據(jù)此依據(jù)35U.S.C.§119(e)要求2013年11月7日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列第61/901,310號(hào)和2014年8月15日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)序列號(hào)62/037,875的權(quán)益，這兩個(gè)優(yōu)先權(quán)文件的公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用整體并入本文。

本申請(qǐng)包含與下列申請(qǐng)的主題相關(guān)的主題：2011年4月1日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第61/470,635號(hào)和2011年5月31日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第61/491,392號(hào)，以及2013年9月27日提交的標(biāo)題為"T-Cell Receptor Like Antibodies Specific for WT1 Peptides"的美國(guó)非臨時(shí)申請(qǐng)第14/008,447號(hào)和2013年3月15日提交的標(biāo)題為"Antibodies to Cytosolic Peptides"的共同轉(zhuǎn)讓的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第61/798,563；每個(gè)申請(qǐng)的內(nèi)容據(jù)此通過(guò)引用整體并入。

聯(lián)邦資助研究下的權(quán)利聲明

本發(fā)明根據(jù)美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院授予的第P01CA23766和R01CA55349號(hào)撥款在政府支持下完成。政府享有本發(fā)明的某些權(quán)利。

序列表

本申請(qǐng)包含計(jì)算機(jī)可讀格式的序列表(文件名：48317_SeqListing.txt；創(chuàng)建于：2014年11月7日；大?。?3,841個(gè)字節(jié))作為本公開(kāi)的單獨(dú)部分，所述序列據(jù)此通過(guò)引用整體并入本申請(qǐng)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明總體上涉及抗胞質(zhì)溶膠蛋白的抗體。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及抗維爾姆斯氏腫瘤(Wilm's tumor)癌基因蛋白(WT1)的抗體，特別是識(shí)別與主要組織相容性抗原以及免疫效應(yīng)細(xì)胞表面上展示的抗原結(jié)合的WT1肽的雙特異性抗體。

發(fā)明背景

識(shí)別MHC I類分子的背景中的關(guān)鍵細(xì)胞內(nèi)蛋白的肽片段的治療性T細(xì)胞受體樣單克隆抗體(TCRm mAb)的開(kāi)發(fā)，正作為靶向細(xì)胞內(nèi)腫瘤特異性抗原(Ag)的新方法出現(xiàn)。大多數(shù)腫瘤特異性Ag是對(duì)于經(jīng)典mAb療法來(lái)說(shuō)不可及的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)被降解、加工并通過(guò)MHC I類分子作為肽/MHC復(fù)合物來(lái)展示，所述肽/MHC復(fù)合物被細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的TCR識(shí)別。因此，許多針對(duì)觸發(fā)對(duì)低密度的腫瘤特異性肽/MHC復(fù)合物的T細(xì)胞應(yīng)答的方法已被嘗試，取得有限的成功。腎母細(xì)胞瘤蛋白(WT1)是用于T細(xì)胞免疫療法的被良好驗(yàn)證的人類腫瘤特異性Ag。WT1在廣泛的人造血惡性腫瘤、白血病干細(xì)胞以及不同實(shí)體瘤中過(guò)表達(dá)。在正常成人組織中，所述蛋白具有有限的低表達(dá)，這使得其成為理想的癌癥特異性靶(Gessler等Nature.1990；346(6280):194-197；Menssen等Leukemia.1995；9(6):1060-1067；Oji等Jpn J Cancer Res.1999；90(2):194-204)。WT1表位特異性T細(xì)胞和針對(duì)WT1全蛋白的抗體在患有造血惡性腫瘤和實(shí)體瘤的患者中均被檢測(cè)到，這表明WT1是高度免疫原性抗原(Gaiger等Clinical cancer research:an official journal of the American Association for Cancer Research.2001；7(3增刊):761s-5s；Gillmore等Clinical cancer research:an official journal of the American Association for Cancer Research.2006；12(1):34-42)。此外，在異體移植干細(xì)胞移植后觀察到移植物抗白血病與可檢測(cè)的WT1特異性CTL之間的相關(guān)性，進(jìn)一步證明了這些T細(xì)胞的治療活性。

WT1-衍生的肽片段RMFPNAPYL(RMF；SEQ ID NO:1)是在HLA-A0201分子的背景中用于CD8T細(xì)胞識(shí)別的研究最充分和驗(yàn)證最充分的表位。RMF表位已被廣泛地應(yīng)用于肽疫苗或作為來(lái)自患者(患有急性髓系白血病(AML)、骨髓增生異常綜合征(MDS)和各種實(shí)體瘤)的離體擴(kuò)增的過(guò)繼轉(zhuǎn)移的CD8T細(xì)胞的靶。這些研究證明與一些患者中的臨床應(yīng)答相關(guān)的肽表位的免疫原性(Krug等Cancer Immunol Immunother.2010；59(1467-1479)；Maslak等Blood.2010；116(2):171-9；Keilholz等Blood.2009；113(26):6541-8；Oka等ScientificWorldJournal.2007；7:649-65；Oka等Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.2004；101(38):13885-90；Letsch等和Keiholz,U.，編輯Associate for Immunotherapy of Cancer:Cancer Immunotherapy-2nd Annual Meeting；2004；Mainz,Germany)。

盡管T細(xì)胞免疫療法取得了顯著進(jìn)展，但仍然很少看到客觀臨床反應(yīng)?；赥細(xì)胞的療法的低效率已被歸因于低的TCR親和力，有限的針對(duì)高腫瘤負(fù)荷的體內(nèi)強(qiáng)效細(xì)胞毒反應(yīng)、效應(yīng)細(xì)胞的持久性的缺乏，對(duì)自身腫瘤Ag的耐受性和通過(guò)T調(diào)節(jié)性(T-reg)細(xì)胞和細(xì)胞因子產(chǎn)生的免疫抑制(Morris等Blood Reviews 2006；20:61-69；Konnig R.Curr Opin Immunol 2002:14(1)75-83)。為了開(kāi)發(fā)靶向WT1的該重要表位的不同方法，產(chǎn)生對(duì)于RMF/HLA-A0201復(fù)合物是特異的完全人TCRm mAb。所述mAb顯示通過(guò)抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)的針對(duì)表達(dá)WT1的白血病和實(shí)體瘤的體外和體內(nèi)強(qiáng)效治療活性(Dao等Sci Transl Med.2013；5(176):176ra133)。

ADCC取決于天然殺傷(NK)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和其他免疫效應(yīng)細(xì)胞的存在，所述細(xì)胞在白血病或癌癥患者中，尤其在治療后，可以是極其異質(zhì)的。調(diào)節(jié)mAb細(xì)胞溶解療法的替代性和有效方法是使用T細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞。T細(xì)胞是最強(qiáng)效的細(xì)胞毒性細(xì)胞之一，并且占據(jù)最大數(shù)量的循環(huán)細(xì)胞毒性細(xì)胞。將mAb特異性添加至T細(xì)胞的最近方法，諸如經(jīng)工程化具有基于抗體的嵌合抗原受體(稱為CAR)和具有針對(duì)腫瘤Ag和CD3T細(xì)胞的雙重特異性的過(guò)繼轉(zhuǎn)移的T細(xì)胞，已作為將多克隆人T細(xì)胞重定向至定義明確的腫瘤相關(guān)Ag的高效策略出現(xiàn)。雙特異性抗體構(gòu)建體被設(shè)計(jì)來(lái)將癌細(xì)胞上的表面Ag與T細(xì)胞上的TCR/CD3復(fù)合物交聯(lián)。所述分子可重定向CD4和CD8T細(xì)胞，從而以不依賴于細(xì)胞的內(nèi)部Ag特異性TCR識(shí)別、共刺激分子和腫瘤細(xì)胞上的HLA表達(dá)的一系列方式殺傷腫瘤細(xì)胞。其還避免疫苗接種、細(xì)胞因子施用或Ag-特異性患者來(lái)源的T細(xì)胞的離體擴(kuò)增和輸注(Frankel和Baeuerle.Current opinion in chemical biology.2013；17(3):385-92；Brischwein等Journal of immunotherapy.2007；30(8):798-807；Nagorsen等Pharmacology&therapeutics.2012；136(3):334-42；Aigner等Leukemia.2013；27(5):1107-15；Spiess等Nature biotechnology.2013；31(8):753-8；Nagorsen和Baeuerle.Experimental cell research.2011；317(9):1255-60)。對(duì)于總B細(xì)胞Ag CD19和TCR的CD3e信號(hào)鏈?zhǔn)翘禺惖碾p特異性T細(xì)胞接合子抗體蘭妥莫單抗(Amgen,Thousand Oaks,CA)被FDA批準(zhǔn)用于治療非霍奇金淋巴瘤和急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)。

發(fā)明概述

先前已描述的雙特異性抗體均涉及步是腫瘤特異性的公知的高密度細(xì)胞表面Ag。本公開(kāi)提供了從TCRm mAb衍生的雙特異性抗體(稱為ESK)。ESK-雙特異性抗體能夠選擇性結(jié)合WT1/HLA-A0201陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞，并且在多種人癌癥模型中通過(guò)重定向人T細(xì)胞的細(xì)胞毒性顯示強(qiáng)效治療活性。T細(xì)胞群體至癌癥的重定向通過(guò)雙重靶和效應(yīng)細(xì)胞跟蹤及成像來(lái)證明。本文所述的TCRm mAb雙特異性抗體是靶向廣泛表達(dá)的低密度細(xì)胞內(nèi)腫瘤特異性Ag例如WT1的強(qiáng)效治療劑。本文所述的雙特異性抗體也能夠誘導(dǎo)對(duì)于除WT1外的抗原是特異的二次T細(xì)胞應(yīng)答。

在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及重組抗體，其包含特異性結(jié)合與主要組織相容性復(fù)合物抗原諸如HLA-A2復(fù)合的WT1肽并從而甚至當(dāng)WT1以低密度存在時(shí)，可結(jié)合WT1/HLA-A2⁺細(xì)胞的第一抗原結(jié)合部分。所述抗體還包含特異性結(jié)合免疫效應(yīng)細(xì)胞上的表面抗原諸如CD3，從而也可結(jié)合所述免疫效應(yīng)細(xì)胞的第二抗原結(jié)合部分。

在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及重組抗體，其中所述重組抗體包含：(i)第一抗原結(jié)合部分，其包含：(A)包含含有表1-6中所示的氨基酸序列的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3的重鏈(HC)可變區(qū)；和包含含有表1-6中所示的氨基酸序列的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3的輕鏈(LC)可變區(qū)；(B)包含表1-6中所示的第一氨基酸序列和第二氨基酸序列的VH和VL；或(C)包含表1-6中所示的氨基酸序列的scFv；和(ii)第二抗原結(jié)合部分，其包含表7中所示的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述重組抗體包含圖10中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO:110)。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及編碼本文中公開(kāi)的重組雙特異性抗體的核酸。

在相關(guān)方面，本發(fā)明涉及包含所述重組雙特異性抗體和藥學(xué)上可接受的賦形劑的藥物組合物。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含編碼所述重組雙特異性抗體的核酸和藥學(xué)上可接受的賦形劑的藥物組合物。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于殺傷WT1⁺細(xì)胞的方法，所述方法包括將WT1⁺細(xì)胞與具有對(duì)于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的特異性抗體和細(xì)胞毒性T細(xì)胞的接觸。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞毒性T細(xì)胞是自體細(xì)胞。

在另一個(gè)相關(guān)方面，本發(fā)明涉及治療患有WT1陽(yáng)性疾病的受試者的方法，所述方法包括向所述受試者施用治療有效量的本文所述的重組雙特異性抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包括向所述受試者施用為自體的CD3⁺細(xì)胞毒性T細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述WT1陽(yáng)性疾病是慢性白血病或急性白血病或WT1⁺癌癥，例如慢性粒細(xì)胞性白血病、多發(fā)性骨髓瘤(MM)、急性淋巴母細(xì)胞性白血病(ALL)、急性髓性/髓系白血病(AML)、骨髓增生異常綜合征(MDS)、間皮瘤、卵巢癌、胃腸癌、乳腺癌、前列腺癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。

在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及重組雙特異性抗體，其包含含有如下部分之一的第一抗原結(jié)合部分：(A)包含選自由以下組成的組的氨基酸序列的單鏈可變片段(scFV)：SEQ ID NO:18、36、54、72、90、108和132；或(B)重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)，其中所述VH和VL分別包含選自由以下組成的組的氨基酸序列：SEQ ID NO:(i)14和16；(ii)32和34；(iii)50和52；(iv)68和70；(v)86和88；(vi)104和106；(vii)128和130；或(C)(i)隨后3個(gè)VH互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)：(a)包含選自由以下組成的組的氨基酸序列的VH CDR1：SEQ ID NO:2、20、38、56、74、92和116；和(b)包含選自由以下組成的組的氨基酸序列的VH CDR2：SEQ ID NO:3、21、39、57、75、93和117；和(c)包含選自由以下組成的組的氨基酸序列的VH CDR3：SEQ ID NO:4、22、40、58、76、94和118；和(ii)隨后3個(gè)VL CDR：(a)包含選自由以下組成的組的氨基酸序列的VL CDR1：SEQ ID NO:8、26、44、62、80、98和122；和(b)包含選自由以下組成的組的氨基酸序列的VL CDR2：SEQ ID NO:9、27、45、63、81、99,和123；和(c)包含選自由以下組成的組的氨基酸序列的VL CDR3：SEQ ID NO:10、28、46、64、82、100和124。所述重組雙特異性抗體還包含第二抗原結(jié)合部分，其包含(A)包含SEQ ID NO:113中所示的氨基酸序列的scFV；或(B)重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)，其中所述VH和VL分別包含SEQ ID NO:111和112或SEQ ID NO:134和136中所示的氨基酸序列。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了在受試者中刺激初次T細(xì)胞應(yīng)答和二次T細(xì)胞應(yīng)答的方法，所述方法包括施用包含重組抗體的組合物，所述重組抗體包含第一抗原結(jié)合部分和第二抗原結(jié)合部分，其中所述第一抗原結(jié)合部分特異性地結(jié)合于第一腫瘤抗原，并且所述第二抗原結(jié)合部分特異性地結(jié)合于免疫效應(yīng)細(xì)胞表面抗原，其中初次T細(xì)胞應(yīng)答包括刺激針對(duì)所述第一腫瘤抗原的細(xì)胞毒性T細(xì)胞，并且其中所述二次T細(xì)胞應(yīng)答包括刺激針對(duì)所述第一腫瘤抗原和/或針對(duì)第二腫瘤抗原的效應(yīng)T細(xì)胞和/或記憶T細(xì)胞。在一個(gè)方面，所述二次T細(xì)胞應(yīng)答不需要抗原呈遞細(xì)胞或共刺激分子。在另一個(gè)方面，所述二次T細(xì)胞應(yīng)答包括刺激針對(duì)所述第二腫瘤抗原的效應(yīng)T細(xì)胞和/或記憶T細(xì)胞。在一個(gè)方面，所述第二個(gè)腫瘤抗原是非WT1-RMF腫瘤抗原。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生針對(duì)腫瘤抗原的效應(yīng)T細(xì)胞和/或記憶T細(xì)胞的方法，所述方法包括用本文公開(kāi)的重組雙特異性抗體活化T細(xì)胞。可體內(nèi)或離體地產(chǎn)生效應(yīng)T細(xì)胞和/或記憶T細(xì)胞。在一個(gè)方面，產(chǎn)生針對(duì)非WT1-RMF腫瘤抗原例如HER2-neu的效應(yīng)T細(xì)胞和/或記憶T細(xì)胞。

上文中的概述不旨在限定本發(fā)明的每個(gè)方面，并且根據(jù)以下詳細(xì)描述(包括附圖)本公開(kāi)的其他特征和有利方面將變得顯而易見(jiàn)。本公開(kāi)旨在作為統(tǒng)一的文件而相關(guān)，并且應(yīng)當(dāng)理解，設(shè)想了本文所述的特征的所有組合，即使特征的組合未在本公開(kāi)的同一個(gè)句子、段落或部分中一起被發(fā)現(xiàn)。另外，作為另一個(gè)方面，本公開(kāi)以任何方式在比上文中明確提及的變化更窄的范圍內(nèi)包括本發(fā)明的所有實(shí)施方案。關(guān)于利用“一個(gè)”或“一種”描述或要求的本公開(kāi)的方面，應(yīng)當(dāng)理解，除非上下文明確要求更受限制的含義，否則這些術(shù)語(yǔ)意指“一個(gè)/種或多個(gè)/種”。關(guān)于被描述為組內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)的元件，應(yīng)當(dāng)理解，設(shè)想了組內(nèi)的所有組合。如果本公開(kāi)的方面被描述為“包含”特征，則實(shí)施方案也被設(shè)想“由所述特征組成”或“基本上由所述特征組成”。根據(jù)本申請(qǐng)的整體性，本公開(kāi)的另外的特征和變化對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯然的，并且所有此類特征旨在作為本公開(kāi)的方面。

附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量的ESK雙特異性抗體的一個(gè)實(shí)施方案與腫瘤細(xì)胞和人T細(xì)胞的選擇性結(jié)合。以10μg/ml、1μg/ml或0.1μg/ml的濃度用ESK-雙特異性抗體或?qū)φ?，隨后用對(duì)于綴合于FITC的His標(biāo)簽是特異的第二mAb對(duì)SET-2(1A)、HL-60(1B)或純化的人CD3T細(xì)胞(1C)進(jìn)行染色。ESK-雙特異性抗體在10μg/ml、1μg/ml和0.1μg/ml的濃度下顯示對(duì)SET-2細(xì)胞的選擇性結(jié)合。在指定的濃度下單獨(dú)的對(duì)照第二mAb和對(duì)照雙特異性抗體不結(jié)合細(xì)胞。ESK和對(duì)照雙特異性抗體在所有測(cè)試的濃度下均不結(jié)合于HL-60。對(duì)于靜止人T細(xì)胞，ESK-雙特異性抗體顯示比對(duì)照雙特異性抗體更弱的結(jié)合。針對(duì)ESK-雙特異性抗體的中位熒光強(qiáng)度(MFI)：在10μg/ml、1μg/ml和0.1μg/ml的濃度下分別為91.4、41和13.2。對(duì)于對(duì)照雙特異性抗體：在10μg/ml、1μg/ml和0.1μg/ml的濃度下分別為188、153和26.2。(1D)ESK-雙特異性抗體在WT1+/HLA-A0201+腫瘤細(xì)胞存在的情況下誘導(dǎo)IFN-γ分泌。用或不用濃度為3μg/ml、1μg/ml、0.3μg/ml、0.1μg/ml或0.03μg/ml的ESK-雙特異性抗體或?qū)φ针p特異性抗體孵育比率為15:1的人T細(xì)胞和SET-2細(xì)胞，進(jìn)行過(guò)夜。收集上清液，并通過(guò)ELISA試劑盒測(cè)量IFN-γ釋放。單獨(dú)的T細(xì)胞或T細(xì)胞與SET-2細(xì)胞加上對(duì)照雙特異性抗體的培養(yǎng)不顯示任何可檢測(cè)的IFN-γ。從而將它們的值從顯示的數(shù)據(jù)扣除。所述數(shù)據(jù)顯示一式二份培養(yǎng)的平均值并且代表兩個(gè)相似實(shí)驗(yàn)之一。

