專利名稱：雙特異性抗-ErbB-1/抗-c-Met抗體的制作方法
雙特異性抗-ErbB-V抗-c-Met抗體本發(fā)明涉及針對人ErbB-I和針對人c_Met的雙特異性抗體，制備它們的方法，包含所述抗體的藥物組合物，及其用途。
背景技術(shù)：
ErbB家族蛋白質(zhì)ErbB蛋白質(zhì)家族由4個成員組成ErbB-Ι，也稱為表皮生長因子受體(EGFR)， ErbB-2，在人中也稱為HER2和在嚙齒動物中也稱為neu，ErbB_3，也稱為HER3，和ErbB_4， 也稱為HER4。ErbB家族蛋白質(zhì)是受體酪氨酸激酶，代表細胞生長、分化和存活的重要調(diào)控劑。ErbB-I 和抗-ErbB-Ι 抗體Erb-Bl (也已知為ERBBl，人表皮生長因子受體，EGFR，HER-I或禽類成紅細胞白血病病毒(v-erb-b)癌基因同系物；SEQ ID NO :16)，是由c_erbB原癌基因編碼的170kDa的跨膜受體，并且顯示固有的酪氨酸激酶活性(Modjtahedi，H.，等， 英國癌癥雜志(Br. J. Cancer) 73 (1996) 228-235 ；Herbst, R. S.和 Shin, D. Μ.，癌癥 (Cancer) 94 (2002) 1593-1611)。還存在EGFR的同種型和變體(例如，可變RNA轉(zhuǎn)錄物， 截短形式，多態(tài)性等)，包括但不限于Swissprot數(shù)據(jù)庫登錄號P00533-1，P00533-2, P00533-3，和P00533-4確定的那些。已知EGFR結(jié)合包括以下各項的配體表皮生長因子(EGF)，轉(zhuǎn)化生長α)，雙調(diào)蛋白(amphiregulin)，肝素結(jié)合EGF (hb-EGF)，β細胞素(betacellulin)，因子 α (TGf-和表皮調(diào)節(jié)素 kpiregulin) (Herbst, R. S.和 Shin, D. Μ.,癌癥(Cancer) 94 (2002) 1593—1611 ；Mendelsohn, J.，禾口 Baselga，J.,癌基因(Oncogene) 19 (2000) 6550-6565)。EGFR經(jīng)由酪氨酸激酶介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)許多細胞過程，包括但不限于激活控制細胞增殖、分化、細胞存活、程序性細胞死亡、 血管發(fā)生、有絲分裂發(fā)生和轉(zhuǎn)移的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(Atalay，G.，等，腫瘤學(xué)年刊(Arm. Oncology) 14(2003) 1346-1363 ；Tsao, Α. S.和 Herbst，R. S.信號(Signal)4(2003)4-9 ； Herbst, R. S.，和 Shin，D. Μ.，癌癥(Cancer) 94 (2002) 1593-1611 ；Modjtahedi, H.，等，英國癌癥雜志(Br. J. Cancer) 73 (1996) 228-235)?？?ErbB-I抗體靶向EGFR的胞外部分，導(dǎo)致阻斷配體結(jié)合并由此抑制下游事件如細胞增殖(Tsao, A. S.，和 Herbst，R. S.，信號(Signal) 4 (2003) 4—9)。已經(jīng)開發(fā)了嵌合抗-ErbB-I抗體，其包含來自兩種或多種不同物種(例如，小鼠和人類)的抗體的部分。參見例如US 5，891，996 (小鼠/人嵌合抗體，R3)，或US 5，558，864 (嵌合和人源化形式的鼠抗-EGFR MAb 425)。此外，IMC-C225 (西妥昔單抗(cetuximab)，Erbitux ; ImClone)是嵌合小鼠/人抗-EGFR單克隆抗體(基于小鼠M225單克隆抗體，其在人臨床試驗中導(dǎo)致HAMA 應(yīng)答)，其已經(jīng)報道在各種人異種移植模型中顯示抗腫瘤功效。(Herbst，R. S.，和Shin， D.M.，癌癥(Cancer) 94 (2002) 1593-1611)。IMC-C225的功效已經(jīng)歸因于幾種機制，包括抑制通過EGFR信號傳導(dǎo)途徑、和可能通過增加的抗體依賴性細胞毒作用(ADCC)活性調(diào)節(jié)的細胞事件(Herbst, R. S.，和 Shin，D. Μ.，癌癥(Cancer)94(2002) 1593-1611)。IMC-C225 也用于臨床試驗中，包括與放射療法和化學(xué)療法聯(lián)合(Herbst，R. S.