特異性識(shí)別組氨酸標(biāo)簽的納米抗體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體為針對(duì)組氨酸標(biāo)簽的單域重鏈抗體，其具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，可用于免疫檢測(cè)、抗原富集純化等領(lǐng)域。本發(fā)明所提供的氨基酸序列可以作為前體，通過隨機(jī)或定點(diǎn)突變技術(shù)進(jìn)行改造，能夠獲得性質(zhì)(親和性、特異性、穩(wěn)定性等)更好的突變體，用來發(fā)展進(jìn)一步用于醫(yī)藥、工業(yè)、農(nóng)業(yè)的蛋白質(zhì)或多肽。
【專利說明】
特異性識(shí)別組氨酸標(biāo)簽的納米抗體
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及單域重鏈抗體技術(shù)(又稱納米抗體技術(shù)），以及基因工程抗體技術(shù)，特 別是針對(duì)組氨酸標(biāo)簽的單域重鏈抗體或多肽。 技術(shù)背景
[0002] 組氨酸(His)標(biāo)簽，通常由6和組氨酸構(gòu)成，也稱為多組氨酸標(biāo)簽，6 XHis標(biāo)簽或 hexa組氨酸標(biāo)簽。組氨酸標(biāo)簽常融合在目標(biāo)蛋白的C端或N端，以便于目標(biāo)蛋白的純化和檢 測(cè)。組氨酸殘基可以在一定的緩沖液條件下特異性結(jié)合到幾種類型固定的離子上（比如鎳， 鈷和銅），然后通過更換緩沖液條件而從固定相洗脫，從而實(shí)現(xiàn)純化含有His標(biāo)簽的目標(biāo)蛋 白。
[0003] His標(biāo)簽是最常用的蛋白標(biāo)簽之一，通過檢測(cè)His標(biāo)簽即可獲知樣品中目標(biāo)蛋白的 情況。本發(fā)明公開了一種可以與His標(biāo)簽特異性結(jié)合的單域重鏈抗體（即納米抗體，下同）， 可用于His標(biāo)簽融合蛋白的純化及檢測(cè)。
[0004] 目前市場(chǎng)上已經(jīng)有針對(duì)His標(biāo)簽的單克隆或多克隆抗體用于檢測(cè)，但單克隆抗體 的研發(fā)和生產(chǎn)過程及其繁瑣和復(fù)雜，多克隆抗體來源有限。相比之下，單域重鏈抗體僅由一 個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，具有耐酸堿、耐高溫、特異性高、分子量小和可大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，用單域重 鏈抗體作為配基制備的純化介質(zhì)具有可重復(fù)使用、無需咪唑洗脫(免除透析操作)等優(yōu)點(diǎn)， 應(yīng)用前景廣闊。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供針對(duì)His標(biāo)簽的單域重鏈抗體，可以被用于制備檢測(cè)和純化 His標(biāo)簽的試劑和工具。
[0006] 本發(fā)明提供一個(gè)針對(duì)His標(biāo)簽的單域重鏈抗體（即本發(fā)明特異性識(shí)別組氨酸標(biāo)簽 的納米抗體，下同），具有SEQ ID N0. :1所示的氨基酸序列。其氨基酸序列的頂GT編號(hào)和結(jié) 構(gòu)域的劃分包括四個(gè)框架區(qū)（Framework region，F(xiàn)R)和三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū) (Complementarity-determining region,CDR)〇
[0007] 本發(fā)明提供一個(gè)核酸分子，其特征是編碼SEQ ID NO. :1，通過遺傳密碼子可以隨 時(shí)獲得該核酸分子的具體序列。
[0008] 本發(fā)明還提供一個(gè)核酸分子，其特征是編碼SEQ ID N0.: 1部分結(jié)構(gòu)域，通過遺傳 密碼子可以隨時(shí)獲得該核酸分子的具體序列。可以為SEQ ID N0. :2核酸分子。
[0009] 本發(fā)明所提供的核苷酸序列或者至少部分序列可以通過合適的表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表 達(dá)以得到相應(yīng)的蛋白質(zhì)或多肽。這些表達(dá)系統(tǒng)包括細(xì)菌，酵母菌，絲狀真菌，動(dòng)物細(xì)胞，昆蟲 細(xì)胞，植物細(xì)胞，或無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。