圖2顯示ESK-雙特異性抗體定向針對(duì)WT1+/HLA-A0201+腫瘤細(xì)胞的T細(xì)胞的細(xì)胞毒性。在指定濃度的ESK或?qū)φ针p特異性抗體存在或不存在的情況下，以40:1的E:T比率用SET-2(2A)或HL-60細(xì)胞(2B)孵育純化的T細(xì)胞。在5小時(shí)的孵育后通過(guò)⁵¹Cr-釋放測(cè)量T細(xì)胞的細(xì)胞毒性。類似地，在以100:1的E:T比率進(jìn)行的6小時(shí)-⁵¹Cr釋放測(cè)定中ESK-定向的PBMC針對(duì)來(lái)自患者的BV173(2C)和CML母細(xì)胞(2D)的細(xì)胞毒性。通過(guò)以指定的E:T比率進(jìn)行的針對(duì)BV173(2E)、JMN(2F)和原發(fā)性卵巢癌細(xì)胞(2G)的5小時(shí)⁵¹Cr釋放測(cè)定測(cè)量ESK-雙特異性抗體介導(dǎo)的由EBV致敏的人T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞毒性。以0.1μg/ml使用雙特異性抗體。所有數(shù)據(jù)點(diǎn)為一式三份培養(yǎng)的平均值，并且代表2至3個(gè)相似實(shí)驗(yàn)之一。

圖3顯示ESK-雙特異性抗體在自體卵巢癌細(xì)胞存在的情況下誘導(dǎo)T細(xì)胞活化。在0.1μg/ml ESK或?qū)φ针p特異性抗體存在的情況下，用自體經(jīng)輻照的卵巢癌細(xì)胞孵育指定數(shù)目的來(lái)自患者的PBMC/孔，進(jìn)行前3天。(3A)將細(xì)胞培養(yǎng)總共7天，在第8天，將⁵¹Cr-標(biāo)記的自體腫瘤細(xì)胞添加至數(shù)千個(gè)細(xì)胞/孔的效應(yīng)細(xì)胞。6小時(shí)后測(cè)量⁵¹Cr-釋放。(3B)用或不用0.1μg/ml的ESK或?qū)φ针p特異性抗體孵育PBMC、自體卵巢癌細(xì)胞，或PBMC加上卵巢癌細(xì)胞，進(jìn)行7天。添加³H-胸苷過(guò)夜，第2天收獲細(xì)胞。數(shù)據(jù)代表一式三份培養(yǎng)。

圖4顯示ESK-雙特異性抗體有效地治療NSG小鼠中的BV173和ALL。在第0天將200萬(wàn)個(gè)BV173細(xì)胞靜脈內(nèi)注射入小鼠，在第5天確認(rèn)腫瘤移植物植入，以及將小鼠隨機(jī)分成治療組。在第6天靜脈內(nèi)給予1000萬(wàn)個(gè)EBV-特異性T細(xì)胞，隨后在4至5小時(shí)后靜脈內(nèi)注射20μg的ESK1或?qū)φ针p特異性抗體。每周給予1次T細(xì)胞，每周給予2次雙特異性抗體，持續(xù)總共3周。(4A)通過(guò)從小鼠的前面進(jìn)行生物發(fā)光成像(BLI)來(lái)顯示腫瘤負(fù)荷。第6天的BLI顯示治療前的腫瘤移植物植入。接受T細(xì)胞和ESK-雙特異性抗體的小鼠顯示腫瘤負(fù)荷的顯著減小，尤其在骨髓中。(4B)通過(guò)將每一只小鼠背面和前面兩個(gè)位置的發(fā)光信號(hào)求和計(jì)算腫瘤負(fù)荷，將每一個(gè)組(n＝5)的平均信號(hào)繪圖。(4C)通過(guò)每周稱取小鼠的重量評(píng)估GVHD，并且未觀察到GVHD長(zhǎng)達(dá)49天。(4D)ESK-雙特異性抗體在NSG小鼠中抑制原發(fā)性ALL細(xì)胞生長(zhǎng)。將500萬(wàn)個(gè)原發(fā)性腫瘤ALL細(xì)胞靜脈內(nèi)注射入NSG小鼠。第6天，在通過(guò)螢火蟲(chóng)BLI確認(rèn)腫瘤移植物植入后，將小鼠隨機(jī)分成不同的治療組。將3000萬(wàn)個(gè)EBV-特異性T細(xì)胞靜脈內(nèi)注射入小鼠，隨后靜脈內(nèi)注射20μg ESK-雙特異性抗體或其對(duì)照雙特異性抗體。每日進(jìn)行一次雙特異性抗體注射，每周給予T細(xì)胞2次，持續(xù)總共2周。在腫瘤接種后第18天和第23天的腫瘤抑制示于每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)的俯臥和仰臥視圖中。(4E)來(lái)自ALL小鼠模型的數(shù)據(jù)：來(lái)自5只小鼠的平均光子/秒顯示超過(guò)3周后的利用ESK-雙特異性抗體處理的小鼠中的腫瘤負(fù)荷的近百倍的減小。

圖5顯示ESK-雙特異性抗體有效地治療NSG小鼠中的SET-2AML。在該模型中，在于第4天確認(rèn)腫瘤移植物植入后，每周2次靜脈內(nèi)給予1000萬(wàn)個(gè)EBV-特異性T細(xì)胞，并且每天注射20μg雙特異性抗體一次，持續(xù)總共6天。(5A)從小鼠的背面顯示了腫瘤負(fù)荷，以顯示脊髓白血病浸潤(rùn)，以顯示所有組中的白血病負(fù)荷。BLI的尺度從第7天起在圖像上增加至約10倍。(5B)通過(guò)對(duì)每一只小鼠的背面和前面兩個(gè)位置的發(fā)光信號(hào)求和來(lái)計(jì)算腫瘤負(fù)荷，將每一個(gè)組(n＝5)的平均信號(hào)繪圖。(5C)還通過(guò)因中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷引起的肢體癱瘓來(lái)評(píng)估白血病浸潤(rùn)。接受T細(xì)胞和ESK-雙特異性抗體的小鼠未顯示CNS麻痹。每一個(gè)條塊顯示5只小鼠/組的平均值。

圖6顯示ESK-雙特異性抗體在荷瘤小鼠的骨髓中介導(dǎo)T細(xì)胞保留。(6A)將2000萬(wàn)個(gè)海腎轉(zhuǎn)導(dǎo)的EBV-特異性T細(xì)胞靜脈內(nèi)注射入已植入了SET-2細(xì)胞的小鼠。4小時(shí)后，通過(guò)靜脈內(nèi)注射給予20μg ESK或?qū)φ针p特異性抗體。在T細(xì)胞注射后立即(0小時(shí))，在雙特異性抗體注射后4小時(shí)，隨后每天通過(guò)海腎生物發(fā)光成像監(jiān)測(cè)T細(xì)胞分布，持續(xù)總共3天。(6B)通過(guò)對(duì)每一只小鼠的發(fā)光信號(hào)求和來(lái)計(jì)算T細(xì)胞信號(hào)，并將每一組(n＝3)的平均信號(hào)繪圖。(6C)在指定的時(shí)間點(diǎn)通過(guò)螢火蟲(chóng)生物發(fā)光成像同時(shí)監(jiān)測(cè)SET-2白血病負(fù)荷。單獨(dú)接受T細(xì)胞的小鼠未顯示螢火蟲(chóng)信號(hào)。接受T細(xì)胞和ESK-雙特異性抗體的小鼠相較于接受SET-2細(xì)胞的小鼠顯示白血病負(fù)荷的急劇減小。腫瘤抑制與T細(xì)胞保留相關(guān)聯(lián)，如圖7B中顯示的。

圖7顯示ESK-雙特異性抗體消除NSG小鼠中的腹膜間皮瘤細(xì)胞。將3000個(gè)JMN細(xì)胞與6000個(gè)EBV-特異性T細(xì)胞混合，并將其腹膜內(nèi)注射入小鼠。1小時(shí)后，靜脈內(nèi)注射ESK或?qū)φ针p特異性抗體，并在連續(xù)5天重復(fù)該過(guò)程。通過(guò)在指定的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行螢火蟲(chóng)生物發(fā)光成像來(lái)監(jiān)測(cè)腫瘤發(fā)展。(7A)第1天(處理后1天)在利用ESK-雙特異性抗體處理的小鼠中未顯示可見(jiàn)的腫瘤，這表明腫瘤細(xì)胞的消除。(7B)來(lái)自5只小鼠的平均光子/秒顯示在超過(guò)3周后利用ESK-雙特異性抗體處理的小鼠中的腫瘤負(fù)荷的將近100倍的減小。

圖8顯示比較ESK1-L2K雙特異性抗體的結(jié)合與ET901+L2K雙特異性抗體和ET901+OKT3雙特異性抗體的結(jié)合的FACS結(jié)合分析的結(jié)果。

圖9顯示比較ESK1-L2K雙特異性抗體的結(jié)合與ET901+L2K雙特異性抗體和ET901+OKT3雙特異性抗體的結(jié)合的FACS結(jié)合分析的結(jié)果。

圖10顯示包含特異性結(jié)合于WT1/HLA-A2的scFv和特異性結(jié)合于Cd3的scFv的雙特異性抗體的實(shí)施方案的氨基酸序列(SEQ ID NO:110)。

圖11A為1)ESK1/OKT3(2μg，還原的)；2)901/OKT3(2μg，還原的)；3)SeeBlue Plus預(yù)染色的標(biāo)準(zhǔn)；4)ESK1/OKT3(2μg，非還原的)；5)901/OKT3(2μg，非還原的)的PAGE。11B顯示標(biāo)準(zhǔn)。

圖12顯示抗WT1/HLA-A2復(fù)合物的ESK1雙特異性單克隆抗體的締合和離解。

圖13顯示通過(guò)ESK1/OKT3雙特異性單克隆抗體(13A)和ESK1與OKT3的混合物(13B)的陽(yáng)離子交換層析進(jìn)行的純化的結(jié)果。

圖14顯示通過(guò)ET901/OKT3雙特異性單克隆抗體(14A)和901與OKT3的混合物(14B)的陽(yáng)離子交換層析進(jìn)行的純化的結(jié)果。

圖15顯示通過(guò)FACS顯示的對(duì)CD3-陽(yáng)性Jurkat細(xì)胞的結(jié)合。

圖16顯示ESK-雙特異性抗體在自體背景中誘導(dǎo)T細(xì)胞活化。在20μg/ml的ESK或?qū)φ?雙特異性抗體存在或不存在的情況下，將來(lái)自具有AML的HLA-A2+患者(復(fù)發(fā)前)的PBMC與純化的自體CD33+骨髓母細(xì)胞(復(fù)發(fā)后)共培養(yǎng)，在第3和第4天用CD33(針對(duì)母細(xì)胞)(16B)和CD3(針對(duì)T細(xì)胞)(16A)進(jìn)行雙重染色，以評(píng)估CD3T細(xì)胞和母細(xì)胞的百分比。通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)來(lái)自CD3+(16C)和CD33+(16D)培養(yǎng)物的活細(xì)胞，通過(guò)將每一個(gè)群體的百分比乘以總細(xì)胞數(shù)來(lái)獲得絕對(duì)細(xì)胞數(shù)目。

圖17顯示ESK-雙特異性抗體的藥代動(dòng)力學(xué)。數(shù)據(jù)代表3只小鼠/組的平均值。(17A)使用ESK雙特異性抗體靜脈內(nèi)注射入C57BL6/J或腹膜內(nèi)注射入BALB/c的示蹤¹²⁵I-標(biāo)記的構(gòu)建體測(cè)定ESK雙特異性抗體的藥代動(dòng)力學(xué)，在48-52小時(shí)內(nèi)測(cè)量血液放射性。靜脈內(nèi)注射的雙特異性抗體以30分鐘的α半衰期迅速地從血液再分配至組織，隨后以5小時(shí)的β半衰期被清除。在腹膜內(nèi)遞送后，雙特異性抗體水平在血液中升高，在注射后3小時(shí)達(dá)到峰值。隨后構(gòu)建體以相同的β半衰期被清除。來(lái)自靜脈內(nèi)注射的總暴露(曲線下面積)大于對(duì)于腹膜內(nèi)注射的總暴露。(17B)使用相同的放射性標(biāo)記的構(gòu)建體測(cè)定抗體的生物分布模式。2小時(shí)后，在除胃和腸道外的主要組織中檢測(cè)到3％或更少的注射的劑量/克，所述胃和腸道清除脫鹵碘。4小時(shí)后，在除胃外的主要組織中檢測(cè)到2％或更少的注射的劑量/克。7小時(shí)后，在除胃外的主要組織中檢測(cè)到1％或更少的注射的劑量/克。

圖18顯示原發(fā)性卵巢癌細(xì)胞上的腫瘤抗原的表達(dá)。(18A)通過(guò)用綴合于FITC的抗-人HLA-A2mAb克隆BB7.2和其同種型對(duì)照小鼠IgG2b/FITC對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行染色來(lái)測(cè)量原發(fā)性卵巢癌細(xì)胞上的HLA-A2的表達(dá)。(18B)通過(guò)用3μg/ml的綴合于APC的mAb ESK和其同種型對(duì)照人IgG1/APC對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色來(lái)測(cè)量相同腫瘤細(xì)胞上的WT1RMF/HLA-A2復(fù)合物的表達(dá)。通過(guò)用10μg/ml或1μg/ml的赫賽汀，隨后用綴合于FITC的山羊抗-人IgG1mAb對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色來(lái)測(cè)量相同腫瘤細(xì)胞上的Her2-neu表達(dá)。將利妥昔單抗用作同種型對(duì)照。

圖19顯示ESK-雙特異性抗體誘導(dǎo)針對(duì)HLA-A2分子的背景中的除WT1RMF外的表位的二次T細(xì)胞應(yīng)答。(19A)在0.1μg/ml的ESK-雙特異性抗體或?qū)φ针p特異性抗體、人IL-5(5ng/ml)和人IL-2(10個(gè)單位/ml)存在的情況下，以5:1的效應(yīng)子:靶比率利用自體腫瘤細(xì)胞刺激來(lái)自卵巢癌患者的PBMC持續(xù)1周，以及通過(guò)針對(duì)用20μg/ml的指定的肽脈沖的T2細(xì)胞進(jìn)行的IFN-g elispot測(cè)定測(cè)量表位特異性應(yīng)答。(19B)以相同的方式，以9:1的效應(yīng)子:靶比率再刺激來(lái)自(A)中的實(shí)驗(yàn)的剩余的PBMC，以及通過(guò)IFN-g elispot測(cè)定測(cè)量表位特異性T細(xì)胞應(yīng)答。進(jìn)行相同的刺激方案和IFN-g elispot測(cè)定以比較(19C)純化的CD3+T細(xì)胞對(duì)比耗竭了NK和巨噬細(xì)胞(指定為T(mén)+B)的PBMC、或(19D)PBMC對(duì)比純化的CD3+T細(xì)胞或利用死亡的自體腫瘤細(xì)胞刺激的T細(xì)胞之間的表位特異性T細(xì)胞應(yīng)答。通過(guò)頻繁的凍融而不使用DMSO來(lái)產(chǎn)生死亡的腫瘤細(xì)胞。數(shù)據(jù)代表一式三份培養(yǎng)物的平均值+/-SD。在3小時(shí)、3天和6天后收集在0.1μg/ml的雙特異性抗體存在或不存在的情況下的來(lái)自PBMC或純化的T細(xì)胞與自體卵巢癌細(xì)胞的共培養(yǎng)物的上清液，以及通過(guò)ELISA試劑盒測(cè)量IFN-γ(19E)和TNF-α(19F)。

圖20顯示通過(guò)用不同濃度的小鼠抗-人CD86mAb/PerCp或其同種型對(duì)照對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色測(cè)量的，來(lái)自正常供體的PBMC(頂圖)和來(lái)自患者的卵巢癌細(xì)胞(底圖)上的共刺激分子CD86表達(dá)。同種型對(duì)照：1:50、100和200倍稀釋?？?CD86抗體：1:50、100和200倍稀釋。

圖21顯示長(zhǎng)壽命的細(xì)胞毒性效應(yīng)細(xì)胞的產(chǎn)生。(21A)在于自體腫瘤細(xì)胞存在的情況下用ESK-雙特異性抗體(0.1μg/ml)活化之前，和之后7周用CD4、CD8、CD45RA、CD45RO和CCR7對(duì)圖19中的來(lái)自患者的PBMC進(jìn)行染色。顯示了門(mén)控的CD8T細(xì)胞上的CD45RA和CD45RO對(duì)比CCR 7。(21B)如通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)量的在雙特異性抗體活化后7周CD8T細(xì)胞的大的選擇性增加。(21C)通過(guò)每周補(bǔ)充IL-15(5ng/ml)和IL-2(10U/ml)(持續(xù)5周)來(lái)擴(kuò)增來(lái)自圖19中顯示的實(shí)驗(yàn)的效應(yīng)細(xì)胞，以及通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)⁵¹Cr-釋放測(cè)定來(lái)針對(duì)自體腫瘤、SET-2和HL-60細(xì)胞測(cè)量細(xì)胞毒性。數(shù)據(jù)代表一式三份孔的平均值。

發(fā)明詳述

本文中引用的所有出版物、專利和其他參考文獻(xiàn)通過(guò)引用整體并入本公開(kāi)內(nèi)容。除非另外明確地指出，否則通過(guò)引用并入的主題被認(rèn)為不是對(duì)任何權(quán)利要求限制的替代。

除非本文另有定義，否則與本發(fā)明結(jié)合使用的科學(xué)和技術(shù)術(shù)語(yǔ)應(yīng)當(dāng)具有由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。此外，除非上下文另有要求，否則單數(shù)術(shù)語(yǔ)應(yīng)當(dāng)包括復(fù)數(shù)，并且復(fù)數(shù)術(shù)語(yǔ)應(yīng)包括單數(shù)。通常地，與細(xì)胞和組織培養(yǎng)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、遺傳學(xué)以及蛋白質(zhì)和核酸化學(xué)和本文所述的雜交的技術(shù)結(jié)合使用的術(shù)語(yǔ)以及所述技術(shù)為本領(lǐng)域中公知和常用的那些術(shù)語(yǔ)和技術(shù)。在實(shí)施本發(fā)明中，使用免疫學(xué)中的許多常規(guī)技術(shù)，所述技術(shù)在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力之內(nèi)。這些技術(shù)更詳細(xì)地描述于例如"Current Protocols in Immunology"(John E.Coligan等，編輯，John Wiley&Sons,Inc.1991和定期更新)；Recombinant Antibodies for Immunotherapy,Melvyn Little，編輯Cambridge University Press 2009中。被本領(lǐng)域技術(shù)人員是廣泛已知的和依賴于本領(lǐng)域技術(shù)人員的這些參考文獻(xiàn)和含有標(biāo)準(zhǔn)方案的其他參考文獻(xiàn)的內(nèi)容，包括制造商的說(shuō)明書(shū)和劑量信息，在此通過(guò)引用作為本公開(kāi)的部分并入。