，和Shin，D. Μ.，癌癥(Cancer) 94 (2002) 1593-1611)。最近，Abgenix 公司(Abgenix, Inc.) (Fremont, CA)開發(fā)了用于癌癥治療的ABX-EGF。ABX-EGF是一種完全的人抗-EGFR單克隆抗體。(Yang，X. D.， 等，腫瘤學(xué) / 血液學(xué)評論綜述(Crit. Rev. Oncol. /Hematol.) 38 (2001) 17-23)。WO 2006/082515涉及源自大鼠單克隆抗體ICR62的人源化的抗-EGFR單克隆抗體并且涉及它們用于癌癥治療的糖改造形式。c-Met 和抗-c-Met 抗體MET(間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)變因子)是一種原癌基因，其編碼蛋白質(zhì)MET，(也已知為c-Met ；肝細胞生長因子受體HGFR ；HGF受體；分散因子受體；SF受體；SEQ ID NO 15) (Dean, Μ.,等，自然(Nature) 318 (1985) 385-8 ;Chan，Α· Μ·，等，癌基因 (Oncogene) 1 (1987) 229-33 ；Bottaro, D. P.，等，科學(xué)(Science) 251 (1991) 802-4 ；Naldini, L.，等，EMBO 雜志(ΕΜΒ0 J.) 10 (1991) 2867-78 ；Maulik, G.，等，細胞因子生長因子綜述 (Cytokine Growth Factor Rev.) 13 (2002) 41-59)。MET 是胚胎發(fā)育和傷口愈合必需的膜受體。肝細胞生長因子(HGF)是MET受體僅有的已知配體。MET被上皮來源的細胞正常表達， 而HGF的表達局限于間充質(zhì)來源的細胞。經(jīng)HGF刺激，MET誘導(dǎo)數(shù)種生物學(xué)反應(yīng)，它們共同產(chǎn)生已知為侵襲性生長的程序。癌癥中異常的MET活化與差的預(yù)后相關(guān)，在此異?；钚缘?MET引發(fā)腫瘤生長，形成向腫瘤供應(yīng)營養(yǎng)素的新血管(血管生成)，以及癌癥擴散到其它器官(轉(zhuǎn)移)。MET在許多類型的人惡性腫瘤中下調(diào)，所述人惡性腫瘤包括腎癌、肝癌、胃癌、 乳腺癌和腦癌。通常，僅有干細胞和祖細胞表達MET，其允許這些細胞侵襲性生長以便在胚胎中產(chǎn)生新組織或在成人中再生受損傷的組織。然而，認為癌癥干細胞劫持了正常干細胞表達MET的能力，因此成為癌癥持續(xù)和擴散到身體中的其它部位的原因。原癌基因MET產(chǎn)物是肝細胞生長因子受體并且編碼酪氨酸_激酶活性。初級單鏈前體蛋白質(zhì)被翻譯后分解以產(chǎn)生α和β亞基，其被二硫鍵連接以形成成熟的受體。MET基因的多種突變與乳頭狀腎癌相關(guān)。抗-c-Met抗體是已知的，例如，從 US 5,686, 292, US 7，476，724，W02004/072117， WO 2004/108766, WO 2005/016382, WO 2005/063816, W02006/015371, WO 2006/104911, WO 2007/126799 或 WO 2009/007427 中得知。C-Met結(jié)合肽是已知的，例如，從Matzke，Α.，等，癌癥研究(Cancer Res) 65 (14) (2005)6105-10.和 Tam，Eric，M.，等，分子生物學(xué)雜志(J. Mol. Biol.) 385 (2009) 79-90 中得知。多特異性抗體最近已經(jīng)開發(fā)了廣泛多樣的重組抗體形式，例如通過融合例如IgG抗體形式和單鏈結(jié)構(gòu)域的四價雙特異性抗體(參見例如Coloma，Μ. J.，等，自然生物技術(shù)(Nature Biotech) 15(1997) 159-163 ；WO 2001/077342 和 Morrison，S. L.等，自然生物技術(shù)(Nature Biotech)25 (2007) 1233-1234)。此外，開發(fā)了能夠結(jié)合兩種以上抗原的若干其他新型形式，其中抗體核心結(jié)構(gòu)(IgA，IgD, IgE, IgG或IgM)不再保持諸如雙抗體(diabodies)、三鏈抗體或四鏈抗體(tetrabodies)、微型抗體(minibodies)、若干單鏈形式(scFv，雙-scFv) (HoiIiger P，等，自然生物技術(shù)(Nature Biotech) 23 (2005) 1126-1136 ；Fischer, N.