[0010] 本發(fā)明還提供一種載體，包含所述核酸序列。由于遺傳密碼子具有簡(jiǎn)并性，該核酸 序列可以根據(jù)不同的應(yīng)用目的而不同。
[0011] 本發(fā)明還提供一種宿主細(xì)胞，包括所述蛋白質(zhì)或表達(dá)載體。
[0012] 本發(fā)明還提供一種檢測(cè)His標(biāo)簽的方法，含有本發(fā)明所述針對(duì)His標(biāo)簽的單域重鏈 抗體?；诒景l(fā)明提供的針對(duì)His標(biāo)簽的單域重鏈抗體與His標(biāo)簽特異性結(jié)合的能力，建立 H i s標(biāo)簽的檢測(cè)方法。其中，優(yōu)選的方法包括酶聯(lián)免疫吸附法（E n z y m e - 1 i n k e d immunosorbent assay，ELISA)，焚光免疫法(Fluoroimmunoassay，F(xiàn)IA)，免疫芯片法，親和 層析法和免疫層析法等。
[0013] 本發(fā)明所提供的氨基酸序列可以作為前體，通過隨機(jī)或定點(diǎn)突變技術(shù)進(jìn)行改造， 能夠獲得性質(zhì)(水溶性、穩(wěn)定性、親和力以及特異性等)更好的突變體，該突變體能與組氨酸 標(biāo)簽特異性結(jié)合。
[0014] 本發(fā)明還涉及前述針對(duì)His標(biāo)簽的單域重鏈抗體在免疫檢測(cè)、富集以及純化中的 應(yīng)用。這些免疫檢測(cè)指的是非疾病診斷治療目的的免疫檢測(cè)。
[0015] 本發(fā)明還涉及針對(duì)組氨酸標(biāo)簽的免疫親和吸附材料，包括載體，搭載在載體上的 配基，其特征在于該材料以針對(duì)組氨酸標(biāo)簽的納米抗體作為配基，所述針對(duì)組氨酸標(biāo)簽的 納米抗體具有SEQ ID N0.: 1所示的氨基酸序列。載體材料不限于瓊脂糖凝膠，也可以選用 硅球、納米磁珠等。
[0016] 本發(fā)明所敘述的一些術(shù)語具有如下含義：
[0017]結(jié)構(gòu)域:蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的基本結(jié)構(gòu)單位，通常具有一定的功能。
[0018] IMGT編號(hào)：IMGT數(shù)據(jù)庫（The International ImMunoGeneTics Datbase)中的一種 已經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的抗體氨基酸序列編號(hào)方法。具體編號(hào)方法可以參考文獻(xiàn)（E h r e n m a η，F(xiàn) ·， Q.Kaas,et.al.(2010).IMGT/3D structure-DB and IMGT/DomainGapAlign：a databaseand a tool for immunoglobulins or antibodies,T cell receptors,MHC, IgSF and MhcSF.Nucleic Acids Res 38(Database issue):D301-307.Lefranc,M.P., C.Pommie,et al.(2003).IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Igsuperfamily V-like domains Dev comp Immunol 27(1) :55-77.)中的描述。
[0019] 密碼子(codon):又稱為三連體密碼子(triplet code)，指對(duì)應(yīng)于某種氨基酸的核 苷酸三聯(lián)體。在轉(zhuǎn)譯過程中決定該種氨基酸插入生長(zhǎng)中多肽鏈的位置。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 下面通過單域重鏈抗體(多肽)的制備、分析及應(yīng)用，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明，這些 具體實(shí)施例不應(yīng)以任何方式被解釋為限制本發(fā)明的應(yīng)用范圍。
[0021] 實(shí)施例1:
[0022]抗Hi s標(biāo)簽單域重鏈抗體(即針對(duì)Hi s標(biāo)簽的單域重鏈抗體)免疫文庫的構(gòu)建