以下縮寫(xiě)用于整個(gè)申請(qǐng)中，并且通常旨在被與本領(lǐng)域中已知的所述術(shù)語(yǔ)的含義一致地解釋：

Ab：抗體

ADCC：抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性

ALL：急性淋巴細(xì)胞白血病

AML：急性髓系白血病

BiTE：雙特異性T細(xì)胞接合子

CDC：補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性

CMC：補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性

CDR：互補(bǔ)決定區(qū)(也參見(jiàn)下面的HVR)

CL：輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域

CH1：重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域

CH1、2、3：重鏈的第1、第2和第3恒定結(jié)構(gòu)域

CH2、3：重鏈的第2和第3恒定結(jié)構(gòu)域

CHO：中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢

CML：慢性粒細(xì)胞性白血?。灰卜Q為慢性髓細(xì)胞性白血病和慢性髓性白血病

CTL：細(xì)胞毒性T細(xì)胞

E:T比率：效應(yīng)子:靶比率

Fab：抗體結(jié)合片段

FACS：熒光活化細(xì)胞分選

FBS：胎牛血清

FR：框架區(qū)

GVHD：移植物抗宿主病

HC：重鏈

HLA：人白細(xì)胞抗原

HVR-H：高變區(qū)-重鏈(也參見(jiàn)CDR)

HVR-L：高變區(qū)-輕鏈(也參見(jiàn)CDR)

Ig：免疫球蛋白

KD：解離常數(shù)

k_off：解離速率

k_on：締合速率

MHC：主要組織相容性復(fù)合物

MM：多發(fā)性骨髓瘤

scFv：?jiǎn)捂溈勺兤?/p>

V_H：可變重鏈包括重鏈高變區(qū)和重鏈可變框架區(qū)

V_L：可變輕鏈包括輕鏈高變區(qū)和輕鏈可變框架區(qū)

WT1：腎母細(xì)胞瘤蛋白1

在下面的說(shuō)明中，本文中所用的術(shù)語(yǔ)旨在被與這些術(shù)語(yǔ)正如它們被本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的一樣的含義一致地解釋。本文在下面提供的定義意在澄清而非限制定義的術(shù)語(yǔ)。

如本文中所用，"施用"是指向受試者的身體施加活性成分。

"抗體"，正如這些術(shù)語(yǔ)在本領(lǐng)域中所為人已知的，是指免疫系統(tǒng)的抗原結(jié)合蛋白。術(shù)語(yǔ)"抗體"，如本文中提及的，包括具有抗原結(jié)合區(qū)的完整、全長(zhǎng)抗體，其中“抗原結(jié)合部分”或“抗原結(jié)合區(qū)”得以保留的其任意片段，或其單鏈，例如，單鏈可變片段(scFv)。天然存在的"抗體"是包含通過(guò)二硫鍵鏈間連接(inter-connected)的至少兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈。每一條重鏈由重鏈可變區(qū)(在本文中縮寫(xiě)為VH)和重鏈恒定(CH)區(qū)組成。重鏈恒定區(qū)由3個(gè)結(jié)構(gòu)域CH1、CH2和CH3組成。每一條輕鏈由輕鏈可變區(qū)(在本文中縮寫(xiě)為VL)和輕鏈恒定CL區(qū)組成。輕鏈恒定區(qū)由一個(gè)結(jié)構(gòu)域CL組成。VH和VL區(qū)可被進(jìn)一步細(xì)分成間插以稱為框架區(qū)(FR)的更加保守的區(qū)域的稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的高變區(qū)。每一個(gè)VH和VL由按以下順序從氨基末端至羧基末端排列的3個(gè)CDR和4個(gè)FR組成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重和輕鏈的可變區(qū)含有與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？贵w的恒定區(qū)可介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或因子，包括免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞(例如，效應(yīng)細(xì)胞)和經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第一組分(C1q)的結(jié)合。

如本文中所用，術(shù)語(yǔ)抗體的“抗原結(jié)合部分”或“抗原結(jié)合區(qū)”是指結(jié)合抗原并且賦予抗體抗原特異性的抗體的區(qū)域或部分；抗原結(jié)合蛋白的片段，例如，抗體包括保留特異性結(jié)合抗原(例如，肽/HLA復(fù)合體)的能力的抗體的一個(gè)或多個(gè)片段。已顯示，抗體的抗原結(jié)合功能可通過(guò)全長(zhǎng)抗體的片段來(lái)進(jìn)行。術(shù)語(yǔ)抗體的“抗體片段”所涵蓋的抗原結(jié)合片段的實(shí)例包括Fab片段；由VL、VH、CL和CH1結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段；F(ab)2片段、包含通過(guò)鉸鏈區(qū)的二硫橋鍵連接的兩個(gè)Fab片段的二價(jià)片段；由VH和CH1結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；由抗體的單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；dAb片段(Ward等，Nature 1989；341:544-546)，其由VH結(jié)構(gòu)域組成；和分離的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。

此外，盡管Fv片段的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域VL和VH由分開(kāi)的基因編碼，但可使用重組方法，通過(guò)合成接頭將它們聯(lián)接，所述接頭使得它們能夠被產(chǎn)生為其中VL和VH區(qū)配對(duì)以形成單價(jià)分子的單一蛋白質(zhì)鏈。這些被稱為單鏈Fv(scFv)；參見(jiàn)例如，Bird等，1988Science 242:423-426；和Huston等，1988Proc.Natl.Acad.Sci.85:5879-5883。這些抗體片段可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)來(lái)獲得，并且以與針對(duì)完整抗體所使用的方式相同的方式來(lái)篩選所述片段的效用。

如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“有效量”意指將會(huì)引發(fā)例如由研究人員或臨床醫(yī)師正在尋求的組織、系統(tǒng)、動(dòng)物或人的生物或醫(yī)學(xué)反應(yīng)的化合物或治療劑的量。

術(shù)語(yǔ)“治療有效量”意指相較于未曾接受此量的相應(yīng)受試者，導(dǎo)致疾病、病癥或副作用的改進(jìn)的治療、治愈、預(yù)防或改善或疾病或病癥的進(jìn)展速率的減小的任何量。所述術(shù)語(yǔ)還在其范圍內(nèi)包括有效地增強(qiáng)正常生理功能的量。.

本公開(kāi)提供了與雙特異性抗體相關(guān)的組合物和治療方法。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了在受試者刺激初次T細(xì)胞應(yīng)答和二次T細(xì)胞應(yīng)答的方法，所述方法包括施用包含重組抗體的組合物，所述重組抗體包含第一抗原結(jié)合部分和第二抗原結(jié)合部分，其中所述第一抗原結(jié)合部分特異性結(jié)合第一腫瘤抗原并且所述第二抗原結(jié)合部分特異性結(jié)合免疫效應(yīng)細(xì)胞表面抗原，其中所述初級(jí)T細(xì)胞響應(yīng)包括刺激針對(duì)第一腫瘤抗原的細(xì)胞毒性T細(xì)胞，并且其中所述二次T細(xì)胞應(yīng)答包括刺激針對(duì)所述第一腫瘤抗原和/或針對(duì)第二腫瘤抗原的效應(yīng)T細(xì)胞和/或記憶T細(xì)胞。在一個(gè)方面，所述第一腫瘤抗原為WT1/HLA并且所述第二腫瘤抗原為非-WT1-RMF腫瘤抗原。在相關(guān)方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生針對(duì)腫瘤抗原(任選地非-WT1-RMF腫瘤抗原諸如HER2-neu)的效應(yīng)T細(xì)胞和/或記憶T細(xì)胞的方法。本公開(kāi)的方法還可包括施用免疫效應(yīng)細(xì)胞，例如，細(xì)胞毒性細(xì)胞諸如CD3+細(xì)胞毒性T細(xì)胞。通過(guò)產(chǎn)生效應(yīng)T細(xì)胞，例如針對(duì)腫瘤抗原的細(xì)胞毒性T細(xì)胞和/或記憶T細(xì)胞，本公開(kāi)的雙特異性抗體從而能夠?qū)崿F(xiàn)抗腫瘤細(xì)胞的疫苗作用，并且可用于產(chǎn)生用于過(guò)繼T細(xì)胞療法的細(xì)胞。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于殺傷WT1陽(yáng)性細(xì)胞的改進(jìn)的抗-WT1抗體。所述改進(jìn)的抗-WT1抗體為雙特異性抗體，其具有特異性結(jié)合WT1(當(dāng)其以受組織相容性限制的方式利用HLA速遞時(shí))的第一抗原結(jié)合部分，和特異性結(jié)合免疫效應(yīng)細(xì)胞表面上的細(xì)胞表面抗原例如CD3，從而能夠嚙合免疫效應(yīng)細(xì)胞，例如CD3⁺T細(xì)胞(即，細(xì)胞毒性T細(xì)胞)的第二抗原結(jié)合部分。在一個(gè)方面，根據(jù)本公開(kāi)的重組抗體或其衍生物或片段包含：(i)第一抗原結(jié)合部分，其包含：(A)包含含有表1-6中所示的氨基酸序列的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3的重鏈(HC)可變區(qū)；和包含含有表1-6中所示的氨基酸序列的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3的輕鏈(LC)可變區(qū)；(B)包含表1-6中所示的第一氨基酸序列和第二氨基酸序列的VH和VL；或(C)包含表1-6中所示的氨基酸序列的scFv；和(ii)包含表7中所示的氨基酸序列的第二抗原結(jié)合部分。在一個(gè)方面，所述第一抗原結(jié)合部分和/或第二抗原結(jié)合部分是抗體片段。抗體片段的實(shí)例包括，但不限于Fab片段；由VL、VH、CL和CH1結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段；F(ab)2片段；包含通過(guò)鉸鏈區(qū)的二硫橋鍵連接的兩個(gè)Fab片段的二價(jià)片段；由VH和CH1結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；由抗體的單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；dAb片段；分離的CDR；和scFv。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述雙特異性抗體具有第一結(jié)合部分，所述第一結(jié)合部分具有包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的可變重鏈區(qū)和包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的可變輕鏈區(qū)或具有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的scFv。此外，所述雙特異性抗體具有第二結(jié)合部分，所述第二結(jié)合部分包含含有SEQ ID NO:111的氨基酸序列的L2K重鏈可變區(qū)和含有SEQ ID NO:112的氨基酸序列的L2K輕鏈可變區(qū)。

在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙特異性抗-WT1抗體的WT1/HLA結(jié)合部分包含表1-6或8中所列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列(scFv、VH和VL區(qū)或CDR)。

在下面表1-7中的序列中，粗體文本指示高變重鏈與輕鏈序列之間的接頭序列。

在一些實(shí)施方案中，所述抗體包含用于純化的組氨酸標(biāo)簽。在一些實(shí)施方案中，所述抗體包含信號(hào)肽和一個(gè)或多個(gè)包含甘氨酸和絲氨酸殘基的接頭。

表1

表2

表3

表4

表5

表6

表7

在一個(gè)實(shí)施方案中，ESK1-雙特異性抗體包含特異性結(jié)合WT1/HLA-A2并且包含如表1-6中所示的WT1/HLA-A2抗體的氨基酸序列之一的第一抗原結(jié)合部分，和結(jié)合CD3并且包含上表7中顯示的氨基酸序列的抗原結(jié)合部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體具有圖10中顯示的氨基酸序列(SEQ ID NO:110)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，ESK1-雙特異性抗體包含特異性結(jié)合WT1/HLA-A2并且包含如表8中所示的WT1/HLA-A2抗體的氨基酸序列之一的第一抗原結(jié)合部分，和結(jié)合OKT3并且包含表9中所示的氨基酸序列的抗原結(jié)合部分。

表8

表9

本公開(kāi)的重組雙特異性抗體還包含大體上同源的多肽，其具有與表1-9中描述的肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的抗原結(jié)合部分。

根據(jù)本公開(kāi)的雙特異性抗體可通過(guò)許多常規(guī)技術(shù)的任何技術(shù)來(lái)制備。例如，可使用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)在重組表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生它們。參見(jiàn)，例如，Monoclonal Antibodies,Hybridomas:A New Dimension in Biological Analyses,Kennet等(編輯),Plenum Press,New York(1980)；和Antibodies:A Laboratory Manual,Harlow和Land(編輯),Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1988)。某些技術(shù)包括分離編碼目標(biāo)抗體的多肽鏈(或其部分)的核酸，和通過(guò)重組DNA技術(shù)操作所述核酸。可將所述核酸與另一個(gè)目標(biāo)核酸融合，或?qū)ζ溥M(jìn)行改變(例如，通過(guò)誘變或其他常規(guī)技術(shù))以添加、刪除或取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。

本領(lǐng)域中已知的任何表達(dá)系統(tǒng)可用于產(chǎn)生本公開(kāi)的重組雙特異性抗體。通常地，用包含編碼所需多肽的DNA的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。可使用的宿主細(xì)胞當(dāng)中有原核生物細(xì)胞、酵母細(xì)胞或高等真核生物細(xì)胞。原核生物包括革蘭陰性或革蘭陽(yáng)性生物，例如大腸桿菌(E.coli)或和芽孢桿菌屬(bacilli)。高等真核生物細(xì)胞包括昆蟲(chóng)細(xì)胞和哺乳動(dòng)物來(lái)源的已建立的細(xì)胞系。合適的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系的實(shí)例包括猴腎細(xì)胞(ATCC CRL 1651)的COS-7品系(Gluzman等，1981,Cell 23:175)、L細(xì)胞系、293細(xì)胞系、C127細(xì)胞系、3T3細(xì)胞(ATCC CCL 163)、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系、HeLa細(xì)胞系、BHK(ATCC CRL 10)細(xì)胞系和來(lái)源于非洲綠猴腎細(xì)胞系CVI(ATCC CCL 70)的CVI/EBNA細(xì)胞系，如由McMahan等，1991,EMBO J.10:2821描述的。用于細(xì)菌、真菌、酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞宿主的適當(dāng)?shù)目寺『捅磉_(dá)載體例如由Pouwels等，Cloning Vectors:A Laboratory Manual,Elsevier,N.Y.,1985在本領(lǐng)域中進(jìn)行了描述。

可在促進(jìn)多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，并通過(guò)常規(guī)蛋白質(zhì)純化方法回收多肽。一個(gè)這樣的純化方法包括例如在使全部或一部分抗原結(jié)合于其的基質(zhì)上使用親和層析。被考慮用于本文中的多肽包括大體上不含污染性內(nèi)源材料的大體上均一的重組雙特異性抗體。

在一個(gè)方面，從用編碼具有第一抗原結(jié)合部分和第二抗原結(jié)合部分的肽的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞產(chǎn)生根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容的雙特異性抗體。在另一個(gè)方面，從兩個(gè)單獨(dú)的抗體(即，例如使用二硫鍵連接的具有第一抗原結(jié)合部分的抗體和具有第二抗原結(jié)合部分的抗體)產(chǎn)生本公開(kāi)的雙特異性抗體。

本文中公開(kāi)的雙特異性抗體的氨基酸序列可以通過(guò)本領(lǐng)域中已知的任何方法進(jìn)行驗(yàn)證，并且可與本文在表1-9中公開(kāi)的序列相同，或作為加工的結(jié)果可在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基上與這些序列相異。例如，在所有或一部分大體上同源的雙特異性抗體上，可通過(guò)蛋白水解加工或在培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)生的其他加工，例如C末端Lys殘基的加工來(lái)除去來(lái)自輕鏈或重鏈(或相關(guān)單鏈分子)的C-末端氨基酸?；蛘?，可以除去不止一個(gè)C末端氨基酸殘基，例如2個(gè)C-末端氨基酸，或3、4或5個(gè)C-末端氨基酸。類似地，N-末端氨基酸可以不存在，例如，1、2、3、4或5個(gè)N末端氨基酸可以不存在。

可選擇地，或另外地，所述雙特異性抗體可經(jīng)歷翻譯后修飾，例如但不限于，可將谷氨酰胺環(huán)化或轉(zhuǎn)化成焦谷氨酸；另外地或可選擇地，氨基酸可經(jīng)歷脫酰胺、異構(gòu)化、糖基化和/或氧化。本發(fā)明的多肽可經(jīng)歷另外的翻譯后修飾，包括在本領(lǐng)域中公知的位點(diǎn)上的糖基化，例如N-連接或O-連接糖基化。如先前所述，可在多肽的氨基酸序列中產(chǎn)生變化以排除此類選擇或從使此類選擇最少化，或在其中此類加工是有益的環(huán)境中促進(jìn)它們。

根據(jù)本公開(kāi)的雙特異性抗體包括已以任何方式和出于任何理由被修飾以實(shí)現(xiàn)以下目的的多肽：(1)降低對(duì)蛋白水解的易感性，(2)降低對(duì)氧化的易感性，(3)改變結(jié)合親和力以形成蛋白質(zhì)復(fù)合物，(4)改變結(jié)合親和力，和(4)賦予或修改其他物理化學(xué)或功能性質(zhì)。另外，在表1-9的任何表中描述的序列中(例如，在形成分子間接觸的結(jié)構(gòu)域外部的多肽的部分中)產(chǎn)生的單個(gè)或多個(gè)氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)(例如，在部分的多肽的域形成分子間接觸外)包括本公開(kāi)中。還可使用利用相同類型的D-氨基酸(例如，D-賴氨酸替代L-賴氨酸)進(jìn)行的對(duì)共有序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的系統(tǒng)性取代，例如，以產(chǎn)生更穩(wěn)定的肽秒。另外，共有序列可用于選擇用于取代的氨基酸殘基；本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到，另外的氨基酸殘基也可被取代。包含共有序列或大體上相同的共有序列變化的約束肽可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法產(chǎn)生(Rizo和Gierasch Ann.Rev.Biochem.61:387(1992))，通過(guò)引用并入本文)。

