一種基于單域抗體的雙特異性嵌合抗原受體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)或生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基于單域抗體的雙特異性嵌 合抗原受體及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著腫瘤免疫學(xué)理論和臨床技術(shù)的發(fā)展，嵌合抗原受體T細(xì)胞療法（Chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T)成為目前最有發(fā)展前景的腫瘤免疫療 法之一。一般，嵌合抗原受體CAR由一個(gè)腫瘤相關(guān)抗原結(jié)合區(qū)、胞外鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)域以及 胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)組成。CAR-T細(xì)胞療法通過外源基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，把識別腫瘤相關(guān)抗原的單 鏈抗體（Single chain fragment variable，scFv)和T細(xì)胞活化序列的融合蛋白表達(dá)到T 細(xì)胞表面，使可以特異識別腫瘤相關(guān)抗原的scFv通過跨膜區(qū)與T細(xì)胞胞內(nèi)的活化增殖信號 域偶聯(lián)。表達(dá)CAR的T細(xì)胞以抗原依賴、但非MHC限制的方式結(jié)合腫瘤抗原，啟動(dòng)并活化特 異性殺傷腫瘤反應(yīng)。
[0003] ⑶19、⑶20分子是治療B淋巴細(xì)胞系腫瘤潛在的靶點(diǎn)，也是CAR研究中的熱點(diǎn)。靶 向CD19分子的嵌合抗原受體基因修飾的T細(xì)胞（CD19 CAR-T)在治療多發(fā)性、難治性的急 性B淋巴細(xì)胞白血病上取得巨大成功，而在難治性、復(fù)發(fā)性慢性B淋巴細(xì)胞白血病和B淋巴 細(xì)胞系淋巴瘤的治療中療效明顯較差。CD20分子也是B淋巴細(xì)胞系淋巴瘤，尤其是慢性、套 細(xì)胞淋巴瘤表面的靶標(biāo)分子。一般在⑶19陽性的B細(xì)胞表面都會(huì)表達(dá)⑶20。所以理論上 如果能實(shí)現(xiàn)針對CD19和CD20的雙靶標(biāo)的雙特異性CAR-T技術(shù)，其對B淋巴細(xì)胞白血病和 B淋巴細(xì)胞系淋巴瘤的療效應(yīng)該可以明顯改善。
[0004] 另外，目前針對⑶19的CAR-T細(xì)胞療法在治療急性B淋巴細(xì)胞白血病的臨床試驗(yàn) 中雖然可以在短期內(nèi)實(shí)現(xiàn)90 %左右的完全緩解療效，但在治療后數(shù)月后發(fā)現(xiàn)有約10 %的 患者發(fā)生遠(yuǎn)期復(fù)發(fā)，主要原因是殘存腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生了 CD19缺失的變異株。因而同時(shí)設(shè)計(jì)針 對腫瘤表面CD19及CD20抗原進(jìn)行協(xié)同CAR-T療法，將不僅有效提高T細(xì)胞加強(qiáng)殺傷信號 并且可以利用像抗生素聯(lián)用一樣的原理，有效地避免發(fā)生靶點(diǎn)逃逸現(xiàn)象引起的遠(yuǎn)期白血病 復(fù)發(fā)。
[0005] CAR-T細(xì)胞的有效激活均嚴(yán)重依賴識別腫瘤相關(guān)抗原的抗體的特異性以及抗原 結(jié)合的親和力高低等性質(zhì)。所以在目前CAR-T細(xì)胞胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)的設(shè)計(jì)已經(jīng)趨于成熟 的現(xiàn)狀下，抗原結(jié)合區(qū)的設(shè)計(jì)成為新型CAR-T技術(shù)開發(fā)的重點(diǎn)和關(guān)鍵。從駱駝源重鏈抗 體（Heavy chain antibody, HCAb)中克隆出僅由一個(gè)重鏈可變區(qū)組成的單鏈抗體，其大小 僅為2. 4X4nm，是能夠結(jié)合抗原的最小片段，稱為單域抗體（Variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody, VHH)或納米抗體。與傳統(tǒng)抗體相比，VHH單域抗體分子 量小且表達(dá)量高，化學(xué)穩(wěn)定性好，親和力高并且與人源抗體同源性高，免疫原性低。分子量 小易于進(jìn)行基因工程改造，構(gòu)建雙重或多重特異性的單域抗體組合，達(dá)到一個(gè)分子多靶點(diǎn) 或多種功能的效果。VHH組織滲透性好，在進(jìn)行腫瘤治療時(shí)，具有接觸到不能被常規(guī)抗體接 觸的較為隱蔽的靶點(diǎn)的可能性。正由于這些優(yōu)點(diǎn)，利用單域抗體作為CAR的抗原結(jié)合區(qū)進(jìn) 行CAR修飾及CAR-T細(xì)胞療法是CAR療法的創(chuàng)新性的發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種應(yīng)用于高效拮抗包括血液病 在內(nèi)的各種癌癥的多靶點(diǎn)的CAR-T細(xì)胞療法中的雙特異性單域抗體嵌合抗原受體。
[0007] 本發(fā)明的另一目的是提供含有該雙特異性單域抗體嵌合抗原受體的T淋巴細(xì)胞 或其他免疫效應(yīng)細(xì)胞。
[0008] 本發(fā)明的又一目的是提供該雙特異性單域抗體嵌合抗原受體的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明的目的可通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種基于單域抗體的雙特異性嵌合抗原 受體，胞外信號肽，由兩個(gè)不同單域抗體構(gòu)成的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)信號傳 導(dǎo)結(jié)構(gòu)域共同組成。