[0023] 將6 XHis標(biāo)簽與牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA)共價(jià)偶聯(lián)，得到6 X His人工抗原6 X His-BSA，取300yg 6 X His-BSA與弗氏完全佐劑乳化后，對(duì)羊駝（Lama pacos)進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射免疫。加強(qiáng)免疫采用150yg 6XHis-BSA與弗氏不完全佐劑乳化， 間隔2周進(jìn)行，每次免疫7天后靜脈取血，采用間接ELISA法測(cè)定血清效價(jià)，選擇血清效價(jià)最 高的樣品分離淋巴細(xì)胞，提取RNA。
[0024] RNA的提取參照TAKARA公司RNAiso試劑說明書進(jìn)行。以RNA為模板，ο 1 igo dT為引 物，參照TAKARA公司反轉(zhuǎn)錄酶說明書合成cDNA第一鏈。
[0025] 采用PrimeSTAR高保真DNA聚合酶，經(jīng)巢式PCR獲得重鏈抗體的可變區(qū)編碼基因（采 用的引物見表1)。第一輪PCR分別以引物AlpVh-LD和CH2-R擴(kuò)增cDNA，反應(yīng)條件為，98°C， 1〇8,55。(：，2〇8,72。(：，111^11，20個(gè)循環(huán)，98。(：，1〇8,68。(：，111^11，72。(：延伸1〇11^11。
[0026] 將第一輪PCR產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳，回收600bp~750bp的DNA片段，作為 第二輪 PCR的模板，分別用引物AlpVh-Sfil 和AlpVHHRl-NotI，AlpVh-SfiI和AlpVHHR2-NotI，進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為，98°C，10s，50°C，20s，72°C，40s，5個(gè)循環(huán)，98°C，10s，68°C， 40 8,30個(gè)循環(huán)，72°(：延伸101^11。經(jīng)0嫩片段回收試劑盒回收、定量，于-20°(：保存?zhèn)溆谩⑹?菌粒pHENl和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別用Sfi I、Not I雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠回收、定量后，以1:3摩 爾比，在16°C，過夜連接。
[0027]表1文庫構(gòu)建及鑒定所用的引物
[0029] 注:下劃線表示限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列
[0030] 連接產(chǎn)物經(jīng)乙醇沉淀后，溶于10yL無菌水，分十次進(jìn)行電穿孔轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1。 取10yL電擊、培養(yǎng)后的菌液倍比稀釋，涂布氨節(jié)青霉素2XYT培養(yǎng)板，37 °C，倒置培養(yǎng)12~ 16h，采用引物M13-R和pHEN-R進(jìn)行菌落PCR，計(jì)算庫容；其余部分全部涂布于24cm X 24cm氨 芐青霉素2 X YT培養(yǎng)板，37°C，倒置培養(yǎng)12~16h。用10mL，2 X YT培養(yǎng)基將培養(yǎng)板上的菌苔刮 洗后，加入終濃度15~30 %甘油，分裝，-80 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0031] 根據(jù)計(jì)算的庫容量結(jié)果，接種10倍庫容量的活細(xì)胞于20mL的2 XYT(含2 %葡萄糖， 100yg/mL氨芐青霉素），30°C，220r/min培養(yǎng)至0D600達(dá)0.5，按感染復(fù)數(shù)20:1加入輔助噬菌 體，37°C，220r/min，60min。將培養(yǎng)物離心，用50mL的2 X YT(含100yg/mL氨芐青霉素和50yg/ mL卡那霉素)重懸沉淀，30°C，220r/min過夜培養(yǎng)后，3000g離心取上清，加入5 X PEG/NaCl溶 液，冰上放置lh或4°C過夜，12000rpm離心30min，重懸沉淀于含10 %甘油的磷酸緩沖液 (PBS，0.01M，pH 7.4)，即得到抗Hi s標(biāo)簽單域重鏈抗體免疫文庫，取1 OyL測(cè)定滴度，其余分 裝于-80°C保存?zhèn)溆谩?br>[0032] 實(shí)施例2:
[0033]抗His標(biāo)簽單域重鏈抗體的淘選與鑒定
[0034]采用固相親和淘選的方法從實(shí)施例1所得抗His標(biāo)簽單域重鏈抗體免疫文庫中淘 選針對(duì)His標(biāo)簽的單域重鏈抗體。將6 XHis與卵清白蛋白（albumin，0VA)共價(jià)偶聯(lián)，得到人 工抗原6XHis-0VA。每孔加入100yL用roS稀釋的人工抗原6XHis-0VA，4°C，包被過夜，每輪 淘選的包被濃度分別為100，75，50yg/mL;吸出包被液，PBS洗板3次，每孔加入300yL 3 %脫 脂乳（in PBS)，37°C，封閉2h;PBS洗板6次，加入100yL噬菌體抗體文庫(約含2X 10nCFU)，37 °C，孵育1.5h;吸出未結(jié)合的噬菌體，用PBST (含0.5 % Tween-20)洗板5次(逐輪增加5次），再 用PBS洗板10次(洗板次數(shù)逐輪增加5次）；以100yL洗脫液(甘氨酸-鹽酸，pH 2.2)洗脫吸附 在酶標(biāo)孔中的噬菌體，用50yL Tris-HCl(lm〇l/L，pH 8.0)中和洗脫物，取10yL用于滴度測(cè) 定，其余洗脫物擴(kuò)增后用于下一輪淘選。
[0035] 經(jīng)三輪淘選后，采用輔助噬菌體KM13對(duì)隨機(jī)挑取的單克隆進(jìn)行救援，分別得到展 示抗體可變區(qū)的噬菌體顆粒，再用間接phage-ELISA測(cè)定噬菌體顆粒的結(jié)合活性和特異性， 實(shí)驗(yàn)設(shè)定對(duì)照，具體加樣步驟見表2。
[0036] 表2間接phage-ELISA加樣表
[0038]將ELISA陽性克隆送生物技術(shù)服務(wù)公司進(jìn)行序列測(cè)定，得到插入片段的DNA序列， 其編碼針對(duì)His標(biāo)簽的單域重鏈抗體，具體如下(SEQ ID N0.:2):
[0040]依據(jù)DNA測(cè)序結(jié)果及密碼子表可獲得針對(duì)黃曲霉毒素的單域重鏈抗體的氨基酸序 列（SEQ ID NO.:1):
[0042] 實(shí)施例3:
[0043] 抗His標(biāo)簽單域重鏈抗體的規(guī)模制備
[0044]編碼抗His標(biāo)簽單域重鏈抗體的DNA片段的獲取：1.采用限制性內(nèi)切酶Sfil/Notl， 雙酶切噬菌粒pHEN-抗His標(biāo)簽單域重鏈抗體基因，瓊脂糖凝膠電泳回收抗His標(biāo)簽單域重 鏈抗體基因；2.直接將抗His標(biāo)簽單域重鏈抗體編碼序列送生物技術(shù)服務(wù)公司進(jìn)行化學(xué)合 成;3.設(shè)計(jì)特異性引物，通過PCR技術(shù)從羊駝(Lama pacos)來源的cDNA庫中擴(kuò)增。
[0045]將得到的抗His標(biāo)簽單域重鏈抗體基因片段克隆至表達(dá)載體pET25_flag(已將載 體本身所帶His標(biāo)簽替換為Flag標(biāo)簽:DYKDDDDK)，經(jīng)PCR和酶切鑒定，構(gòu)建完成抗His標(biāo)簽單 域重鏈抗體的大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒。
[0046]將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21，挑取單菌落進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。將單菌落接入4mL LBA(Luria_Bertani broth with 100yg/mL ampicillin)液體培養(yǎng)基中，37°C、250r/min振 蕩培養(yǎng)12h;以1 %培養(yǎng)基體積的接種量將其轉(zhuǎn)接到50mL LBA液體培養(yǎng)基中，37 °C、250r/min 振蕩培養(yǎng)至0D6QQ達(dá)到0.5(約需2.5~3h)，加入終濃度Ο. ImM的IPTG，30°C、200r/min誘導(dǎo)培 養(yǎng)。
[0047] 誘導(dǎo)培養(yǎng)物8000以1^11離心，在細(xì)胞沉淀中加入2011^磷酸緩沖液(？!17.4)混勻， 8000r/min離心，去上清，保留細(xì)胞沉淀;在細(xì)胞沉淀中加入10mL相同緩沖液，混勾，冰上超 聲波細(xì)胞破碎處理，超聲破碎條件為200W，破碎2s，間歇3s，共240個(gè)循環(huán)，在4°C下對(duì)細(xì)胞破 碎物12000r/min離心20min，取上清進(jìn)行親和層析純化和SDS-PAGE電泳分析，或在上清中加 入終濃度30 %的甘油，混勻，保存于-20°C冰柜待用。