根據(jù)本公開(kāi)的雙特異性抗體可包含在本領(lǐng)域中已知的任何恒定區(qū)。輕鏈恒定區(qū)可以是，例如，κ或λ型輕鏈恒定區(qū)，例如，人κ或λ型輕鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)可以是，例如，α、δ、ε，γ或μ型重鏈恒定區(qū)，例如，人α、δ、ε，γ或μ型重鏈恒定區(qū)。在一個(gè)方面中，輕鏈或重鏈恒定區(qū)是天然存在的恒定區(qū)的片段、衍生物、變體或突變蛋白。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及本公開(kāi)的雙特異性抗體的衍生物或類似物。衍生物可包含賦予所需性質(zhì)諸如特定用途中的增加的半衰期的任何分子或物質(zhì)。可用于形成衍生物的分子的實(shí)例包括，但不限于白蛋白(例如，人血清白蛋白)和聚乙二醇(PEG)。衍生物諸如抗體的白蛋白連接的和PEG化衍生物可使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)來(lái)制備。類似物可以是本文所述的雙特異性抗體的非肽類似物。非肽類似物通常用于制藥工業(yè)，如具有與模板肽的那些性質(zhì)類似的性質(zhì)的藥物。這些類型的非肽化合物被稱為“肽模擬物”或“擬肽”。參見(jiàn)，例如，F(xiàn)auchere,J.Adv.Drug Res.15:29(1986)；Veber和Freidinger TINS p.392(1985)；和Evans等J.Med.Chem.30:1229(1987)，所述文獻(xiàn)通過(guò)引用并入本文。結(jié)構(gòu)上與本公開(kāi)的雙特異性抗體相似的肽模擬物可用于產(chǎn)生等同的治療或預(yù)防作用。通常地，擬肽在結(jié)構(gòu)上與范式多肽(即，具有所需生化性質(zhì)或藥理活性的多肽)諸如人抗體相似，但具有一個(gè)或多個(gè)任選地被選自由以下組成的組的鍵聯(lián)替代(通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法)的肽鍵聯(lián)：—CH₂NH—、—CH₂S—、—CH₂—CH₂—、—CH═CH-(順式和反式)、—COCH₂—、—CH(OH)CH₂—和—CH₂SO—。

在一個(gè)方面，根據(jù)本公開(kāi)的重組雙特異性抗體包含：(I)含有如下部分之一的第一抗原結(jié)合部分：(A)包含選自由以下組成的組的氨基酸序列的scFV：SEQ ID NO:18、36、54、72、90、108和132；或(B)重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)，其中所述VH和VL分別包含選自由以下組成的組的氨基酸序列：SEQ ID NO:(i)14和16；(ii)32和34；(iii)50和52；(iv)68和70；(v)86和88；(vi)104和106；(vii)128和130；或(C)(i)隨后3個(gè)VH互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)：(a)包含選自由以下組成的組的氨基酸序列的VH CDR1：SEQ ID NO:2、20、38、56、74、92和116；和(b)包含選自由以下組成的組的氨基酸序列的VH CDR2：SEQ ID NO:3、21、39、57、75、93和117；和(c)包含選自由以下組成的組的氨基酸序列的VH CDR3：SEQ ID NO:4、22、40、58、76、94和118；和(ii)隨后3個(gè)VL CDR：(a)包含選自由以下組成的組的氨基酸序列的VL CDR1：SEQ ID NO:8、26、44、62、80、98和122；和(b)包含選自由以下組成的組的氨基酸序列的VL CDR2：SEQ ID NO:9、27、45、63、81、99,和123；和(c)包含選自由以下組成的組的氨基酸序列的VL CDR3：SEQ ID NO:10、28、46、64、82、100和124；和(II)包含以下部分的第二抗原結(jié)合部分：(A)包含SEQ ID NO:113中所示的氨基酸序列的單鏈可變片段(scFV)；或(B)重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)，其中所述VH和VL分別包含SEQ ID NO:111和112或SEQ ID NO:134和136中所示的氨基酸序列。

在一個(gè)方面，所述重組抗體包含含有如下部分之一的第一抗原結(jié)合部分：(A)包含SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列的scFV；或(B)包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:16中所示的氨基酸序列的VL；或(C)包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的VH CDR1；包含SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列的VH CDR2；包含SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列的VH CDR3；包含SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列的VL CDR1；包含SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列的VL CDR2；和包含SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列的VL CDR3。

在另一個(gè)方面，所述重組抗體包含含有如下部分之一的第一抗原結(jié)合部分：(A)包含SEQ ID NO:36中所示的氨基酸序列的scFV；或(B)包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:34中所示的氨基酸序列的VL；或(C)包含SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列的VH CDR1；包含SEQ ID NO:21中所示的氨基酸序列的VH CDR2；包含SEQ ID NO:22中所示的氨基酸序列的VH CDR3；包含SEQ ID NO:26中所示的氨基酸序列的VL CDR1；包含SEQ ID NO:27中所示的氨基酸序列的VL CDR2；和包含SEQ ID NO:28中所示的氨基酸序列的VL CDR3。

在另一個(gè)方面，所述重組抗體包含含有如下部分之一的第一抗原結(jié)合部分：(A)包含SEQ ID NO:54中所示的氨基酸序列的scFV；或(B)包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:52中所示的氨基酸序列的VL；或(C)包含SEQ ID NO:38中所示的氨基酸序列的VH CDR1；包含SEQ ID NO:39中所示的氨基酸序列的VH CDR2；包含SEQ ID NO:40中所示的氨基酸序列的VH CDR3；包含SEQ ID NO:44中所示的氨基酸序列的VL CDR1；包含SEQ ID NO:45中所示的氨基酸序列的VL CDR2；和包含SEQ ID NO:46中所示的氨基酸序列的VL CDR3。

在另一個(gè)方面，所述重組抗體包含含有如下部分之一的第一抗原結(jié)合部分：(A)包含SEQ ID NO:72中所示的氨基酸序列的scFV；或(B)包含SEQ ID NO:68所示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:70中所示的氨基酸序列的VL；或(C)包含SEQ ID NO:56中所示的氨基酸序列的VH CDR1；包含SEQ ID NO:57中所示的氨基酸序列的VH CDR2；包含SEQ ID NO:58中所示的氨基酸序列的VH CDR3；包含SEQ ID NO:62中所示的氨基酸序列的VL CDR1；包含SEQ ID NO:63中所示的氨基酸序列的VL CDR2；和包含SEQ ID NO:64中所示的氨基酸序列的VL CDR3。

在另一個(gè)方面，所述重組抗體包含含有如下部分之一的第一抗原結(jié)合部分：(A)包含SEQ ID NO:90中所示的氨基酸序列的scFV；或(B)包含SEQ ID NO:86所示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:88中所示的氨基酸序列的VL；或(C)包含SEQ ID NO:74中所示的氨基酸序列的VH CDR1；包含SEQ ID NO:75中所示的氨基酸序列的VH CDR2；包含SEQ ID NO:76中所示的氨基酸序列的VH CDR3；包含SEQ ID NO:80中所示的氨基酸序列的VL CDR1；包含SEQ ID NO:81中所示的氨基酸序列的VL CDR2；和包含SEQ ID NO:82中所示的氨基酸序列的VL CDR3。

在另一個(gè)方面，所述重組抗體包含含有如下部分之一的第一抗原結(jié)合部分：(A)包含SEQ ID NO:108中所示的氨基酸序列的scFV；或(B)包含SEQ ID NO:104所示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:106中所示的氨基酸序列的VL；或(C)包含SEQ ID NO:92中所示的氨基酸序列的VH CDR1；包含SEQ ID NO:93中所示的氨基酸序列的VH CDR2；包含SEQ ID NO:94中所示的氨基酸序列的VH CDR3；包含SEQ ID NO:98中所示的氨基酸序列的VL CDR1；包含SEQ ID NO:99中所示的氨基酸序列的VL CDR2；和包含SEQ ID NO:100中所示的氨基酸序列的VL CDR3。

在另一個(gè)方面，所述重組抗體包含含有如下部分之一的第一抗原結(jié)合部分：(A)包含SEQ ID NO:132中所示的氨基酸序列的scFV；或(B)包含SEQ ID NO:128所示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:130中所示的氨基酸序列的VL；或(C)包含SEQ ID NO:116中所示的氨基酸序列的VH CDR1；包含SEQ ID NO:117中所示的氨基酸序列的VH CDR2；包含SEQ ID NO:118中所示的氨基酸序列的VH CDR3；包含SEQ ID NO:122中所示的氨基酸序列的VL CDR1；包含SEQ ID NO:123中所示的氨基酸序列的VL CDR2；和包含SEQ ID NO:124中所示的氨基酸序列的VL CDR3。

在一個(gè)方面，根據(jù)本公開(kāi)的重組抗體包含第一抗原結(jié)合部分，所述第一抗原結(jié)合部分包含含有來(lái)自表1-6或8的任一個(gè)中的VH序列的CDR1、CDR2和CDR3的重鏈可變區(qū)和含有來(lái)自表1-6或8的任一個(gè)中的VL的CDR1、CDR2和CDR3的輕鏈可變區(qū)。例如，在一個(gè)方面，根據(jù)本公開(kāi)的重組抗體包含來(lái)自SEQ ID NO:50的CDR1、CDR2和CDR3的重鏈可變區(qū)和包含來(lái)自SEQ ID NO:52的CDR1、CDR2和CDR3的輕鏈可變區(qū)。在另一個(gè)方面，根據(jù)本公開(kāi)的重組抗體包含第一抗原結(jié)合部分，所述第一抗原結(jié)合部分包含含有來(lái)自表1-6或8的任一個(gè)中的VH序列的CDR1、CDR2和CDR3的重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)與該VH序列具有至少90％同一性，和/或包含含有來(lái)自同一表中的VL序列的CDR1、CDR2和CDR3的輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)與該VL序列具有至少90％同一性。例如，在一個(gè)方面，根據(jù)本公開(kāi)的重組抗體包含含有來(lái)自SEQ ID NO:50的CDR1、CDR2和CDR3的重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)與SEQ ID NO:50具有至少90％同一性，和/或包含含有來(lái)自SEQ ID NO:52的CDR1、CDR2和CDR3的輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)與SEQ ID NO:52具有至少90％同一性。

在另一個(gè)方面，根據(jù)本公開(kāi)的重組抗體包含第二抗原結(jié)合部分，所述第二抗原結(jié)合部分包含含有來(lái)自表7或表9中的VH序列的CDR1、CDR2和CDR3的重鏈可變區(qū)，和含有來(lái)自表7或表9中的VL序列的CDR1、CDR2和CDR3的輕鏈可變區(qū)。例如，在一個(gè)方面，根據(jù)本公開(kāi)的重組抗體包含含有來(lái)自SEQ ID NO:111的CDR1、CDR2和CDR3的重鏈可變區(qū)，和含有來(lái)自SEQ ID NO:112的CDR1、CDR2和CDR3的輕鏈可變區(qū)。在另一個(gè)方面，根據(jù)本公開(kāi)的重組抗體包含第一抗原結(jié)合部分，所述第一抗原結(jié)合部分包含含有來(lái)自表7和表9中的VH序列的CDR1、CDR2和CDR3的重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)與該VH序列具有至少90％同一性，和/或包含含有來(lái)自同一表中的VL序列的CDR1、CDR2和CDR3的輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)與該VL序列具有至少90％同一性。例如，在一個(gè)方面，根據(jù)本公開(kāi)的重組抗體包含來(lái)自SEQ ID NO:111的CDR1、CDR2和CDR3的重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)與SEQ ID NO:111具有至少90％同一性，和/或包含含有來(lái)自SEQ ID NO:112的CDR1、CDR2和CDR3的輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)與SEQ ID NO:112具有至少90％同一性。

在一個(gè)方面，本公開(kāi)的雙特異性抗體的第一抗原結(jié)合部分和/或第二抗原結(jié)合部分為scFv。在一個(gè)方面，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體包含含有SEQ ID NO:18、36、54、72、90、108或132中所示的氨基酸序列的scFV的第一抗原結(jié)合部分，和/或包含含有SEQ ID NO:113中所示的氨基酸序列的scFV的第二抗原結(jié)合部分。在另一個(gè)方面，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體包含含有來(lái)自SEQ ID NO:18、36、54、72、90、108或132所示的氨基酸序列的6個(gè)CDR(VH CDR1、CDR2和CDR3以及VL CDR1、CDR2和CDR3)并且與該scFV序列具有至少90％同一性的第一抗原結(jié)合部分，和/或含有來(lái)自SEQ ID NO:113中所示的氨基酸序列的6個(gè)CDR(VH CDR1、CDR2和CDR3以及VL CDR1、CDR2和CDR3)并且與該scFV序列具有至少90％同一性的第二抗原結(jié)合部分。

在一個(gè)方面，本公開(kāi)的重組雙特異性抗體的第一抗原結(jié)合部分特異性結(jié)合于WT1HLA，并且第二抗原結(jié)合部分特異性結(jié)合于免疫效應(yīng)細(xì)胞的表面上的抗原。在另一個(gè)方面，所述免疫效應(yīng)細(xì)胞選自由以下組成的組：天然殺傷(NK)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞及其組合。在另一個(gè)方面，所述免疫效應(yīng)細(xì)胞為CD3+細(xì)胞。在其他方面，所述重組抗體特異性結(jié)合于CD3。在一個(gè)方面，所述重組抗體結(jié)合于WT1-HLA2+細(xì)胞，例如，在其表面上具有低密度的WT1/HLA2的WT1/HLA2+細(xì)胞。

在一個(gè)方面，本發(fā)明提供編碼本文所述的重組抗體的核酸。在相關(guān)方面，利用包含本公開(kāi)的核酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。在一個(gè)方面，所述核酸包含表1-9的任一個(gè)中所示的DNA序列。

在另一個(gè)方面，本公開(kāi)提供了包含本文中所述的重組雙特異性抗體和生理上可接受的稀釋劑、賦形劑或載體的藥物組合物。任選地，所述組合物還另外地包含一種或多種生理活性劑，例如，抗-癌劑、佐劑或其他免疫刺激物質(zhì)，抗-血管生成物質(zhì)，止痛劑物質(zhì)等。在各種具體的實(shí)施方案中，所述組合物，除了重組雙特異性抗體以外，還包含1、2、3、4、5或6種生理活性劑。

在一個(gè)方面，本公開(kāi)的藥物組合物包含本文所述的重組抗體和選自由以下組成的組的一種或多種物質(zhì)：緩沖劑、抗氧化劑諸如抗壞血酸、低分子量多肽(諸如具有少于10個(gè)氨基酸的那些多肽)、蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類諸如葡萄糖、蔗糖或糊精、螯合劑諸如EDTA、谷胱甘肽、穩(wěn)定劑和賦形劑。與血清白蛋白混合的中性緩沖鹽水或鹽水是合適的稀釋劑的實(shí)例。根據(jù)適當(dāng)?shù)男袠I(yè)標(biāo)準(zhǔn)，還可添加防腐劑諸如芐醇。液體藥物組合物可以包括，例如，如下物質(zhì)的一種或多種：無(wú)菌稀釋劑諸如注射用水，鹽水溶液，優(yōu)選生理鹽水，林格氏溶液，等滲氯化鈉，可作為溶劑或懸浮介質(zhì)的不揮發(fā)性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他溶劑；抗菌劑；抗氧化劑；螯合劑；緩沖液和用于調(diào)節(jié)張力的試劑諸如氯化鈉或右旋糖。可將腸胃外制劑封裝在安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多劑量小瓶中。生理鹽水的使用是優(yōu)選的，并且可注射的藥物組合物優(yōu)選是無(wú)菌的。在一個(gè)方面，可使用合適的賦形劑溶液(例如蔗糖)作為稀釋劑來(lái)將所述組合物配制成凍干產(chǎn)物。合適的組分在所使用的劑量和濃度下對(duì)于接受者是無(wú)毒的?？捎糜谒幬镏苿┑慕M分的其他實(shí)例示于Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版(1980)和第20版(2000),Mack Publishing Company,Easton,Pa中。

如本領(lǐng)域中所理解的，以適合于適應(yīng)征的方式向受試者施用包含本公開(kāi)的雙特異性抗體的藥物組合物。可將包含本文所述的重組抗體的本公開(kāi)的藥物組合物配制用于通過(guò)提供有效劑量的所述雙特異性抗體的任何途徑的遞送。藥物組合物可以通過(guò)任何合適的技術(shù)來(lái)施用，包括但不限于，腸胃外、局部或通過(guò)吸入。如果注射，則可以例如通過(guò)關(guān)節(jié)內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、病灶內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下途徑，通過(guò)推注或連續(xù)輸注施用藥物組合物?？稍O(shè)想局部施用(例如在腫瘤部位)，這可以是透皮遞送和從植入物的持續(xù)釋放。通過(guò)吸入的遞送包括，例如，經(jīng)鼻或口腔吸入、噴霧器的使用、以氣溶膠形式進(jìn)行的拮抗劑的吸入等。其他替代物包括眼藥水；口服制劑包括片劑、膠囊劑、糖漿、錠劑或口香糖；以及局部制劑諸如洗劑、凝膠、噴霧劑、貼片和軟膏。.