，和 Leger, 0.，病理學(xué)(Pathobiology) 74 (2007) 3-14 ；Shen J.，等，免疫學(xué)方法雜志(Journalof Immunological Methods) 318 (2007) 65-74 ；ffu, C.等，自然生物技術(shù)(Nature Biotech.)25 (2007) 1290-1297)。所有這樣的形式使用接頭將抗體核心(IgA，IgD, IgE, IgG或IgM)與其他結(jié)合蛋白(例如scFv)融合或融合例如兩個Fab片段或scFv(Fischer N. , Leger 0.，病理學(xué) (Pathobiology) 74 (2007) 3-14)。人們一直希望可以通過保持與天然存在的抗體的高度相似性而保持效應(yīng)子功能，諸如例如通過Fc受體結(jié)合介導(dǎo)的補體依賴性細胞毒性(CDC)或抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。在WO 2007/024715中，報道了雙重可變的結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白作為改造的多價和多特異性結(jié)合蛋白。在US 6，897，044中報道了用于生物活性的抗體二聚體的制備方法。在 US 7，129，330中報道了具有至少四個彼此通過肽接頭連接的可變結(jié)構(gòu)域的多價Fv抗體構(gòu)建體。在US 2005/0079170中報道了二聚體和多聚體抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)。在US 6，511，663中報道了三價或四價單特異性抗原結(jié)合蛋白，其包含通過連接結(jié)構(gòu)彼此共價結(jié)合的三個或四個Fab片段，所述蛋白不是天然免疫球蛋白。在WO 2006/020258中報道了這樣的四價雙特異性抗體，其可以在原核細胞和真核細胞中有效表達，并且用于治療和診斷方法中。在US 2005/0163782中報道了在包含兩種類型的多肽二聚體的混合物中，將通過至少一個鏈間二硫鍵連接的二聚體與不通過至少一個鏈間二硫鍵連接的二聚體分離或優(yōu)先合成通過至少一個鏈間二硫鍵連接的二聚體的方法。在US 5，959，083中報道了雙特異性四價受體。在 WO 2001/077342中報道了具有三個或多個功能性抗原結(jié)合位點的改造的抗體。在WO 1997/001580中報道了多特異性和多價抗原結(jié)合多肽。WO 1992/004053報道了均綴合物(homoconjugate)，其典型地由結(jié)合相同抗原決定簇的IgG類的單克隆抗體制備，其通過合成交聯(lián)共價連接。在WO 1991/06305中報道了對于抗原具有高抗體親抗原性的低聚單克隆抗體，其中分泌典型地是IgG類的低聚物，其具有締合在一起的兩種以上的免疫球蛋白單體，以形成四價或六價IgG分子。在US 6，350，860中報道了綿羊來源的抗體和改造的抗體構(gòu)建體，其可以用于治療其中Y干擾素活性是致病性的疾病。在US 2005/0100543中，報道了可靶向的構(gòu)建體，所述構(gòu)建體是雙特異性抗體的多價載體，即可靶向的構(gòu)建體的每個分子可以作為兩種以上雙特異性抗體的載體。在WO 1995/009917中報道遺傳改造的雙特異性四價抗體。在WO 2007/109254中，報道了由穩(wěn)定的scFv組成或包含穩(wěn)定的scFv的穩(wěn)定的結(jié)合分子。US 2007/0274985涉及包含單鏈Fab(ScFab)片段的抗體形式。WO 2008/140493涉及抗-ErbB家族成員抗體和雙特異性抗體，其包含一個或多個抗-ErbB家族成員抗體。US 2004/0071696涉及結(jié)合ErbB蛋白質(zhì)家族的成員的雙特異性抗體分子。W02009111707 (Al)涉及使用 Met 和 HER 拮抗劑的聯(lián)合療法。W02009111691 (A2A3) 涉及使用Met和EGFR拮抗劑的聯(lián)合療法。W02004072117涉及誘導(dǎo)c_Met下調(diào)/內(nèi)在化的c_Met抗體，以及它們特別與 ErbB-I作為第二抗原在雙特異性抗體中的潛在用途。發(fā)明概述本發(fā)明第一方面是特異性結(jié)合人ErbB-I和人c_Met的雙特異性抗體，其包含特異性結(jié)合人ErbB-I的第一抗原結(jié)合位點和特異性結(jié)合人c-Met的第二抗原結(jié)合位點，其特征在于，當(dāng)在流式細胞術(shù)測定中在0VCAR-8細胞上2小時后測量時，與不存在所述雙特異性抗體時c-Met的內(nèi)在化相比較，所述雙特異性抗體顯示不超過15%的c-Met的內(nèi)在化。