[0048]通過優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件（如宿主菌、表達(dá)載體、誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間、溫度以及IPTG濃度 等），可以進(jìn)一步提高目的蛋白（單域重鏈抗體)表達(dá)量，為大量制備抗His標(biāo)簽單域重鏈抗 體提供了途徑。
[0049] 實(shí)施例4:
[0050] 抗His標(biāo)簽單域重鏈抗體的融合表達(dá)
[00511將本發(fā)明抗His標(biāo)簽單域重鏈抗體基因克隆至融合表達(dá)載體pAP(含有堿性磷酸酶 基因），經(jīng)PCR和酶切鑒定，構(gòu)建完成抗His標(biāo)簽單域重鏈抗體的堿性磷酸酶融合表達(dá)質(zhì)粒。
[0052]堿性磷酸酶可以非特異性催化磷酸單酯水解生成無機(jī)磷酸和相應(yīng)的醇、酚或糖類 化合物。該酶常作為信號(hào)元件用于ELISA、免疫印跡、組織化學(xué)等檢測(cè)方法。融合表達(dá)質(zhì)粒將 抗Hi s標(biāo)簽單域重鏈抗體融合于堿性磷酸酶的N端，參考應(yīng)用實(shí)例3中的表達(dá)方法，可以在大 腸桿菌中表達(dá)、純化出融合蛋白AP-抗Hi s標(biāo)簽單域重鏈抗體。
[0053] 實(shí)施例5:
[0054]抗His標(biāo)簽單域重鏈抗體用于親和純化材料的制備
[0055]將重組表達(dá)的抗His標(biāo)簽單域重鏈抗體與固相載體瓊脂糖偶聯(lián)，具體方法如下： [0056] 將CNBr活化的瓊脂糖干膠用0.1M HC1洗滌10次，每次平衡5min。用偶聯(lián)緩沖液 (10mM，Na2HP〇4，pH 7.4)洗滌10次，加入抗把4示簽單域重鏈抗體(211^/每克瓊脂糖微球），室 溫反應(yīng)4h，使抗Hi s標(biāo)簽單域重鏈抗體與CNBr活化的瓊脂糖凝膠微球共價(jià)偶聯(lián)。用偶聯(lián)緩沖 液（1 OmM，Na2HP〇4，pH 7.4)洗滌2次后，加入封閉液室溫反應(yīng)2h以封閉未反應(yīng)的活性基團(tuán)。用 5被膠體積的磷酸緩沖液(1〇1111，？!17.4)和醋酸緩沖液(0.謂，?!14.0)交替洗滌3次，得到共 價(jià)偶聯(lián)了抗His標(biāo)簽單域重鏈抗體的免疫親和吸附材料。
[0057]固相載體材料不限于瓊脂糖凝膠，也可以選用硅球、納米磁珠等。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 特異性識(shí)別組氨酸標(biāo)簽的納米抗體，具有SEQ ID NO. :1所示的氨基酸序列。2. -種核酸分子，其特征是編碼權(quán)利要求1中所述氨基酸序列。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的核酸分子，其特征在于序列如SEQ ID NO.:2。4. 一種包含權(quán)利要求2所述的核酸序列的載體。5. -種包含權(quán)利要求4所述的載體的宿主細(xì)胞。6. 權(quán)利要求1所述的特異性識(shí)別組氨酸標(biāo)簽的納米抗體在免疫檢測(cè)、富集純化組氨酸 標(biāo)簽中的應(yīng)用。7. 權(quán)利要求1所述的特異性識(shí)別組氨酸標(biāo)簽的納米抗體在制備組氨酸標(biāo)簽免疫檢測(cè)、 富集以及純化試劑或材料中的應(yīng)用。8. 權(quán)利要求1所述的特異性識(shí)別組氨酸標(biāo)簽的納米抗體通過隨機(jī)或定點(diǎn)突變技術(shù)進(jìn)行 改造所獲得的能與組氨酸標(biāo)簽特異性結(jié)合的抗體。9. 一種針對(duì)組氨酸標(biāo)簽的免疫親和吸附材料，包括載體，搭載在載體上的配基，其特征 在于該材料以特異性識(shí)別組氨酸標(biāo)簽的納米抗體作為配基，所述特異性識(shí)別組氨酸標(biāo)簽的 納米抗體具有SEQ ID NO.: 1所示的氨基酸序列。
【文檔編號(hào)】C12N15/13GK106046152SQ201610529659
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年7月7日
【發(fā)明人】吳紅靜, 涂追, 付金衡, 許楊
【申請(qǐng)人】南昌大學(xué)