在一個(gè)方面，本公開(kāi)提供殺傷WT1陽(yáng)性細(xì)胞的方法，所述方法包括將所述細(xì)胞與本文所描述的重組雙特異性抗體和免疫效應(yīng)細(xì)胞接觸。本公開(kāi)還提供了治療具有WT1陽(yáng)性疾病的受試者的方法，所述方法包括向受試者施用治療有效量的本文所述的重組雙特異性抗體。在一個(gè)方面，所述方法還包括向受試者施用免疫效應(yīng)細(xì)胞。在一個(gè)方面，所述免疫效應(yīng)細(xì)胞是細(xì)胞毒性細(xì)胞，例如，天然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或T細(xì)胞。在一個(gè)方面，所述細(xì)胞毒性T細(xì)胞是CD3+細(xì)胞毒性T細(xì)胞，任選的自體T細(xì)胞。在一個(gè)方面，所述WT1陽(yáng)性疾病是白血病(慢性或急性)或WT1陽(yáng)性癌癥。WT1陽(yáng)性癌癥的實(shí)例包括，但不限于：慢性粒細(xì)胞性白血病、多發(fā)性骨髓瘤(MM)、急性淋巴母細(xì)胞性白血病(ALL)、急性髓性/髓系白血病(AML)、骨髓增生異常綜合征(MDS)、間皮瘤、卵巢癌、胃腸癌、乳腺癌、前列腺癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。

本公開(kāi)因此提供了治療癌癥的方法，所述方法包括向有此需要的患者施用治療有效量的本文所述的重組抗體或組合物。在一個(gè)方面，所述癌癥選自由以下組成的組：腎上腺癌、腺泡細(xì)胞癌、聽(tīng)神經(jīng)瘤、肢端雀斑樣痣性黑素瘤、頂端螺旋瘤、急性嗜酸性粒細(xì)胞白血病、急性紅白血病、急性淋巴母細(xì)胞性白血病、急性巨核母細(xì)胞性白血病、急性單核細(xì)胞性白血病、急性早幼粒細(xì)胞性白血病、腺癌、腺樣囊性癌、腺瘤、腺瘤樣牙源性腫瘤、腺鱗癌、脂肪組織腫瘤、腎上腺皮質(zhì)癌、成人T細(xì)胞白血病/淋巴瘤、侵襲性NK細(xì)胞白血病、AIDS相關(guān)淋巴瘤、腺泡型橫紋肌肉瘤、腺泡狀軟組織肉瘤、成釉細(xì)胞纖維瘤、間變性大細(xì)胞淋巴瘤、甲狀腺未分化癌、血管免疫母細(xì)胞T細(xì)胞淋巴瘤、血管平滑肌脂肪瘤、血管肉瘤、星形細(xì)胞瘤、非典型畸胎橫紋肌樣瘤、B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病、B細(xì)胞幼淋巴細(xì)胞白血病、B細(xì)胞淋巴瘤、基底細(xì)胞癌、膽道癌、膀胱癌、母細(xì)胞瘤、骨癌、布倫納瘤、布朗瘤、伯基特淋巴瘤、乳腺癌、腦癌、癌、原位癌、癌肉瘤、軟骨瘤、牙骨質(zhì)瘤、髓樣肉瘤、軟骨瘤、脊索瘤、絨毛膜癌、脈絡(luò)叢乳頭狀瘤、腎的透明細(xì)胞肉瘤、顱咽管瘤、皮膚T細(xì)胞淋巴瘤、宮頸癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、Degos病、結(jié)締組織增生性小圓細(xì)胞腫瘤、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤、胚胎發(fā)育不良性神經(jīng)上皮瘤、無(wú)性細(xì)胞瘤、胚胎性癌、內(nèi)分泌腺腫瘤、內(nèi)胚竇瘤、腸病相關(guān)性T細(xì)胞淋巴瘤、食管癌、尤因氏肉瘤、胎中胎、纖維瘤、纖維肉瘤、濾泡性淋巴瘤、濾泡甲狀腺癌、神經(jīng)節(jié)瘤、胃腸癌、生殖細(xì)胞瘤、妊娠性絨毛膜癌、巨細(xì)胞成纖維細(xì)胞瘤、巨細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦膠質(zhì)瘤、胰高血糖素瘤、性腺母細(xì)胞瘤、顆粒細(xì)胞瘤、兩性胚細(xì)胞瘤、膽囊癌、胃癌、多毛細(xì)胞白血病、血管母細(xì)胞瘤、頭頸癌、血管外皮細(xì)胞瘤、血液學(xué)惡性腫瘤、肝母細(xì)胞瘤、肝脾T細(xì)胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、浸潤(rùn)性小葉癌、腸癌、腎癌、喉癌、惡性雀斑樣痣、致死中線癌、白血病、睪丸間質(zhì)細(xì)胞瘤、脂肪肉瘤、肺癌、淋巴管瘤、淋巴管肉瘤、淋巴上皮瘤、淋巴瘤、急性淋巴細(xì)胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、肝癌、小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌、MALT淋巴瘤、惡性纖維組織細(xì)胞瘤、惡性周邊神經(jīng)鞘瘤、惡性蠑螈瘤、套細(xì)胞淋巴瘤、邊緣區(qū)B細(xì)胞淋巴瘤、肥大細(xì)胞白血病、縱隔生殖細(xì)胞瘤、乳腺髓樣癌、甲狀腺髓樣癌、髓母細(xì)胞瘤、黑素瘤、腦膜瘤、merkel細(xì)胞癌、間皮瘤、轉(zhuǎn)移性尿路上皮癌、苗勒氏混合瘤、粘液瘤、多發(fā)性骨髓瘤、肌肉組織贅生物、蕈樣肉芽腫、粘液樣脂肪肉瘤、粘液瘤、粘液肉瘤、鼻咽癌、神經(jīng)鞘瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、神經(jīng)纖維瘤、神經(jīng)瘤、結(jié)節(jié)性黑色素瘤、眼癌、寡星狀細(xì)胞瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、嗜酸細(xì)胞瘤、視神經(jīng)鞘腦膜瘤、視神經(jīng)瘤、口腔癌、骨肉瘤、卵巢癌、潘科斯特瘤、乳頭狀甲狀腺癌、副神經(jīng)節(jié)瘤、松果體母細(xì)胞瘤、松果體細(xì)胞瘤、垂體細(xì)胞瘤、垂體腺瘤、垂體瘤、漿細(xì)胞瘤、多胚瘤、前體T淋巴母細(xì)胞淋巴瘤、原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、原發(fā)性滲出性淋巴瘤、原發(fā)性腹膜癌、前列腺癌、胰腺癌、咽癌、腹膜假性粘液瘤、腎細(xì)胞癌、腎髓樣癌、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、橫紋肌瘤、橫紋肌肉瘤、Richter轉(zhuǎn)化、直腸癌、肉瘤、施旺細(xì)胞瘤病(Schwannomatosis)、精原細(xì)胞瘤、睪丸支持細(xì)胞瘤、性索-性腺間質(zhì)瘤、印戒細(xì)胞癌、皮膚癌、小藍(lán)圓細(xì)胞腫瘤、小細(xì)胞癌、軟組織肉瘤、生長(zhǎng)抑素瘤、煤煙疣、脊髓腫瘤、脾邊緣區(qū)淋巴瘤、鱗狀細(xì)胞癌、滑膜肉瘤、Sezary病、小腸癌、鱗狀癌、胃癌、T細(xì)胞淋巴瘤、睪丸癌、卵泡膜細(xì)胞瘤、甲狀腺癌、移行細(xì)胞癌、喉癌、臍尿管癌、泌尿生殖器癌、尿路上皮癌、眼色素層黑素瘤、子宮癌、疣狀癌、視覺(jué)通路膠質(zhì)瘤、外陰癌、陰道癌、Waldenstrom巨球蛋白血癥、Warthin瘤和腎母細(xì)胞瘤。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了在受試者中刺激初次T細(xì)胞應(yīng)答和二次T細(xì)胞應(yīng)答的方法，所述方法包括施用包含重組抗體的組合物，所述重組抗體包含第一抗原結(jié)合部分和第二抗原結(jié)合部分，其中所述第一抗原結(jié)合部分特異性結(jié)合于第一腫瘤抗原并且所述第二抗原結(jié)合部分特異性結(jié)合于免疫效應(yīng)細(xì)胞表面抗原，其中所述初級(jí)T細(xì)胞應(yīng)答包括刺激針對(duì)所述第一腫瘤抗原的細(xì)胞毒性T細(xì)胞，并且其中所述二次T細(xì)胞應(yīng)答包括刺激針對(duì)所述第一腫瘤抗原和/或針對(duì)第二腫瘤抗原的效應(yīng)T細(xì)胞和/或記憶T細(xì)胞。在一個(gè)方面，所述第一腫瘤抗原為WT1-HLA并且所述第二腫瘤抗原為非WT1/RMF腫瘤抗原。非-WT1/RMF腫瘤抗原的實(shí)例包括，但不限于，HER2-neu、間皮素、Tert、Muc 16、Muc1、PSMA和本領(lǐng)域中已知的其他抗原(Cheever等Clinical cancer research:an official journal of the American Association for Cancer Research.2009；15(17):5323-37)。在一個(gè)方面，所述初次T細(xì)胞應(yīng)答和/或所述二次T細(xì)胞應(yīng)答包括腫瘤部位(例如，骨髓、肺、肝、腦、泌尿生殖道、胃腸道和/或脾)上的T細(xì)胞的增加。

在一個(gè)方面，所述二次T細(xì)胞應(yīng)答包括刺激針對(duì)所述第一腫瘤抗原和第二腫瘤抗原的效應(yīng)T細(xì)胞和/或記憶T細(xì)胞。在另一個(gè)方面，所述二次T細(xì)胞應(yīng)答包括刺激針對(duì)所述第二腫瘤抗原但不針對(duì)所述第一腫瘤抗原的效應(yīng)T細(xì)胞。在一個(gè)方面，所述二次T細(xì)胞應(yīng)答不需要抗原呈遞細(xì)胞(即，交叉呈遞)或共刺激分子諸如CD86或可誘導(dǎo)的共刺激分子配體(ICOSL)。在另一個(gè)方面，所述二次T細(xì)胞應(yīng)答包括CD8T細(xì)胞的增加。在相關(guān)方面，所述二次T細(xì)胞應(yīng)答是長(zhǎng)壽命的，例如持續(xù)超過(guò)1周，超過(guò)2周，超過(guò)3周，超過(guò)1個(gè)月或超過(guò)2個(gè)月。在一個(gè)方面，所述二次T細(xì)胞應(yīng)答包含先前無(wú)反應(yīng)性的T細(xì)胞。

在一個(gè)方面，根據(jù)本公開(kāi)的刺激初次T細(xì)胞應(yīng)答和二次T細(xì)胞應(yīng)答的方法包括施用包含本文中所述的重組雙特異性抗體，例如，包含SEQ ID NO:110中所示的氨基酸序列的重組雙特異性抗體的組合物。在另一個(gè)方面，所述方法包括施用雙特異性抗體，所述雙特異性抗體包含特異性結(jié)合于WT1/HLA的第一抗原結(jié)合部分，并且所述二次T細(xì)胞應(yīng)答包括先前利用非-WT1-RMF抗原活化的T細(xì)胞。

在一個(gè)方面，所述初次T細(xì)胞應(yīng)答和/或二次T細(xì)胞應(yīng)答在體內(nèi)發(fā)生。例如，可以以有效地刺激針對(duì)WT1/HLA的初次T細(xì)胞應(yīng)答和針對(duì)非WT1-RMF腫瘤抗原的二次T細(xì)胞應(yīng)答的量向有些需要的患者施用本文所述的雙特異性抗體。在另一個(gè)方面，所述初次T細(xì)胞應(yīng)答和/或二次T細(xì)胞應(yīng)答可離體發(fā)生。例如，可在體外向細(xì)胞施用根據(jù)本公開(kāi)的雙特異性抗體以活化和擴(kuò)增具有對(duì)于腫瘤抗原例如非-WT1-RMF腫瘤抗原的特異性的T細(xì)胞的群體。隨后可自體地向有此需要的受試者例如施用治療有效量的T細(xì)胞以治療癌癥。

不希望受理論束縛，所述初次T細(xì)胞和/或二次T細(xì)胞應(yīng)答可由雙特異性抗體將T細(xì)胞的TCR帶至與腫瘤細(xì)胞足夠接近以直接識(shí)別所述腫瘤上的另外的MHC/肽表位的能力而引起。在一個(gè)方面，在T細(xì)胞刺激期過(guò)程中所述雙特異性抗體的第一抗原結(jié)合部分對(duì)第一腫瘤抗原例如WT1/HLA的結(jié)合可阻斷所述T細(xì)胞的同源TCR對(duì)第一腫瘤抗原的識(shí)別，從而導(dǎo)致對(duì)于除所述第一腫瘤抗原外的腫瘤抗原是特異的二次T細(xì)胞應(yīng)答。

本公開(kāi)從而提供了產(chǎn)生針對(duì)腫瘤抗原的效應(yīng)T細(xì)胞和/或記憶T細(xì)胞的方法，所述方法包括利用本文所述的重組抗體活化T細(xì)胞。在一個(gè)方面，活化后產(chǎn)生的所述T細(xì)胞可存活延長(zhǎng)的一段時(shí)間，例如，至少一周、至少兩周、至少三周、至少一個(gè)月或至少二個(gè)月。在一個(gè)方面，所述重組抗體包含結(jié)合于WT1/HLA的第一抗原結(jié)合部分，但所產(chǎn)生的效應(yīng)T細(xì)胞和/或記憶T細(xì)胞是針對(duì)非-WT1-RMF腫瘤抗原例如HER2-neu、間皮素、Tert、Muc 16、Muc1、PSMA和本領(lǐng)域中已知的其他抗原的。在一個(gè)方面，體內(nèi)產(chǎn)生效應(yīng)T細(xì)胞和/或記憶T細(xì)胞。在另一個(gè)方面，離體產(chǎn)生效應(yīng)T細(xì)胞和/或記憶T細(xì)胞，例如，以用于過(guò)繼T細(xì)胞療法。在一個(gè)方面，施用雙特異性抗體增加CD8 T細(xì)胞的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致長(zhǎng)壽命的效應(yīng)物記憶。具有對(duì)于WT1/HLA是特異的第一結(jié)合部分的根據(jù)本公開(kāi)的雙特異性抗體從而能夠誘導(dǎo)針對(duì)非-WT1腫瘤抗原的疫苗反應(yīng)，從而導(dǎo)致廣泛有效的抗-腫瘤療法。

本公開(kāi)的治療方法包括緩解或預(yù)防病癥的至少一個(gè)癥狀或其他方面，或減輕疾病的嚴(yán)重度等。在一個(gè)方面，本發(fā)明的重組雙特異性抗體或藥物組合物的治療有效量是有效地抑制WT1陽(yáng)性細(xì)胞的生長(zhǎng)、減小腫瘤尺寸/負(fù)荷、阻止腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移/浸潤(rùn)和/或?qū)е录?xì)胞死亡(例如，通過(guò)細(xì)胞凋亡或壞死)的量。在另一個(gè)方面，包括預(yù)防性施用雙特異性抗體例如以誘導(dǎo)二次T細(xì)胞應(yīng)答和產(chǎn)生記憶T細(xì)胞的方法，有效地預(yù)防疾病的發(fā)作或復(fù)發(fā)或減輕疾病的嚴(yán)重程度。本文所述的雙特異性抗體或藥物組合物無(wú)需實(shí)現(xiàn)完全治愈，或消除疾病的每一個(gè)癥狀或表現(xiàn)來(lái)構(gòu)成可行的治療劑。如本領(lǐng)域中所公認(rèn)的，治療劑可減輕給定疾病狀態(tài)的嚴(yán)重程度，但無(wú)需消除疾病的每一個(gè)表現(xiàn)以被認(rèn)為是有用的。類似地，預(yù)防性施用的治療在預(yù)防病癥的發(fā)作中無(wú)需完全有效以構(gòu)成可行的預(yù)防試劑。簡(jiǎn)單地減小疾病的影響(例如，通過(guò)減少其癥狀的數(shù)目或嚴(yán)重度，或通過(guò)增加另一種治療的功效，或通過(guò)產(chǎn)生另一種有益作用)，或減小疾病將在受試者中發(fā)生或惡化的可能性就足夠了。

用于本公開(kāi)的方法的施用的劑量和頻率可根據(jù)此類因素如施用途徑、所使用的特定雙特異性抗體、待治療的疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度(無(wú)論病況是是急性還是慢性的)以及受試者的大小和一般狀況而變化?？稍诶缈砂▌┝窟f增研究的臨床試驗(yàn)中通過(guò)相關(guān)領(lǐng)域中已知的方法來(lái)確定合適的劑量。

可以例如在一段時(shí)間內(nèi)以規(guī)律的間隔施用本公開(kāi)的抗體例如一次或不止一次。一般地，向受試者施用抗體或藥物組合物，直至受試者表現(xiàn)針對(duì)所選擇的指標(biāo)的高于基線的醫(yī)學(xué)相關(guān)程度的改善。

一般地，以劑量存在的本文所述的重組雙特異性抗體，或以劑量存在的由編碼多核苷酸原位產(chǎn)生的重組雙特異性抗體的量在約10μg/kg至約20mg/kg的宿主的范圍內(nèi)。足以提供有效療法的最小劑量的使用通常是優(yōu)選的。通常可使用適合于待治療或預(yù)防的病況的測(cè)定來(lái)監(jiān)測(cè)患者的治療性或預(yù)防性功效；測(cè)定對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是熟悉的并且在本文中描述了一些測(cè)定。

本文中公開(kāi)的方法可包括本文所述的雙特異性抗體的口服給藥或通過(guò)液體藥物組合物的注射進(jìn)行的遞送。當(dāng)以液體形式施用時(shí)，合適的劑量大小將隨受試者的大小而變化，但對(duì)于10kg至60kg的受試者，通常會(huì)在約1ml至約500ml(包含約0.01μg至約1000μg/kg)的范圍內(nèi)。通?？墒褂脤?shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃?或臨床試驗(yàn)來(lái)確定最佳劑量。最佳劑量可取決于受試者的身體質(zhì)量、身體面積、體重或血液體積。如本文中所述，合適的劑量也可取決于患者的病況，即疾病的分期、一般健康狀況、年齡、性別、體重和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的技術(shù)人員于熟悉的其他因素。

在本文所述的方法的特定實(shí)施方案中，所述受試者為人或非人動(dòng)物。需要本文所述的治療的受試者可表現(xiàn)出本文所述的疾病、病癥或病況的癥狀或后遺癥，或可處于發(fā)生所述疾病、病癥或病況的風(fēng)險(xiǎn)中。可被治療的非人動(dòng)物包括哺乳動(dòng)物，例如，非人類靈長(zhǎng)類(例如，猴、黑猩猩、大猩猩)、嚙齒動(dòng)物(例如，大鼠、小鼠、沙鼠、倉(cāng)鼠、雪貂、兔)、兔類動(dòng)物、豬(例如，豬、小型豬)、馬、犬、貓、牛及其他家庭農(nóng)場(chǎng)和動(dòng)物園動(dòng)物。

通過(guò)參考以下實(shí)施例將更容易地理解本公開(kāi)，所述實(shí)施例以舉例說(shuō)明的方式提供并不旨在是限制性的。

實(shí)施例

材料和方法

細(xì)胞樣品、細(xì)胞系和抗體。通過(guò)Ficoll密度離心獲得來(lái)自HLA分型的健康供者和患者的外周血單核細(xì)胞(PBMC)。先前已描述了用于獲得人白血病和實(shí)體瘤細(xì)胞系的來(lái)源(Dao等，同上)。用于該研究的細(xì)胞系包括：AML品系HL60、SET-2、Ph+ALL品系BV173、間皮瘤細(xì)胞系JMN和MSTO。已對(duì)所有細(xì)胞進(jìn)行了HLA分型。在37C/5％CO₂下將所述細(xì)胞系培養(yǎng)在補(bǔ)充有5％FCS、青霉素、鏈霉素、2mmol/L谷氨酰胺和2-巰基乙醇的RPMI 1640中。如先前所述(Dao等，同上)，利用GFP/熒光素酶轉(zhuǎn)導(dǎo)用于動(dòng)物研究的腫瘤細(xì)胞。ESK1及其對(duì)照人IgG1由Eureka Therapeutics Inc(Emeryville,CA)生產(chǎn)，并且按照制造商(Dao等，同上)的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行APC綴合。綴合于FITC或APC的針對(duì)人HLA-A2的單克隆抗體(mAb)(克隆BB7.2)及其同種型對(duì)照小鼠IgG2b/FITC或APC購(gòu)自BD Biosciences(San Diego,CA)。綴合于FITC或PE的小鼠抗-His標(biāo)簽mAb和用于人IFN-γ的ELISA試劑盒購(gòu)自Invitrogen,(NY)。海腎熒光素酶底物ViviRen^TM購(gòu)自Promega(Madison,WI)。