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述抗體是特異性結(jié)合人ErbB-I和人c_Met的二價或三價、雙特異性抗體，其包含特異性結(jié)合人ErbB-I的一個或兩個抗原結(jié)合位點和特異性結(jié)合人c-Met的一個抗原結(jié)合位點。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述抗體是特異性結(jié)合人ErbB-I和人c_Met的三價、雙特異性抗體，其包含特異性結(jié)合人ErbB-I的兩個抗原結(jié)合位點和特異性結(jié)合人 c-Met的第三抗原結(jié)合位點。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述抗體是特異性結(jié)合人ErbB-I和人c_Met的二價、雙特異性抗體，其包含特異性結(jié)合人ErbB-I的一個抗原結(jié)合位點和特異性結(jié)合人 c-Met的一個抗原結(jié)合位點。本發(fā)明的一個方面是特異性結(jié)合人ErbB-I和人c_Met的雙特異性抗體，其包含特異性結(jié)合人ErbB-I的第一抗原結(jié)合位點和特異性結(jié)合人c-Met的第二抗原結(jié)合位點，其特征在于，i)所述第一抗原結(jié)合位點在重鏈可變結(jié)構(gòu)域中包含SEQ ID NO 17的⑶R3H區(qū)， SEQ ID NO :18的⑶R2H區(qū)和SEQ ID NO :19的⑶RlH區(qū)，和在輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中包含SEQ ID NO 20 的 CDR3L 區(qū)，SEQ ID NO 21 的 CDR2L 區(qū)和 SEQ ID NO 22 的 CDRlL 區(qū)；禾口所述第二抗原結(jié)合位點在重鏈可變結(jié)構(gòu)域中包含SEQ ID NO 29的⑶R3H區(qū)，SEQ ID NO :30的CDR2H區(qū)和SEQ ID NO :31的CDRlH區(qū)，和在輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中包含SEQ ID NO: 32 的 CDR3L 區(qū)，SEQ ID NO 33 的 CDR2L 區(qū)和 SEQ ID NO 34 的 CDRlL 區(qū)；ii)所述第一抗原結(jié)合位點在重鏈可變結(jié)構(gòu)域中包含SEQ ID NO 23的⑶R3H區(qū)， SEQ ID NO :24的⑶R2H區(qū)和SEQ ID NO :25的⑶RlH區(qū)，和在輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中包含SEQ ID NO 26 的 CDR3L 區(qū)，SEQ ID NO 27 的 CDR2L 區(qū)和 SEQ ID NO 28 的 CDRlL 區(qū)；禾口所述第二抗原結(jié)合位點在重鏈可變結(jié)構(gòu)域中包含SEQ ID NO 29的⑶R3H區(qū)，SEQ ID NO :30的CDR2H區(qū)和SEQ ID NO :31的CDRlH區(qū)，和在輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中包含SEQ ID NO: 32 的 CDR3L 區(qū)，SEQ ID NO 33 的 CDR2L 區(qū)和 SEQ ID NO 34 的 CDRlL 區(qū)。所述雙特異性抗體優(yōu)選地特征在于，i)所述特異性結(jié)合ErbB-I的第一抗原結(jié)合位點包含作為重鏈可變結(jié)構(gòu)域的序列 SEQ ID NO 1和作為輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的序列SEQ ID NO 2 ；和所述特異性結(jié)合c-Met的第二抗原結(jié)合位點包含作為重鏈可變結(jié)構(gòu)域的序列SEQ ID NO 5和作為輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的序列SEQ ID NO 6 ；或ii)所述特異性結(jié)合ErbB-I的第一抗原結(jié)合位點包含作為重鏈可變結(jié)構(gòu)域的序列SEQ ID NO 3和作為輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的序列SEQ ID NO 4 ；和所述特異性結(jié)合c-Met的第二抗原結(jié)合位點包含作為重鏈可變結(jié)構(gòu)域的序列SEQ ID NO 5和作為輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的序列SEQ ID NO :6。