[0010] 所述基于單域抗體的雙特異性嵌合抗原受體，其抗原與惡性腫瘤相關(guān)聯(lián)，可以 選自 CD19、CD20、CD22、CD33/IL3Ra、CD38、BCMA、CS1、CD138、c-Met、EGFRvIII、⑶-2、 NY-ES0-1、MAGE A3、糖脂F(xiàn)77中任意二者的組合；優(yōu)選⑶19與⑶20的組合；進(jìn)一步優(yōu)選 的包括CD19及CD20抗原特異性的兩個(gè)單域抗體VHH鏈組成的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并由一個(gè) Linker 連接。
[0011] 其中，所述的CD19抗原特異性的單域抗體VHH鏈包括框架區(qū)FR和互補(bǔ)決定區(qū) CDR，所述框架區(qū)FR包括FRl~FR4的氨基酸序列：SEQ ID NO:4所示的FRl，SEQ ID NO: 5 所示的FR2, SEQ ID NO:6所示的FR3, SEQ ID NO: 7所示的FR4 ;所述互補(bǔ)決定區(qū)CDR包括 CDRl ~CDR3 的氨基酸序列：SEQ ID NO:8 所示的 CDRl，SEQ ID NO:9 所示的 CDR2, SEQ ID 勵(lì)：10所示的〇?3。
[0012] 所述的⑶19抗原特異性的單域抗體VHH鏈優(yōu)選具有SEQ ID NO: 3所示的氨基酸 序列。
[0013] 編碼所述的⑶19抗原特異性的單域抗體VHH鏈的核苷酸序列優(yōu)選如SEQ ID NO: 11所示。
[0014] 所述的⑶20抗原特異性的單域抗體VHH鏈包括框架區(qū)FR和互補(bǔ)決定區(qū)⑶R，所 述框架區(qū)FR包括FRl~FR4的氨基酸序列：SEQ ID NO: 13所示的FR1，SEQ ID NO: 14所 示的FR2, SEQ ID NO: 15所示的FR3, SEQ ID NO: 16所示的FR4 ;所述互補(bǔ)決定區(qū)CDR包括 CDRl ~CDR3 的氨基酸序列：SEQ ID NO: 17 所示的 CDR1，SEQ ID NO: 18 所示的 CDR2, SEQ 10勵(lì)：19所示的〇?3。
[0015] 所述的⑶20抗原特異性的單域抗體VHH鏈優(yōu)選具有SEQ ID NO: 12所示的氨基酸 序列。
[0016] 編碼所述的⑶20抗原特異性的單域抗體VHH鏈的核苷酸序列如SEQ ID NO: 20所 不。
[0017] 所述基于單域抗體的雙特異性嵌合抗原受體優(yōu)選進(jìn)一步包括共刺激信號傳導(dǎo)區(qū)， 包括選自下列的共刺激分子的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域：⑶27、⑶28、4-1ΒΒ、0X40、⑶30、⑶40、⑶3、淋 巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-I (LFA-I)、⑶2、⑶7、LIGHT、NKG2C、B7-H3與⑶83特異性結(jié)合的配體 和其任意組合。
[0018] 所述基于單域抗體的雙特異性嵌合抗原受體優(yōu)選地由⑶8信號肽、⑶19及⑶20抗 原特異性的兩個(gè)單域抗體、CD28跨膜區(qū)以及CD28、CD3胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域依次串聯(lián)組成。
[0019] 所述基于單域抗體的雙特異性嵌合抗原受體更進(jìn)一步優(yōu)選具有SEQ ID NO: 1所示 的氨基酸序列，其編碼基因序列如SEQ ID NO:2所示。
[0020] -種基因工程改造的免疫效應(yīng)細(xì)胞，包括編碼本發(fā)明所述的雙特異性嵌合抗原受 體的核苷酸序列。所述的免疫效應(yīng)細(xì)胞選自T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞，造血干細(xì)胞、多能干細(xì)胞 或胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)分化的免疫細(xì)胞，優(yōu)選T淋巴細(xì)胞。
[0021] 其中，所述嵌合抗原受體優(yōu)選由CD8信號肽、CD19及CD20抗原特異性的兩個(gè)單域 抗體、⑶28跨膜區(qū)以及⑶28、⑶3胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域依次串聯(lián)組成。
[0022] 所述嵌合抗原受體進(jìn)一步優(yōu)選具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列，其編碼基因 序列如SEQ ID NO:2所示。
[0023] 本發(fā)明所述的雙特異性嵌合抗原受體在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用；優(yōu)選在制備抗 血液惡性腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
[0024] 本發(fā)明所述的免疫效應(yīng)細(xì)胞在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用；優(yōu)選在制備抗血液惡性 腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
[0025] 有益效果：
[0026] 我們利用基因工程手段設(shè)計(jì)雙特異性單域抗體作為CAR的抗原結(jié)合區(qū)進(jìn)行CAR修 飾及CAR-T細(xì)胞療法是CAR療法的創(chuàng)新性的發(fā)展。例如，將兩個(gè)單域抗體結(jié)合起來（兩個(gè) 重鏈串聯(lián)）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上和一個(gè)重鏈與輕鏈串聯(lián)的scFv其實(shí)非常相似，我們的研究也證實(shí) 雙特異性單域抗體完全可以作為CAR