肽。所有肽購(gòu)自Genemed Synthesis,Inc.(San Antonio,TX)并由其合成。HER2-neu-369-377的氨基酸序列：KIFGSLAFL(SEQ ID NO:138)；p53 264-272：LFEVRVCAC(SEQ ID NO:139)；WT1：RMFPNAPYL(SEQ ID NO:1)；Prame-300：ALYVDSLFFL(SEQ ID NO:140)；p435：NLTHVLYPV(SEQ ID NO:141)。先前描述了WT1-NQM、AILDF、LDF和總的匯集的肽(Doubrovina等Blood.2012年8月23日；120(8):1633-46)。對(duì)照HLA-A2-結(jié)合肽來(lái)源于尤文氏肉瘤：QLQNPSYDK(SEQ ID NO:142)。

ESK-雙特異性抗體的構(gòu)建、表達(dá)和純化。在一個(gè)實(shí)施方案中，ESK1雙特異性抗體是在N端末端包含ESK1 scFv和在C端末端包含小鼠單克隆抗體的抗-人CD3ε scFv的單鏈雙特異性抗體(圖10)。編碼ESK1 scFv抗體和抗-人CD3ε scFv抗體的DNA片段由GeneArt(Invitrogen)合成，并使用標(biāo)準(zhǔn)DNA技術(shù)將其亞克隆入Eureka哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pGSN-Hyg。將六聚組氨酸(His)標(biāo)簽在C端末端插入ESK1雙特異性抗體的下游以用于抗體純化和檢測(cè)。

用ESK1雙特異性抗體表達(dá)載體轉(zhuǎn)染中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，并通過(guò)利用甲硫氨酸亞礬胺(MSX)的標(biāo)準(zhǔn)藥物選擇(一種基于谷氨酰胺合成酶(GS)的方法(Fan,等Biotechnology Bioengineering.109(4),1007-1005(2012)))實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的表達(dá)。收集含有分泌的ESK1-雙特異性抗體分子的CHO細(xì)胞上清液。使用HisTrap HP柱(GE healthcare)，利用FPLC AKTA系統(tǒng)純化ESK1雙特異性抗體。簡(jiǎn)言之，澄清CHO細(xì)胞培養(yǎng)物，將其加載至具有低咪唑濃度(20mM)的柱子上，隨后將等梯度高咪唑濃度洗脫緩沖液(500mM)用于洗脫結(jié)合的ESK1雙特異性抗體蛋白。由替代ESK1scFv的不相關(guān)人IgG1抗體(Cat#ET901,Eureka Therapeutics)構(gòu)建陰性對(duì)照雙特異性抗體。

流式細(xì)胞術(shù)分析。對(duì)于ESK-雙特異性抗體染色，將人T細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞或細(xì)胞系與不同濃度的ESK-雙特異性抗體或?qū)φ针p特異性抗體一起在冰上孵育30分鐘，洗滌，隨后與針對(duì)His-標(biāo)簽的第二mAb一起孵育。通過(guò)用曲妥珠單抗，隨后用第二山羊抗-人IgG對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行染色來(lái)測(cè)量原發(fā)性卵巢癌細(xì)胞上的HER2-neu表達(dá)。通過(guò)用各自的mAb對(duì)細(xì)胞進(jìn)行直接染色來(lái)測(cè)量HLA-A2表達(dá)和ESK結(jié)合。通過(guò)用綴合于各種熒光團(tuán)的CD3、CD4、CD8、CD45RA、CD45RO、CCR7、CD19或CD33的mAb對(duì)細(xì)胞進(jìn)行直接染色來(lái)表征來(lái)自患者樣品的PBMC或T細(xì)胞的表型。在FACS Calibur(Becton Dickinson)上收集流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)，利用FlowJo V8.7.1和9.4.8軟件分析所述數(shù)據(jù)。

進(jìn)行結(jié)合研究以檢查結(jié)合Jurkat(CD3⁺人癌細(xì)胞系)細(xì)胞的ESK1+L2K雙特異性抗體。簡(jiǎn)言之，將始于10μg/mL的3x系列稀釋的雙特異性抗體添加至0.5×10⁶個(gè)Jurkat細(xì)胞。利用100x稀釋的綴合有FITC的抗-His標(biāo)簽抗體(Thermo#MA1-81891)或1000x稀釋的具有或不具有別藻藍(lán)蛋白(APC)-抗小鼠IgG(Biolegend#Poly4053)的小鼠抗-His標(biāo)簽抗體孵育細(xì)胞，和在Guava EasyCyte 6HT(EMD Millipore)上通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析所述細(xì)胞。結(jié)果示于圖8中。

隨后，使用10μg/mL的ESK1+L2K、ET901+L2K和ET901+OKT3抗體，檢查利用FITC抗-His對(duì)Jurkat細(xì)胞的染色。將FITC ET901和APC ET901(ET901為完全人IgG1)用作對(duì)照。結(jié)果示于圖9中。

通過(guò)ForteBio Octe分析測(cè)定ESK1與ESK1-雙特異性抗體對(duì)MHC1/WT1肽復(fù)合物的結(jié)合的比較。結(jié)果示于下表中。

表10

全長(zhǎng)ESK1-雙特異性抗體：在一個(gè)實(shí)施方案中，所述ESK-1雙特異性抗體為全長(zhǎng)抗體。簡(jiǎn)言之，以等摩爾比率組合ESK1或ET901(陰性對(duì)照)和抗-CD3(OKT3)，從而產(chǎn)生0.5ml內(nèi)的每一種抗體的0.8mg/ml的終濃度。將12.5μl的1M 2-巰基乙胺(2-MEA)添加至反應(yīng)混合物，將溶液在37℃孵育90分鐘。利用Zeba脫鹽柱(100-200μl,7-kDA,Pierce.)除去2-MEA。將溶液于4℃下貯存過(guò)夜，以允許二硫鍵的再氧化。產(chǎn)量值示于表11中。

表11

使用ForteBio Octet QK測(cè)定結(jié)合親和力。將5μg/ml生物素化的MHC-WT1加載至鏈霉抗生物素蛋白生物傳感器上。在洗掉過(guò)量抗原后，分別以20μg/ml、10μg/ml和10μg/ml測(cè)試ESK-1-OKT3、ESK1和OKT3溶液的締合和解離常數(shù)。使用1:1結(jié)合位點(diǎn)模型計(jì)算結(jié)合參數(shù)并將其示于表12中。

表12

ESK-雙特異性抗體介導(dǎo)的T細(xì)胞活化。使用過(guò)全T細(xì)胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec Inc.,San Diego,CA)通過(guò)陰性免疫磁性細(xì)胞分離來(lái)將CD3T細(xì)胞從PBMC分離。將不同濃度的ESK-雙特異性抗體或其對(duì)照雙特異性抗體與靶細(xì)胞和純化的CD3T細(xì)胞以不同的效應(yīng)子:靶(E:T)比率一起孵育過(guò)夜或不同的時(shí)期。收獲上清液流體，通過(guò)ELISA測(cè)量IFN-γ和TNF-α的細(xì)胞因子釋放。另外，通過(guò)細(xì)胞增殖評(píng)估在來(lái)自卵巢癌患者的自體腫瘤細(xì)胞存在的情況下ESK-雙特異性抗體介導(dǎo)的T細(xì)胞活化，通過(guò)在7天的共孵育后過(guò)夜3H-胸苷摻入測(cè)量所述ESK-雙特異性抗體介導(dǎo)的T細(xì)胞活化。

EBV-特異性T細(xì)胞擴(kuò)增和受體基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。通過(guò)經(jīng)由粘附耗竭單核細(xì)胞來(lái)從PBMC富集T細(xì)胞。以20:1的響應(yīng)者:刺激物(R:S)比率用通過(guò)利用EBV的B95.8株的轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的轉(zhuǎn)輻照的自體EBV-轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞(EBV-BLCL)刺激非粘附細(xì)胞，并將所述細(xì)胞在含有5％HS(YH5；Gemini)的Yssel培養(yǎng)基中培養(yǎng)。第7天開(kāi)始，每2-3天(Collaborative Biomedical Products,Bedford,MA)以10至30個(gè)單位/mL將白細(xì)胞介素-2(IL-2)添加至T細(xì)胞培養(yǎng)物中，每周以4:1R:S比率利用相同的EBV-BLCL再刺激所述培養(yǎng)物。

如先前所述(Doubrovina,E.等Blood 119(11),2644-2655(2012))，用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體tdrrsRLuc轉(zhuǎn)導(dǎo)EBV特異性T淋巴細(xì)胞，擴(kuò)增所述細(xì)胞，通過(guò)分選富集其PE。將經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的EBV特異性T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)在G-rex培養(yǎng)瓶(Wilson Wolf Manufacturing Corporation)中。對(duì)于體內(nèi)T細(xì)胞跟蹤研究，將1000萬(wàn)個(gè)細(xì)胞注射入小鼠，4小時(shí)后，靜脈內(nèi)給予海腎熒光素酶底物ViviRen^TM。

ESK-雙特異性抗體重定向的T細(xì)胞的細(xì)胞毒性。將不同濃度的ESK-雙特異性抗體或其對(duì)照雙特異性抗體與靶細(xì)胞和PBMC、純化的CD3T細(xì)胞或EBV-特異性T細(xì)胞以不同的效應(yīng)子:靶(E:T)比率一起孵育5小時(shí)或過(guò)夜。使用來(lái)自Promega的Cytotox 96非放射性試劑盒按照它們的說(shuō)明書(shū)，通過(guò)⁵¹Cr-釋放測(cè)定(在5小時(shí)的孵育后)或LDH釋放測(cè)定(在過(guò)夜孵育后)測(cè)量細(xì)胞毒性。在AML患者的情況下，在20μg/ml的ESK或?qū)φ?雙特異性抗體純?cè)诨虿淮嬖诘那闆r下共孵育PBMC和自體母細(xì)胞，在第3天和第4天收獲所述細(xì)胞，并利用CD33(針對(duì)白血病母細(xì)胞)和CD3(針對(duì)T細(xì)胞)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行雙重染色。對(duì)于卵巢癌患者的情況，將PBMC與自體卵巢癌細(xì)胞一起孵育一周，通過(guò)⁵¹Cr-釋放測(cè)定測(cè)量細(xì)胞毒性。

藥代動(dòng)力學(xué)和生物分布研究。使用氯胺T法利用¹²⁵I(PerkinElmer)標(biāo)記ESK-雙特異性抗體或?qū)φ针p特異性抗體。將一百(100)μg抗體與1mCi ¹²⁵I和20μg氯胺T反應(yīng)，利用200μg焦亞硫酸鈉猝來(lái)，隨后使用利用2％的PBS中的牛血清白蛋白平衡的10DG柱將其與游離¹²⁵I分離。產(chǎn)物的比活性為6mCi/mg。利用未標(biāo)記的雙特異性抗體將放射性標(biāo)記的雙特異性抗體(2μg)稀釋至20μg/劑量，將其眶后注射入小鼠。在不同的時(shí)間點(diǎn)收集血液，稱重，在γ計(jì)數(shù)器上進(jìn)行測(cè)量。在24小時(shí)后，收獲器官，稱重，并在γ計(jì)數(shù)器上測(cè)量其活性。

人腫瘤異種移植物NSG模型中進(jìn)行的ESK-雙特異性抗體的治療性試驗(yàn)。將人EBV-特異性T細(xì)胞用于所有異種移植物模型，因?yàn)樗鼈兊目乖禺愋砸褔?yán)重偏向EBV Ag，其中它們不應(yīng)當(dāng)誘導(dǎo)GVHD。對(duì)于BV173ALL模型，將200萬(wàn)個(gè)BV173人白血病細(xì)胞靜脈內(nèi)注射入NSG小鼠。在第5天，通過(guò)在待被處理的所有小鼠中進(jìn)行螢火蟲(chóng)成像來(lái)確認(rèn)腫瘤移植物植入；隨后將小鼠隨機(jī)分入不同治療組。在第6天，將1000萬(wàn)個(gè)EBV-特異性T細(xì)胞靜脈內(nèi)注射入小鼠。4至6小時(shí)后，靜脈內(nèi)注射20μg ESK-雙特異性抗體或其對(duì)照雙特異性抗體，每周重復(fù)2次注射，在3周的處理中進(jìn)行總共6次，同時(shí)每周一次靜脈內(nèi)注射T細(xì)胞，進(jìn)行2次。對(duì)于SET-2AML模型，將100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞靜脈內(nèi)注射入小鼠，在第3天通過(guò)生物發(fā)光成像確認(rèn)腫瘤移植物植入，將小鼠隨機(jī)分入治療組。在第4天，靜脈內(nèi)注射1000萬(wàn)個(gè)EBV-特異性T細(xì)胞靜，6小時(shí)后，靜脈內(nèi)注射20μg ESK-雙特異性抗體或其對(duì)照雙特異性抗體。在處理過(guò)程中，每周2次給予T細(xì)胞，并且每隔一天給予雙特異性抗體，持續(xù)總共6天。在原發(fā)性ALL模型中，將500萬(wàn)個(gè)ALL細(xì)胞靜脈內(nèi)注射入NSG小鼠。在第6天，在待處理的所有小鼠中通過(guò)螢火蟲(chóng)熒光素酶成像確認(rèn)腫瘤移植物植入；隨后將小鼠隨機(jī)分入不同治療組。將3000萬(wàn)個(gè)EBV-特異性T細(xì)胞靜脈內(nèi)注射入小鼠，隨后靜脈內(nèi)注射20μg ESK雙特異性抗體或其對(duì)照雙特異性抗體。每天給予雙特異性抗體注射一次，每周給予T細(xì)胞兩次，持續(xù)總共2周。對(duì)于JMN間皮瘤模型，將30萬(wàn)個(gè)腫瘤細(xì)胞與60萬(wàn)個(gè)EBV-特異性T細(xì)胞混合，并進(jìn)行腹膜內(nèi)(i.p.)注射，1小時(shí)后，將20μg ESK-雙特異性抗體或?qū)φ针p特異性抗體靜脈內(nèi)注射入小鼠。每隔一天給予雙特異性抗體，持續(xù)總共5天。對(duì)于所有動(dòng)物模型，通過(guò)每周至少2次螢火蟲(chóng)熒光素酶成像監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)。

ESK-雙特異性抗體誘導(dǎo)的二次T細(xì)胞應(yīng)答。在人IL-5(5ng/ml)和人IL-2(10μg/ml)存在的情況下，在0.1μg/ml的ESK-雙特異性抗體或?qū)φ?雙特異性抗體存在或不存在的情況下，以4-5:1的E:T比率將用來(lái)自卵巢癌患者的PBMC、耗竭了NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的PBMC或純化的CD3T細(xì)胞與經(jīng)輻照的(3000拉德)自體卵巢癌細(xì)胞一起培養(yǎng)在補(bǔ)充有10％自體血漿(AP)的RPMI1640培養(yǎng)基中，持續(xù)6天。在第7天，收獲細(xì)胞，洗滌細(xì)胞，并將其用作用于IFN-g ELISPOT測(cè)定的效應(yīng)物。簡(jiǎn)言這家，用100μL的PBS中的小鼠抗-人IFN-g抗體(10Ag/mL；克隆1-D1K；Mabtech)涂覆HA-Multiscreen板(Millipore)，在4℃孵育過(guò)夜，用PBS洗滌以除去未結(jié)合的抗體，以及用RPMI1640/10％自體血漿(AP)在37℃封閉2小時(shí)。將效應(yīng)細(xì)胞與T2細(xì)胞(4:1的E:APC比率)或經(jīng)輻照的自體腫瘤細(xì)胞或其他腫瘤細(xì)胞系一起涂板。將各種測(cè)試肽以20μg/mL添加至孔中。陰性對(duì)照孔含有APC和T細(xì)胞但不具肽或具有不相關(guān)肽。陽(yáng)性對(duì)照孔含有T細(xì)胞加上APC加上20μg/mL植物凝集素(PHA,Sigma)。以一式三份進(jìn)行所有條件。將微量滴定板在37℃孵育20小時(shí)，隨后用PBS/0.05％Tween充分洗滌，并添加100μl/孔的針對(duì)人IFN-g的生物素化的檢測(cè)抗體(2μg/mL；克隆7-B6-1；Mabtech)。將板在37℃再孵育另外2小時(shí)，并如所述的(May等Clinical cancer research:an official journal of the American Association for Cancer Research.2007；13(15Pt 1):4547-55.)進(jìn)行斑點(diǎn)顯影。通過(guò)使用計(jì)算機(jī)輔助視頻影像分析儀，利用KS ELISPOT 4.0軟件(Carl Zeiss Vision)自動(dòng)地測(cè)定斑點(diǎn)數(shù)目。

通過(guò)每周一次添加具有IL-15和IL-2的新鮮培養(yǎng)基擴(kuò)增剩余T細(xì)胞，達(dá)到7至8周。在一些情況下，在與對(duì)于第一刺激相同的條件下，以9:1的效應(yīng)子:靶比率利用自體腫瘤再刺激剩余的T細(xì)胞，進(jìn)行1周，隨后如所描述的，通過(guò)IFN-g ELISPOT測(cè)量T細(xì)胞應(yīng)答。

結(jié)果

對(duì)WT1+HLA-A0201+腫瘤細(xì)胞和T細(xì)胞的選擇性結(jié)合。全長(zhǎng)ESK1mAb以受WT1和HLA-A0201限制的方式結(jié)合于一小組白血病細(xì)胞系和間皮瘤細(xì)胞系(Dao等，同上)。測(cè)試ESK-雙特異性抗體、scFv構(gòu)建體的結(jié)合特異性。ForteBio(Menlo Park,CA)結(jié)合測(cè)定顯示355nM的ESK-雙特異性抗體的Kd。ESK-雙特異性抗體以劑量依賴性方式甚至在0.1μg/ml的濃度下結(jié)合于SET-2(一種WT1和HLA-A0201雙陽(yáng)性AML細(xì)胞系)，但不結(jié)合于HL-60(一種WT1陽(yáng)性，但HLA-A0201陰性的AML細(xì)胞系)(圖1A，1B)。在所有測(cè)試的濃度下未看到對(duì)照雙特異性抗體對(duì)SET-2或HL-60細(xì)胞的陽(yáng)性結(jié)合，這表明了ESK-雙特異性抗體的特異性。然而兩種雙特異性抗體均能夠結(jié)合純化的人CD3T細(xì)胞(圖1C)。這些結(jié)果證明了雙特異性，因?yàn)镋SK-雙特異性抗體能夠選擇性識(shí)別表達(dá)WT1和HLA-A0201的腫瘤細(xì)胞以及還有人CD3T細(xì)胞。