本發(fā)明另一方面是特征在于包含IgGl或IgG3亞類的恒定區(qū)的本發(fā)明所述的雙特異性抗體。在一個實施方案中，本發(fā)明所述的雙特異性抗體特征在于所述抗體在Asn297用糖鏈糖基化，其中所述糖鏈內(nèi)巖藻糖的量為65 %以下。
本發(fā)明另一方面是編碼所述雙特異性抗體的鏈的核酸分子。本發(fā)明的其它方面是包含所述雙特異性抗體的藥物組合物，所述組合物用于治療癌癥，所述雙特異性抗體用于制備用于治療癌癥的藥物的應(yīng)用，治療患有癌癥的患者的方法，所述方法通過給需要所述治療的患者施用所述雙特異性抗體而進行。由于EGFR和c_Met是導(dǎo)致磷酸化和激活下游信號傳導(dǎo)級聯(lián)的受體交叉對話(cross-talk)的一部分，并且由于腫瘤組織細胞表面上的這些受體的上調(diào) (Bachleitner-Hofmann 等，分子癌癥治療(Mol. Cane. Ther.) (2009)3499-3508)，本發(fā)明所述的雙特異性<ErbB-l-c-Met>抗體具有有價值的特性，如抗腫瘤功效和癌細胞抑制。本發(fā)明所述的抗體表現(xiàn)出高度有價值的特性，如例如，尤其是表達這兩種受體 ErbBl和c-Met的癌細胞的生長抑制，給患有癌癥的患者帶來益處的抗腫瘤功效。本發(fā)明所述的雙特異性<ErbBl-c-Met>抗體在與它們的親本單特異性、二價<c_Met>抗體相比較時， 在表達這兩種受體ErbBl和c-Met的癌細胞上，其表現(xiàn)出減少的c-Met受體的內(nèi)在化。發(fā)明詳述本發(fā)明的第一方面是特異性結(jié)合人ErbB-I和人c_Met的雙特異性抗體，其包含特異性結(jié)合人ErbB-I的第一抗原結(jié)合位點和特異性結(jié)合人c-Met的第二抗原結(jié)合位點，其特征在于，當(dāng)在流式細胞術(shù)測定中在0VCAR-8細胞上2小時后測量時，與不存在所述雙特異性抗體時c-Met的內(nèi)在化相比較，所述雙特異性抗體顯示不超過15%的c-Met的內(nèi)在化。因此，本發(fā)明涉及特異性結(jié)合人ErbB-I和人c_Met的雙特異性抗體，其包含特異性結(jié)合人ErbB-I的第一抗原結(jié)合位點和特異性結(jié)合人c-Met的第二抗原結(jié)合位點，其中通過流式細胞術(shù)測定法測量，在0VCAR-8細胞-抗體溫育1小時后測量時，與不存在抗體時在 0VCAR-8細胞上c-Met的內(nèi)在化相比，所述雙特異性抗體引起不超過15%的0VCAR-8細胞上c-Met的內(nèi)在化的增加。在一個實施方案中，所述特異性結(jié)合人ErbB-I和人c_Met的雙特異性抗體包含特異性結(jié)合人ErbB-I的第一抗原結(jié)合位點和特異性結(jié)合人c-Met的第二抗原結(jié)合位點，其特征在于，當(dāng)在流式細胞術(shù)測定中在0VCAR-8細胞上2小時后測量時，與不存在所述雙特異性抗體時c-Met的內(nèi)在化相比較，所述雙特異性抗體顯示不超過10%的c-Met的內(nèi)在化。在一個實施方案中，所述特異性結(jié)合人ErbB-I和人c_Met的雙特異性抗體包含特異性結(jié)合人ErbB-I的第一抗原結(jié)合位點和特異性結(jié)合人c-Met的第二抗原結(jié)合位點，其特征在于，當(dāng)在流式細胞術(shù)測定中在0VCAR-8細胞上2小時后測量時，與不存在所述雙特異性抗體時c-Met的內(nèi)在化相比較，所述雙特異性抗體顯示不超過7%的c-Met的內(nèi)在化。在一個實施方案中，所述特異性結(jié)合人ErbB-I和人c_Met的雙特異性抗體包含特異性結(jié)合人ErbB-I的第一抗原結(jié)合位點和特異性結(jié)合人c-Met的第二抗原結(jié)合位點，其特征在于，當(dāng)在流式細胞術(shù)測定中在0VCAR-8細胞上2小時后測量時，與不存在所述雙特異性抗體時c-Met的內(nèi)在化相比較，所述雙特異性抗體顯示不超過5%的c-Met的內(nèi)在化。