCGAACCACCCTTGC 3'，如SEQ ID NO.12)，以該基因組DNA為模板，擴增基因組中的相應(yīng)片段，其電泳驗證結(jié)果見圖1a。

通過Infusion體系將phzO基因與phzH基因的上游片段和下游片段整合在一起并連接質(zhì)粒pK18mobsacB(Infusion體系10uL，其中pK18mobsacB質(zhì)粒3uL，infusion酶2uL，水2uL，目的基因及phzH上下游同源臂各1uL)，獲得體外突變質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化大腸桿菌S17。提取質(zhì)粒后分別以外部引物F1和R3對重組質(zhì)粒進行PCR驗證(結(jié)果見1b)，以內(nèi)部引物F2和R2對此質(zhì)粒進行PCR驗證(結(jié)果見圖1c)，由此可見phzO基因(長度為1.8kb)成功替換phzH基因。

將攜帶重組質(zhì)粒的S17菌株充分活化，接種于含有卡那霉素50mg/L的LB培養(yǎng)基中，37℃，180rpm培養(yǎng)12h。將充分活化的HT66菌株接種于LB培養(yǎng)基中，28℃，180rpm 培養(yǎng)12h。5000rpm離心后收集并洗滌兩種菌體，以LB培養(yǎng)基重懸。將菌株GP72：S17濃度以1:1的比例混合，置于28℃培養(yǎng)箱中1h，使其發(fā)生接合轉(zhuǎn)移。

取混合菌液點在LB平板中，28℃培養(yǎng)24h，刮取長出來的混合菌落于LB中重懸，稀釋涂布于卡那霉素50mg/L，氨芐霉素100mg/L的LB平板上，28℃培養(yǎng)2至3天后挑取單克隆涂布于含15％(w/v)蔗糖的LB平板中，28℃培養(yǎng)1至2天；挑取蔗糖平板上的單克隆，PCR驗證；挑取在卡那霉素50mg/L抗性平板上不生長，但在無抗平板上能夠正常生長的單菌落，即為同源重組成功的菌落。將該菌株命名為HT66-O。

以引物F2和R2對篩選的突變株進行PCR驗證(見圖2)，PCR擴增片段長度為1.8kb，與phzO基因大小一致，表明該基因已成功插入菌株HT66的基因組中。

實施例2

本實施例涉及不同綠針假單胞菌合成吩嗪化合物的比較，具體步驟為：

將三種綠針假單胞菌GP72、HT66和HT66-O的發(fā)酵液各取1.5mL到5mL離心管，首先用6N HCl調(diào)節(jié)pH值至2.0，接著用等體積的乙酸乙酯振蕩萃取，然后將該混合物在10000×g條件下離心10min，取有機相到新的離心管，并加入1/10體積的去離子水，振蕩后靜置分層。最后，將有機相減壓濃縮至干，產(chǎn)物用甲醇充分溶解后以高壓液相色譜(HPLC)分析。

HPLC檢測條件：檢測波長254nm，C18反相柱，流速1mL/min，柱溫30℃。流動相：水相為5mM乙酸銨溶液，有機相為甲醇，其混合梯度見表1。

表1流動相的混合梯度

HPLC檢測結(jié)果如圖3a、3b和3c所示，根據(jù)相關(guān)化合物標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖，吩嗪-1-羧酸(PCA)的出峰時間為2.8min，PCN的出峰時間為11.7min，2-羥基吩嗪的出峰時間為14.4min。將phzH基因替換為phzO基因后，菌株HT66-O的發(fā)酵液中化合物PCN消失，而2-羥基吩嗪化合物出現(xiàn)。

實施例3

本實施例涉及綠針假單胞菌基因工程菌合成2-羥基吩嗪，具體步驟為：

將綠針假單胞菌HT66和HT66-O分別在固體KB平板充分活化，然后挑取一環(huán)接種到裝有5mL KB液體培養(yǎng)基的小瓶中，置于28℃、180rpm的搖床轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)12h；再按1％比例放大接種到裝有50mL KB液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于28℃、180rpm的條件下發(fā)酵培養(yǎng)。定時取樣，用分光光度計測波長600nm處的光密度值，即OD600，用以表示細菌生長情況，并繪制菌株的生長曲線(如圖4)。結(jié)果表明，將基因phzH替換為phzO后，菌株的生長并未發(fā)現(xiàn)明顯的變化，有利于繼續(xù)合成吩嗪化合物。

將發(fā)酵液樣品進行預(yù)處理后以HPLC分析，測定其中吩嗪化合物的產(chǎn)量，吩嗪-1-羧酸和2-羥基吩嗪的產(chǎn)量分別如圖5和圖6所示。結(jié)合圖3的分析結(jié)果可知，當(dāng)phzH基因替換為phzO基因后，菌株HT66-O的發(fā)酵液中吩嗪化合物的總量及2-羥基吩嗪的產(chǎn)量均高于綠針假單胞菌GP72發(fā)酵液中對應(yīng)的吩嗪產(chǎn)量，表明該基因工程菌有利于進行2-羥基吩嗪的制備。

以上對本發(fā)明的具體實施例進行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述特定實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，這并不影響本發(fā)明的實質(zhì)內(nèi)容。