T細(xì)胞活化以及針對(duì)WT1和HLA-A0201陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性。已顯示雙特異性抗體構(gòu)建體對(duì)T細(xì)胞的活化依賴于T細(xì)胞與表達(dá)靶抗原的靶細(xì)胞之間的鄰面接觸。這對(duì)于避免不希望的由T細(xì)胞活化引起的炎癥應(yīng)答是至關(guān)重要的，因?yàn)殡p特異性抗體構(gòu)建體的一個(gè)臂識(shí)別無(wú)變化的CD3信號(hào)復(fù)合物。在ESK-雙特異性抗體和靶SET-2細(xì)胞存在的情況下，在ESK-雙特異性抗體的指定濃度下觀察到劑量依賴性IFN-γ釋放(圖1D)。單獨(dú)的或在SET-2細(xì)胞存在的情況下與對(duì)照-雙特異性抗體一起孵育的CD3T細(xì)胞顯示不可檢測(cè)水平的IFN-γ，并從ESK-雙特異性抗體組的值扣除它們的值。

評(píng)估ESK-雙特異性抗體定向的針對(duì)共表達(dá)WT1和HLA-A0201的靶細(xì)胞的T細(xì)胞的細(xì)胞毒性的潛能。將純化的靜止T細(xì)胞與靶細(xì)胞和系列稀釋的ESK雙特異性抗體或?qū)φ针p特異性抗體共孵育5小時(shí)，并通過(guò)⁵¹Cr-釋放測(cè)量細(xì)胞裂解。ESK-雙特異性抗體劑量依賴性誘導(dǎo)針對(duì)AML細(xì)胞系SET-2但非HL-60的T細(xì)胞的細(xì)胞毒性，這與圖1中顯示的它們的結(jié)合特異性相符(圖2A、2B)。當(dāng)將共孵育時(shí)間延長(zhǎng)至16小時(shí)，靶細(xì)胞裂解在3μg/ml和0.3μg/ml的ESK-雙特異性抗體上分別增加至高達(dá)90％和80％。類似地，在ESK-雙特異性抗體存在的情況下，BV173和原發(fā)性CML母細(xì)胞(WT1+/HLA-A0201+)在6小時(shí)的共孵育中也以劑量依賴性的方式被PBMC裂解(圖2C，2D)，并且BV173的殺傷在0.01μg/ml的ESK-雙特異性抗體上很明顯。相對(duì)較弱的針對(duì)CML母細(xì)胞的殺傷可能歸因于該樣品中較低水平的HLA-A2和ESK結(jié)合的表達(dá)。對(duì)照雙特異性抗體不誘導(dǎo)任何顯著的細(xì)胞毒性，這表明所述靶特異性是T細(xì)胞活化所需的。

先前已利用不同Ag諸如EBV重復(fù)引發(fā)的ESK-雙特異性抗體重定向T細(xì)胞的細(xì)胞毒性的能力得以闡明。使用此類T細(xì)胞可潛在地避免異種移植動(dòng)物模型中的移植物抗宿主病(GVHD)，因?yàn)門(mén)細(xì)胞的抗原特異性應(yīng)當(dāng)只嚴(yán)重地偏向于EBV Ag。利用5小時(shí)-51Cr釋放，使用0.1μg/ml的ESK-雙特異性抗體，通過(guò)滴定效應(yīng)子:靶(E:T)比率來(lái)測(cè)試T細(xì)胞殺傷的潛力。對(duì)于ESK-雙特異性抗體觀察到針對(duì)所有測(cè)定的靶細(xì)胞的高效劑量依賴性殺傷(圖2E、2F、2G)。對(duì)于BV173，在較高的E:T比率下存在幾近50％的殺傷，在低至1.6:1的E:T下存在約25％的殺傷(圖2E)。在3.13的E:T比率下對(duì)于JMN靶細(xì)胞觀察到特異性殺傷(圖2F)。類似地，發(fā)現(xiàn)針對(duì)原發(fā)性卵巢癌細(xì)胞的強(qiáng)細(xì)胞毒性在不同的E:T比率下在超過(guò)50％至20％殺傷的范圍內(nèi)(圖2G)。在間皮瘤細(xì)胞系JMN、ALL BV173和原發(fā)性卵巢癌細(xì)胞(均共表達(dá)WT1和HLA-A0201)中，在利用單獨(dú)的T細(xì)胞或利用針對(duì)WT1+/HLA-A0201+的對(duì)照雙特異性抗體的培養(yǎng)物中不存在殺傷。這些結(jié)果表明ESK-雙特異性抗體可特異性將先前活化的具有除針對(duì)WT1外的特異性的T細(xì)胞的強(qiáng)效細(xì)胞毒性重定向以裂解WT1和HLA-A0201陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞。

隨后，更密切地研究T細(xì)胞在自體背景中的ESK-雙特異性抗體介導(dǎo)的活化和細(xì)胞毒性，模擬人體內(nèi)狀況。在0.1μg/ml和ESK-雙特異性抗體存在的情況下，以如所指示的各種E:T比率，利用經(jīng)輻照的自體腫瘤細(xì)胞刺激來(lái)自卵巢癌患者的PBMC，進(jìn)行7天。在第8天通過(guò)在6小時(shí)培養(yǎng)中添加⁵¹Cr-標(biāo)記的自體腫瘤來(lái)測(cè)量細(xì)胞毒性。在刺激開(kāi)始時(shí)，甚至在100個(gè)PBMC下在利用ESK-雙特異性抗體的培養(yǎng)物中觀察到劑量依賴性殺傷(圖3A)。在所有對(duì)照組中均未觀察到殺傷。平行地，在8天的培養(yǎng)結(jié)束時(shí)通過(guò)3H-胸苷摻入測(cè)量T細(xì)胞增殖(圖3B)。僅在利用ESK-雙特異性抗體的培養(yǎng)物中看到顯著的細(xì)胞增殖。PBMC和單獨(dú)的腫瘤細(xì)胞均未對(duì)ESK-或?qū)φ?雙特異性抗體作出響應(yīng)。另外，PBMC與單獨(dú)的自體腫瘤細(xì)胞或與對(duì)照雙特異性抗體的共培養(yǎng)未顯示T細(xì)胞增殖，這表明T細(xì)胞耐受自身腫瘤Ag?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明ESK-雙特異性抗體對(duì)T細(xì)胞的特異性活化需要腫瘤細(xì)胞的存在，并且ESK-雙特異性抗體可強(qiáng)制T細(xì)胞克服自身耐受性。在來(lái)自AML患者的第二自體模型中舉例說(shuō)明了ESK-雙特異性抗體誘導(dǎo)自體T細(xì)胞增殖和殺傷其靶癌細(xì)胞的能力(圖16A-16D)。

NSG小鼠中的表達(dá)WT1/HLA-A0201的人白血病的治療。測(cè)試ESK-雙特異性抗體在先前用BV173Ph+ALL細(xì)胞靜脈內(nèi)異種移植6天的NSG小鼠中的體內(nèi)治療功效。在處理時(shí)，小鼠在其肝、脾和骨髓中具有可見(jiàn)的彌漫性白血病。將T細(xì)胞靜脈內(nèi)注射入小鼠，隨后在4小時(shí)后注射雙特異性抗體。始于處理后3天并持續(xù)長(zhǎng)達(dá)3周觀察到顯著的腫瘤抑制，這在接受ESK-雙特異性抗體的小鼠的骨髓中特別明顯(圖4A)。相反地，包括接受腫瘤細(xì)胞、腫瘤和T細(xì)胞、腫瘤和ESK-雙特異性抗體，或腫瘤和T細(xì)胞及對(duì)照雙特異性抗體的小鼠的對(duì)照組中的所有小鼠均在骨髓和其他器官中顯示不斷增加的腫瘤生長(zhǎng)和巨大腫瘤負(fù)荷(圖4A)。來(lái)自5只小鼠的光子強(qiáng)度的平均值顯示ESK-雙特異性抗體-處理的組中約10倍的腫瘤減小(圖4B)。在腫瘤接種后達(dá)到49天未觀察到顯著的GVHD(圖4C)。結(jié)果證明ESK-雙特異性抗體可高效地將強(qiáng)效的T細(xì)胞的細(xì)胞毒性嚙合和定向至殺傷BV173靶細(xì)胞。

測(cè)試ESK-雙特異性抗體在先前用原發(fā)性ALL細(xì)胞靜脈內(nèi)異種移植的NSG小鼠中的體內(nèi)治療功效。將T細(xì)胞靜脈內(nèi)注射入小鼠，隨后注射ESK-雙特異性抗體。對(duì)照組中的所有小鼠在骨髓和其他器官中均顯示不斷增加的腫瘤生長(zhǎng)和巨大的腫瘤負(fù)荷。在停止處理后9天，持續(xù)超過(guò)3周觀察到顯著的雙特異性抗體選擇性腫瘤抑制，這在小鼠的骨髓中尤其明顯(圖4D)。來(lái)自5只小鼠的光子強(qiáng)度的平均值顯示在ESK-雙特異性抗體-處理的組中相較于其他對(duì)照組約10-20倍的腫瘤減小(圖4E)。在腫瘤接種后達(dá)到49天在臨床上未觀察到顯著的GVHD。

這些結(jié)果證明ESK-雙特異性抗體可高效地嚙合并重定向強(qiáng)效T細(xì)胞毒性以殺傷原發(fā)性白血病細(xì)胞。如所預(yù)期的，EBV特異性人T細(xì)胞不顯示非特異性殺傷，從而可用于闡明異種移植物模型中的雙特異性抗體活性。該模型表明ESK-雙特異性抗體的每周2次的施用是不夠的，因?yàn)槠浒胨テ趦H為數(shù)小時(shí)，并且通過(guò)藥代動(dòng)力學(xué)研究得以證實(shí)。

由于ESK-雙特異性抗體在治療骨髓白血病中似乎更有效，如BV173模型中顯示的，因此在更具侵襲性的AML細(xì)胞SET-2模型中研究該作用。SET-2細(xì)胞貨幣呈在異種移植后快速遷移至骨髓。通過(guò)顯示ESK-雙特異性抗體的短的5小時(shí)的β血漿半衰期的藥代動(dòng)力學(xué)研究指導(dǎo)給藥和時(shí)間安排(圖17A)。將處理劑量增加至每日一次雙特異性抗體注射，持續(xù)總共連續(xù)6天。始于腫瘤接種后第4天，小鼠接受處理，此時(shí)白血病異種移植物已通過(guò)BLI確認(rèn)(圖5A，第一排)。SET-2細(xì)胞在骨髓中快速生長(zhǎng)，并且在接受SET-2細(xì)胞，或SET-2和T細(xì)胞的小鼠的骨髓中看到白血病的大量浸潤(rùn)。然而，在停止處理后超過(guò)一周，在達(dá)14天在ESK-雙特異性抗體治療組中未看到可檢測(cè)的白血病，并且在達(dá)18天后于第32天僅觀察到最小白血病負(fù)荷。對(duì)于所有組對(duì)于從第7至18天的圖像，BLI的尺度的增益均一減小，以顯示預(yù)處理時(shí)間點(diǎn)中的低水平的白血病。對(duì)照-雙特異性抗體組在開(kāi)始時(shí)顯示略微延遲的白血病負(fù)荷。這可由對(duì)照-雙特異性抗體的抗-CD3臂對(duì)EBV-特異性T細(xì)胞的活化引起，所述對(duì)照-雙特異性抗體對(duì)于T細(xì)胞的結(jié)合親和力比ESK-雙特異性抗體強(qiáng)(圖1C)。EBV-特異性T細(xì)胞已被活化并且在體外擴(kuò)增數(shù)倍，從而使它們對(duì)強(qiáng)的多克隆刺激更加易感?；罨腡細(xì)胞隨后釋放可產(chǎn)生針對(duì)腫瘤細(xì)胞的有害環(huán)境的炎性細(xì)胞因子。雖然ESK-雙特異性抗體治療組中的所有小鼠在1個(gè)月后仍然活著，但在利用單獨(dú)的T細(xì)胞處理的或無(wú)處理的小鼠的組中僅有20％的存活率(圖5B)。ESK-雙特異性抗體治療組中的小鼠在達(dá)到40天時(shí)未顯示由白血病至脊椎骨髓的浸潤(rùn)引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)麻痹的體征，然而對(duì)照組中幾乎所有動(dòng)物都受到影響。(圖5C)。這些數(shù)據(jù)證明ESK-雙特異性抗體是針對(duì)骨髓中的侵襲性白血病細(xì)胞的強(qiáng)效治療劑。

ESK-雙特異性抗體在腫瘤部位介導(dǎo)T細(xì)胞保留。雖然已知雙特異性抗體有效地嚙合T細(xì)胞以在體外殺傷靶，但未曾報(bào)導(dǎo)記錄體內(nèi)機(jī)制的體內(nèi)研究。研究ESK-雙特異性抗體的治療效果是否是其吸引T細(xì)胞保留和保持在活動(dòng)物的白血病部位的能力的結(jié)果。在異種移植GEF/熒光素酶陽(yáng)性SET-2AML細(xì)胞后3天將1000萬(wàn)個(gè)利用海腎/熒光素酶轉(zhuǎn)導(dǎo)的EBV-特異性T細(xì)胞注射入NSG小鼠中，4小時(shí)后注射雙特異性抗體。通過(guò)在T細(xì)胞注射時(shí)(0小時(shí))、8(即，在雙特異性抗體注射后4小時(shí))、24、48和72小時(shí)時(shí)的發(fā)光成像監(jiān)測(cè)T細(xì)胞遷移。T細(xì)胞在注射后立即遷移至肺中，隨后在8小時(shí)的時(shí)候分布至其他部分，包括肝、脾和骨髓中(圖6A)。在72小時(shí)中T細(xì)胞信號(hào)逐漸衰減。T細(xì)胞注射，隨后對(duì)照雙特異性抗體注射顯示了與單獨(dú)的T細(xì)胞類似的分布模式和時(shí)間過(guò)程。然而，利用ESK-雙特異性抗體處理的小鼠從4-20小時(shí)在肺和BM中顯示T細(xì)胞信號(hào)的顯著增強(qiáng)，持續(xù)達(dá)到72小時(shí)。細(xì)胞在肺中顯著減少，但保留在肝、脾和BM中。生物發(fā)光強(qiáng)度的定量顯示在ESK-雙特異性抗體注射后4小時(shí)，相較于其他兩個(gè)對(duì)照組存在至肝、脾和骨髓中的約3倍以上的T細(xì)胞積聚(圖6B)。同時(shí)監(jiān)測(cè)白血病進(jìn)展顯示T細(xì)胞保留與白血病負(fù)荷之間的反相關(guān)性(圖6C)。這些結(jié)果提供了ESK-雙特異性抗體可在白血病部位介導(dǎo)延長(zhǎng)的T細(xì)胞保留和針對(duì)表達(dá)WT1和HLA-A0201的腫瘤細(xì)胞的有效地定向的T細(xì)胞的細(xì)胞毒性的強(qiáng)有力的體內(nèi)證據(jù)。

NSG小鼠中的間皮瘤的療法。由于已顯示ESK-雙特異性抗體在兩個(gè)白血病異種移植物模型中的強(qiáng)效治療活性，因此使用腹膜內(nèi)注射模型刺激腹腔間皮瘤來(lái)研究ESK-雙特異性抗體在治療侵襲性實(shí)體瘤中的功效。以1:2的靶-效應(yīng)物比率將WT1+/HLA-A0201+JMN間皮瘤細(xì)胞與EBV-特異性T細(xì)胞混合，并將其腹膜內(nèi)注射入NSG小鼠。1小時(shí)后靜脈內(nèi)注射雙特異性抗體，重復(fù)該過(guò)程持續(xù)連續(xù)5天。1天后，生物發(fā)光成像在利用ESK-雙特異性抗體處理的小鼠中未顯示可見(jiàn)的腫瘤，然而3個(gè)對(duì)照組中的小鼠顯示可見(jiàn)的腫瘤負(fù)荷，這表明ESK-雙特異性抗體已消除腫瘤細(xì)胞(圖7A)。由ESK-雙特異性抗體產(chǎn)生的腫瘤抑制持續(xù)直至第23天；在停止處理后18天，在小鼠中只看到最小的腫瘤負(fù)荷。將每組5只小鼠的生物發(fā)光強(qiáng)度求平均值顯示持久的且在第23天約20多倍的腫瘤抑制(圖7B)。

藥代動(dòng)力學(xué)：為了測(cè)定ESK雙特異性抗體的藥代動(dòng)力學(xué)，將示蹤¹²⁵I-標(biāo)記的構(gòu)建體靜脈內(nèi)注射入C57BL6/J，或腹膜注射入BALB/c小鼠，在48-52小時(shí)中測(cè)量血液放射性活性。靜脈內(nèi)注射的雙特異性抗體以30分鐘的α半衰期快速?gòu)难涸俜植贾两M織，隨后以5小時(shí)的β半衰期消除。在腹膜內(nèi)遞送，雙特異性抗體水平在血液中升高，于注射后3小時(shí)達(dá)到峰值。所述構(gòu)建體隨后以相同的β半衰期清除。從靜脈內(nèi)注射的總暴露(曲線下面積)大于腹膜內(nèi)注射。使用相同的放射性構(gòu)建體測(cè)定抗體的生物分布模式。24小時(shí)后，在所有組織中檢測(cè)到<1％的注射劑量/克(圖17A，17B)。

ESK-雙特異性抗體誘導(dǎo)針對(duì)HLA-A0201的背景中的HER2表位的二次T細(xì)胞應(yīng)答。雙特異性抗體的作用機(jī)制已歸功于它們將癌細(xì)胞靶與T細(xì)胞橋接以形成溶細(xì)胞突觸的直接作用。使用來(lái)自具有卵巢癌的HLA-A*02:01陽(yáng)性患者的自體體外模型，研究此類鄰面接觸是否可活化對(duì)于由自體腫瘤細(xì)胞表達(dá)的其他腫瘤抗原是特異的群體中的預(yù)先存在的T細(xì)胞，以確定雙特異性抗體是否可發(fā)揮疫苗作用。在低劑量的ESK-雙特異性抗體存在的情況下，將患者的PBMC與她的自體腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)；一周后，通過(guò)IFN-g ELISPOT測(cè)定評(píng)估受表位特異性HLA-A*02:01限制的T細(xì)胞應(yīng)答。包括單獨(dú)的細(xì)胞或具有對(duì)照雙特異性抗體的對(duì)照組不顯示任何特異性IFN-g釋放。患者的腫瘤細(xì)胞在它們的細(xì)胞表面上表達(dá)WT1RMF和HER2-neu(圖18A-C)。令人驚訝地，在ESK-雙特異性介導(dǎo)的相互作用結(jié)束后很長(zhǎng)時(shí)間，誘導(dǎo)針對(duì)HER2-neu-369表位、單獨(dú)的自體腫瘤細(xì)胞和SET-2AML細(xì)胞的強(qiáng)二次T細(xì)胞應(yīng)答(圖19A-F)。這些自體細(xì)胞針對(duì)56種匯集的WT1衍生的表位、WT1表位RMF、AILDF05或LDF；p53衍生的表位264-273；Prame-300、Prame-435；尤文肉瘤表位EW、Muc1-15、-16和-18；或HL60細(xì)胞的應(yīng)答未被測(cè)量到。由于SET-2不表達(dá)HER2-neu并且T細(xì)胞不識(shí)別WT1RMF，因此針對(duì)SET-2的T細(xì)胞應(yīng)答顯示對(duì)既非WT1也非HER2-neu的其他尚待確定的表位的識(shí)別。這些結(jié)果明確地證明了ESK-雙特異性抗體可誘導(dǎo)針對(duì)多種腫瘤抗原的二次T細(xì)胞應(yīng)答，從而提供了預(yù)料之外的疫苗作用。