術(shù)語“c-Met的內(nèi)在化”指與不存在抗體時c-Met的內(nèi)在化相比較，在0VCAR-8 細胞(NCI細胞系命名；購自NCI (國家癌癥研究所(National Cancer Institute)) 0VCAR-8-NCI ；Schilder, R.J.等，國際癌癥雜志(Int. J. Cancer) 45 (1990) 416-422 ； lkediobi，0. N.等，分子癌癥治療(Mol. Cancer. Ther.) 5 (2006) 2606-2012 ；Lorenzi，P. L.， 等，分子癌癥治療(Mol. Cancer Ther.) 8 (2009) 713-724)上的抗體-誘導(dǎo)的c_Met受體內(nèi)
8在化。c-Met受體的這種內(nèi)在化由本發(fā)明所述的雙特異性抗體誘導(dǎo)，并且如在實施例9中所述，在流式細胞術(shù)測定法(FACS)中2小時后測量。與不存在抗體時c-Met的內(nèi)在化相比較，本發(fā)明所述的雙特異性抗體在抗體暴露2小時后表現(xiàn)出在0VCAR-8細胞上不超過15% 的c-Met內(nèi)在化。在一個實施方案中，所述抗體表現(xiàn)出不超過10%的c-Met內(nèi)在化。在一個實施方案中，所述抗體表現(xiàn)出不超過7%的c-Met內(nèi)在化。在一個實施方案中，所述抗體表現(xiàn)出不超過5%的c-Met內(nèi)在化。本發(fā)明的另一方面是特異性結(jié)合人ErbB-I和人c_Met的雙特異性抗體，其包含特異性結(jié)合人ErbB-I的第一抗原結(jié)合位點和特異性結(jié)合人c-Met的第二抗原結(jié)合位點，其特征在于，與由(相對應(yīng)的)單特異性、二價親本c-Met抗體誘導(dǎo)的c-Met內(nèi)在化相比，當(dāng)在流式細胞術(shù)測定中在0VCAR-8細胞上2小時后測量時，所述雙特異性抗體將c-Met內(nèi)在化減少50%以上(在一個實施方案中，減少60%以上；在另一個實施方案中，減少70%以上， 在一個實施方案中，減少80%以上)。c-Met內(nèi)在化的減少計算如下(使用在流式細胞術(shù)測定中在0VCAR-8細胞上2小時后測量的％內(nèi)在化值，而將低于0的％內(nèi)在化值設(shè)定為0%內(nèi)在化，例如，對于BsABOl (將-14%內(nèi)在化設(shè)定為0% )) IOOx (由單特異性、二價親本c-Met 抗體誘導(dǎo)的％ c-Met內(nèi)在化-由雙特異性ErbB-1/cMet抗體誘導(dǎo)的％ c-Met內(nèi)在化)/由單特異性、二價親本c-Met抗體誘導(dǎo)的％ c-Met內(nèi)在化。例如雙特異性ErbB-1/cMet抗體 BsABOl表現(xiàn)出-14%的c-Met內(nèi)在化，將其設(shè)定為0%，并且單特異性、二價親本c-Met抗體Mab 5D5表現(xiàn)出44%的c-Met內(nèi)在化。因此，雙特異性ErbB-1/cMet抗體BsABOl表現(xiàn)出IOOx (40-0)/40%= 100%的c-Met內(nèi)在化減少(參見在實施例9中在流式細胞術(shù)測定中在0VCAR-8細胞上2小時后測量的內(nèi)在化值)。用于本文時，“抗體”指包含抗原結(jié)合位點的結(jié)合蛋白。術(shù)語“結(jié)合位點”或“抗原結(jié)合位點”用于本文時，指配體實際上結(jié)合的抗體分子的區(qū)域，所述位點源自抗體。術(shù)語“抗原結(jié)合位點”包含抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和/或抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)或VH/VL配對，并可源自完整抗體或抗體片段如單鏈Fv、VH結(jié)構(gòu)域和/或VL結(jié)構(gòu)域、Fab或(Fab) 2。在本發(fā)明的一個實施方案中，每個抗原結(jié)合位點包含抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和/或抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)，和優(yōu)選地由抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)和抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)組成的配對形成。