原則上，二次T細(xì)胞應(yīng)答應(yīng)當(dāng)需要PBMC當(dāng)中的可吸收腫瘤細(xì)胞死亡后釋放的細(xì)胞內(nèi)抗原并呈遞其的專職APC?；蛘?，腫瘤細(xì)胞可在T細(xì)胞與腫瘤的鄰面接觸過(guò)程中直接活化預(yù)先存在的表位-特異性T細(xì)胞。為了闡明機(jī)制，觀察利用純化的T細(xì)胞以及耗竭了NK細(xì)胞和耗竭了巨噬細(xì)胞的PBMC(T加B細(xì)胞)對(duì)比完全PBMC作為效應(yīng)細(xì)胞，所述疫苗作用是否可發(fā)生。有趣地，作為效應(yīng)物的單獨(dú)的T細(xì)胞仍然能夠以如通過(guò)T加上B細(xì)胞(圖19C)或完全PBMC(圖19D)產(chǎn)生的量級(jí)相似的量級(jí)響應(yīng)HER2-neu、自體腫瘤細(xì)胞和SET-2細(xì)胞。為了排除這些自身癌癥抗原的自我T細(xì)胞呈遞的可能性，在ESK-雙特異性抗體存在或不存在的情況下，將純化的T細(xì)胞與自體腫瘤細(xì)胞裂解物(通過(guò)反復(fù)凍融產(chǎn)生的)共培養(yǎng)。在該背景中針對(duì)HER2-neu表達(dá)或腫瘤細(xì)胞未看到T細(xì)胞應(yīng)答(圖19D)。這些結(jié)果證明了對(duì)于雙特異性抗體誘導(dǎo)的針對(duì)HER2-neu或腫瘤細(xì)胞中存在的其他表位的二次T細(xì)胞應(yīng)答既不需要專職APC也不需要表位腫瘤，從而交叉呈遞也不是所述機(jī)制。

也檢查腫瘤細(xì)胞抗原呈遞是否依賴于共刺激分子。雖然來(lái)自健康人供體的CD14+單核細(xì)胞顯示強(qiáng)CD86表達(dá)，但卵巢癌細(xì)胞幾乎不具有CD86表達(dá)。結(jié)果表明關(guān)鍵的共刺激分子CD86不可能參與腫瘤細(xì)胞抗原呈遞(圖20)。未檢測(cè)到CD86或ICOSL表達(dá)。共刺激分子的不存在是腫瘤細(xì)胞為低效抗原呈遞細(xì)胞的原因之一；然而，某些細(xì)胞因子可提供共刺激信號(hào)來(lái)滿足對(duì)于腫瘤特異性T細(xì)胞活化的要求。ESK-雙特異性抗體誘導(dǎo)PBMC和T細(xì)胞分泌IFN-γ和TNF-α(圖19E-F)。

為了測(cè)試ESK-雙特異性抗體是否具有對(duì)T細(xì)胞群體的任何長(zhǎng)效作用，在利用ESK-雙特異性抗體初次活化后，在低劑量的IL-15和IL-2中體外擴(kuò)增T細(xì)胞。雖然對(duì)照組中的T細(xì)胞在培養(yǎng)中存活不超過(guò)1周，但由ESK--雙特異性抗體活化的T細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)2個(gè)月而無(wú)需進(jìn)一步活化。表型分析顯示在通過(guò)ESK--雙特異性抗體和腫瘤活化后7周，CD8+T細(xì)胞增加至群體的89％，并且CD4+T細(xì)胞降至6％(圖21A-B)。有趣地，在CD8+/CCR7-細(xì)胞當(dāng)中，CD45RA-/CD45RO+細(xì)胞增加，表明效應(yīng)物記憶表型。重要的是，即使在該后一時(shí)間點(diǎn)上，這些T細(xì)胞仍然保持它們針對(duì)自體腫瘤和SET-2AML細(xì)胞的原始特異性(圖21C)。這些結(jié)果表明ESK-雙特異性抗體可誘導(dǎo)長(zhǎng)效二次特異性CD8T細(xì)胞應(yīng)答。

討論

本公開(kāi)提供從TCR-樣mAb衍生的第一雙特異性抗體構(gòu)建體。所述ESK-雙特異性抗體對(duì)于由HLA-A0201分子呈遞的WT1RMF表位是特異的。所述ESK-雙特異性抗體在體外和體內(nèi)顯示針對(duì)多種癌癥，包括ALL、AML、間皮瘤和原發(fā)性卵巢癌細(xì)胞的強(qiáng)效抗腫瘤活性。此處提供的研究與先前的研究不同在于：1)mAb是TCR樣mAb，從而允許識(shí)別細(xì)胞內(nèi)腫瘤特異性靶；2)腫瘤細(xì)胞上的靶密度極低，從而提供了可將雙特異性抗體應(yīng)用于廣泛得多的靶的概念驗(yàn)證；3)利用同時(shí)的雙重效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞跟蹤顯示了ESK-雙特異性抗體體內(nèi)活性的機(jī)制(先前雙特異性抗體研究未曾顯示該結(jié)果，因?yàn)樵诖蠖鄶?shù)動(dòng)物研究中，在注射之前將效應(yīng)T細(xì)胞和靶細(xì)胞混合)；4)通過(guò)使用自體系統(tǒng)，證明了所述ESK-雙特異性抗體可打破T細(xì)胞對(duì)殺傷原發(fā)性卵巢癌細(xì)胞的耐受性；5)所述ESK-雙特異性抗體誘導(dǎo)針對(duì)其他腫瘤抗原諸如HER2-neu的長(zhǎng)壽合二次特異性T細(xì)胞應(yīng)答。此外，所述二次T細(xì)胞應(yīng)答不由通過(guò)經(jīng)典APC產(chǎn)生的交叉呈遞介導(dǎo)，相反地為通過(guò)所述雙特異性抗體促進(jìn)的T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞之間的直接和物理上緊密的相互作用的結(jié)果。

目前正在開(kāi)發(fā)的所有雙特異性抗體構(gòu)建體靶向作為在正常細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的譜系或分化抗原的細(xì)胞表面蛋白，諸如CD19、CD33、前列腺特異性膜抗原(PSMA)或表皮生長(zhǎng)因子(EGF)受體。相反地，本公開(kāi)首先證明TCR-樣雙特異性抗體構(gòu)建體能夠識(shí)別來(lái)自腫瘤特異性靶的肽/MHC復(fù)合物的低密度表位。這反駁了scFv雙特異性抗體構(gòu)建體因?yàn)橛H和力太低或活化T細(xì)胞的細(xì)胞毒性的能力不充足而可能不適合用于靶向低密度Ag的傳統(tǒng)觀點(diǎn)。本公開(kāi)首次證明TCR模擬雙特異性抗體構(gòu)建體能夠在造血腫瘤和實(shí)體瘤的幾個(gè)小鼠模型中具有強(qiáng)效治療活性，從而提供了廣泛拓寬靶向其他癌癥特異性細(xì)胞內(nèi)腫瘤抗原的雙特異性抗體的開(kāi)發(fā)的概念驗(yàn)證。雖然從體外測(cè)定已知雙特異性抗體將T細(xì)胞與癌癥接觸，但先前未在體內(nèi)觀察到此類機(jī)制。本公開(kāi)提供了靶向其他細(xì)胞內(nèi)腫瘤Ag的雙特異性mAb的將來(lái)開(kāi)發(fā)的概念驗(yàn)證。因此，本文所述的ESK-雙特異性抗體可拓寬平臺(tái)的治療性應(yīng)用。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述ESK-雙特異性抗體誘導(dǎo)針對(duì)共表達(dá)WT1和HLA-A0201的淋巴性白血病和髓樣白血病、間皮瘤和原發(fā)性卵巢癌細(xì)胞的快速且強(qiáng)效的體外細(xì)胞毒性活性。相較于在超過(guò)16小時(shí)的培養(yǎng)后顯示T細(xì)胞殺傷的利用各種其他雙特異性抗體構(gòu)建體的研究，可在5小時(shí)的共孵育中檢測(cè)到靜止T細(xì)胞或EBV-特異性T細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的裂解。ESK-雙特異性抗體的細(xì)胞毒性活性可通過(guò)較長(zhǎng)時(shí)期的孵育來(lái)進(jìn)一步增強(qiáng)，通過(guò)利用SET-2AML細(xì)胞實(shí)現(xiàn)的高達(dá)80-90％的殺傷顯示的。這與對(duì)于CD33和CD19是特異的其他雙特異性抗體mAb共享類似的特性，從而表明ESK-雙特異性抗體以一系列方式將T細(xì)胞與靶嚙合。IFN-g分泌進(jìn)一步證明ESK-雙特異性抗體介導(dǎo)的靶特異性T細(xì)胞活化。具有臨床相關(guān)性的重要觀察是ESK-雙特異性抗體可高效地活化來(lái)自卵巢癌患者的未操作T細(xì)胞，以增殖并殺傷自體腫瘤細(xì)胞，這表明ESK-雙特異性抗體的存在可強(qiáng)制T細(xì)胞克服對(duì)自身腫瘤Ag的耐受性。已知的是，在實(shí)體瘤中頻率觀察到T細(xì)胞浸潤(rùn)。雙特異性抗體的相對(duì)低的分子量將允許ESK-雙特異性抗體更好地滲透進(jìn)入實(shí)體瘤以活化無(wú)反應(yīng)性的或無(wú)應(yīng)答的T細(xì)胞殺傷周圍腫瘤細(xì)胞。

ESK-雙特異性抗體的體外細(xì)胞毒性在體內(nèi)也得到驗(yàn)證，如通過(guò)其在異種移植物模型中針對(duì)Ph1+ALL、AML和間皮瘤的相當(dāng)強(qiáng)的治療活性顯示的。在兩個(gè)白血病模型中，腫瘤細(xì)胞的消除很明顯，尤其在骨髓中。另外，ESK-雙特異性抗體預(yù)防和延遲了CNS麻痹(由脊椎骨髓的浸潤(rùn)引起的白血病的特征性質(zhì))。

當(dāng)與腫瘤細(xì)胞分開(kāi)地注射T細(xì)胞時(shí)(通常不用于臨床前雙特異性抗體實(shí)驗(yàn)的方案)，ESK-雙特異性抗體在體內(nèi)殺傷白血病細(xì)胞的能力提出了關(guān)于雙特異性抗體的體內(nèi)活性的機(jī)制的問(wèn)題。利用SET-2細(xì)胞的研究進(jìn)一步提出了ESK-雙特異性抗體是否活躍地在靶上招募和保留T細(xì)胞的問(wèn)題。這些問(wèn)題通過(guò)使用雙重生物發(fā)光成像同時(shí)跟蹤效應(yīng)T細(xì)胞和SET-2AML細(xì)胞得到解決。利用ESK-雙特異性抗體處理的小鼠的骨髓中存在約3倍的T細(xì)胞的增加。所述T細(xì)胞保留與腫瘤減小密切相關(guān)。本公開(kāi)提供了ESK-雙特異性抗體可高效地將T細(xì)胞與靶嚙合并原位殺傷腫瘤細(xì)胞的直接體內(nèi)證據(jù)。

在NSG小鼠中研究ESK-雙特異性抗體在利用腹膜間皮瘤的實(shí)體瘤模型中的治療活性。PK研究顯示ESK-雙特異性抗體的靜脈內(nèi)注射在血流中產(chǎn)生比腹膜內(nèi)注射高的水平，但所述雙特異性抗體的血漿半衰期特征性地短。在處理的小鼠中看到快速且顯著的腫瘤抑制，表明ESK-雙特異性抗體快速接近腹膜腫瘤細(xì)胞。PK研究確認(rèn)了來(lái)自其他雙特異性抗體構(gòu)建體的藥代動(dòng)力學(xué)觀察，從而表明ESK-雙特異性抗體的連續(xù)施用可能是獲得最佳治療功效所必需的。

與其他雙特異性抗體構(gòu)建體類似，ESK-雙特異性抗體的限制也是天然Fc區(qū)的缺乏，從而阻止了與新生FcRn受體的相互作用，這是延遲mAb清除和較長(zhǎng)血液PK所必需的。工程化具有雙重靶特異性但維持其天然結(jié)構(gòu)的mAb的替代雙特異性形式可提供較長(zhǎng)的半衰期并且可在臨床應(yīng)用中顯著提高其功效。有趣地，觀察到全長(zhǎng)mAb ESK1在消除小鼠的肺和肝中的消除彌漫性白血病BV173細(xì)胞中更有效，而ESK-雙特異性抗體在骨髓中似乎更有效。這可反映在身體的不同器官中發(fā)現(xiàn)的效應(yīng)物的含量和類型(例如，肝中的巨噬細(xì)胞和血液及骨髓中的T細(xì)胞)。該差異還表明，如果可確定適當(dāng)?shù)膭┝亢头桨?，則一起使用的全長(zhǎng)IgG和雙特異性抗體的組合可提供累加作用。mAb開(kāi)發(fā)中的治療性TCR是相對(duì)新的，并且存在許多未解決的關(guān)于它們的可能應(yīng)用的問(wèn)題。針對(duì)TCRm mAb的雙特異性mAb法的開(kāi)發(fā)將允許拓寬它們的范圍以包括不僅腫瘤特異性抗原，而且還包括細(xì)胞內(nèi)靶以及其他重要的超低密度靶。

雙特異性抗體作用機(jī)制迄今已歸于T細(xì)胞與mAb特異性細(xì)胞靶之間的直接相互作用。吸引人的發(fā)現(xiàn)是對(duì)于WT1RMF表位是特異的ESK-雙特異性抗體在自體卵巢癌模型中誘導(dǎo)對(duì)于其他癌癥抗原(以及非WT1靶)諸如HER2-neu表位369是高度特異的二次T細(xì)胞應(yīng)答。已顯示，T細(xì)胞與靶細(xì)胞之間的此類鄰面接觸可直接再活化(無(wú)需交叉呈遞)存在于患者中的耐受性或無(wú)反應(yīng)性的T細(xì)胞，以與其他癌癥抗原反應(yīng)。令人驚訝地，檢測(cè)到強(qiáng)勁且長(zhǎng)效的HER2-neu表位特異性T細(xì)胞應(yīng)答，以及其他癌癥特異性反應(yīng)性。存在具有效應(yīng)物記憶表型的CD8T細(xì)胞的增加，這進(jìn)一步支持新的表位特異性T細(xì)胞應(yīng)答的觀察，因?yàn)镃D8T細(xì)胞必須已被活化，才可響應(yīng)受HLA-A*02:01限制的表位而增殖。單一ESK-雙特異性抗體活化的量級(jí)及持續(xù)時(shí)間遠(yuǎn)優(yōu)于通常觀察到的常規(guī)肽/APC誘導(dǎo)的表位特異性T細(xì)胞應(yīng)答(Dao等，同上)。有趣地，即使患者作為先前的過(guò)繼細(xì)胞療法的結(jié)果而在她的循環(huán)中具有WT1反應(yīng)性T細(xì)胞，ESK-雙特異性抗體不誘導(dǎo)針對(duì)原始靶表位WT1-RMF的T細(xì)胞應(yīng)答。這些發(fā)現(xiàn)與這樣的假說(shuō)相符，即所述雙特異性抗體將T細(xì)胞的TCR與腫瘤相細(xì)胞拉近以直接識(shí)別腫瘤上的新的MHC/肽表位，以及在該T細(xì)胞刺激期過(guò)程中所述ESK-雙特異性抗體對(duì)其肽/MHC表位的結(jié)合阻斷了對(duì)來(lái)自T細(xì)胞的同源TCR的RMF/A0201表位的任何識(shí)別。

已在被施予疫苗或T細(xì)胞輸注的患者中檢測(cè)到針對(duì)不存在于原始疫苗中的各種腫瘤抗原的T細(xì)胞的擴(kuò)增，并且所述擴(kuò)增與應(yīng)答相關(guān)聯(lián)；該現(xiàn)象被稱為“表位擴(kuò)散”，并且被認(rèn)為由通過(guò)APC加工細(xì)胞凋亡的腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的交叉呈遞介導(dǎo)的(Corbiere,V.等Cancer Res.71(4),1253-1262(2011))。已報(bào)導(dǎo)了mAb對(duì)CD20的疫苗作用；所述作用似乎也由抗體介導(dǎo)的靶細(xì)胞至APC的調(diào)理作用介導(dǎo)(Hilchey等Blood 113(16),3809-3812(2009))。

本文中公開(kāi)的雙特異性mAb的新的作用機(jī)制的發(fā)現(xiàn)可對(duì)將來(lái)的療法具有特別重要的意義，因?yàn)閷?shí)體瘤的T細(xì)胞浸潤(rùn)與臨床反應(yīng)相關(guān)聯(lián)。由于其的低分子量，雙特異性抗體可滲透入實(shí)體瘤以活化無(wú)反應(yīng)性或無(wú)應(yīng)答的T細(xì)胞殺傷不僅表達(dá)已知的雙特異性抗體的抗原性靶而且還表達(dá)其他未確定的特異性腫瘤抗原的腫瘤細(xì)胞。針對(duì)多種新的表位的雙特異性抗體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性T細(xì)胞的克隆性擴(kuò)增應(yīng)當(dāng)通過(guò)防止癌細(xì)胞變體或低抗原密度細(xì)胞的逃避，以及通過(guò)促進(jìn)長(zhǎng)壽命免疫，在很程度上促成了其長(zhǎng)效治療功效。另外，在特異性過(guò)繼T細(xì)胞療法之前，可將所述疫苗作用用于離體擴(kuò)增。

雖然為了闡明理解通過(guò)說(shuō)明和舉例的方式已稍詳細(xì)地描述了前述發(fā)明，但根據(jù)本公開(kāi)的教導(dǎo)對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)很顯然的是，可在不背離所附權(quán)利要求的精神或范圍的情況下對(duì)其進(jìn)行某些改變和修改。本文中引用的所有參考資料在此通過(guò)引用整體并入本申請(qǐng)。