對抗體來源的抗原結(jié)合位點進一步看來，例如，Matzke, A.，等，癌癥研究(Cancer Res.) 65 (14) (2005)6105-10中所述的結(jié)合肽也可以特異性結(jié)合抗原(例如，c_Met)。因此， 本發(fā)明的另一方面是特異性結(jié)合人ErbB-I和人c-Met的雙特異性結(jié)合分子，其包含特異性結(jié)合人ErbB-I的抗原結(jié)合位點和特異性結(jié)合人c-Met的結(jié)合肽。因此，本發(fā)明的另一方面是特異性結(jié)合人ErbB-I和人c-Met的雙特異性結(jié)合分子，其包含特異性結(jié)合人c_Met的抗原結(jié)合位點和特異性結(jié)合人ErbB-I的結(jié)合肽。Erb-Bl (也已知為ERBBl，人表皮生長因子受體，EGFR，HER-I或禽類成紅細胞白血病病毒(v-erb-b)癌基因同系物；SEQ ID NO :16)，是由c_erbB原癌基因編碼的170kDa的跨膜受體，并且顯示固有的酪氨酸激酶活性(Modjtahedi，H.，等， 英國癌癥雜志(Br. J. Cancer) 73 (1996) 228-235 ；Herbst, R. S.和 Shin, D. Μ.，癌癥 (Cancer) 94 (2002) 1593-1611)。還存在EGFR的同種型和變體(例如，可變RNA轉(zhuǎn)錄物， 截短形式，多態(tài)性等)，包括但不限于Swissprot數(shù)據(jù)庫登錄號P00533-1，P00533-2,P00533-3，和P00533-4確定的那些。已知EGFR結(jié)合包括以下各項的配體表皮生長因子 (EGF)，轉(zhuǎn)化生長α)，雙調(diào)蛋白，肝素結(jié)合EGF(hb-EGF)，β細胞素，因子α (TGf-和表皮調(diào)節(jié)素(Herbst, R. S.和 Shin, D. Μ.，癌癥(Cancer) 94 (2002) 1593-1611 ；Mendelsohn, J.，和 Baselga，J.，癌基因(Oncogene) 19 (2000) 6550-6565)。EGFR經(jīng)由酪氨酸激酶介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)許多細胞過程，包括但不限于激活控制細胞增殖、分化、細胞存活、程序性細胞死亡、血管發(fā)生、有絲分裂發(fā)生和轉(zhuǎn)移的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(Atalay，G.，等，腫瘤學(xué)年刊(Arm. Oncology) 14(2003) 1346-1363 ；Tsao, Α. S.和 Herbst，R. S.信號(Signal)4(2003)4-9 ； Herbst, R. S.，和 Shin，D. Μ.，癌癥(Cancer) 94 (2002) 1593-1611 ；Modjtahedi, H.，等，英國癌癥雜志(Br. J. Cancer) 73 (1996) 228-235)。特異性結(jié)合人ErbB-I的抗原結(jié)合位點，且特別是重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和/或抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)可以來源于a)已知的抗-ErbB-I抗體，如例如IMC-C225 (西妥昔單抗，Erbitux ; ImClone) (Herbst, R. S.，和 Shin，D. Μ.，癌癥(Cancer) 94 (2002) 1593-1611), ABX-EGF(Abgenix) (Yang, X. D.，等，腫瘤學(xué) / 血液學(xué)評論綜述(Crit. Rev. Oncol. / Hematol.) 38 (2001) 17-23)，人源化 ICR62 (W0 2006/082515)或如例如在 US 5,891,996， US5, 558，864中所述的其它抗體；或b)通過使用特別是人ErbB-I蛋白或核酸或其片段的從頭(de novo)免疫法或通過噬菌體展示獲得的新的抗-ErbB-I抗體。MET(間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)變因子)是一種原癌基因，其編碼蛋白質(zhì)MET，(也已知為c-Met ；肝細胞生長因子受體HGFR ；HGF受體；分散因子受體；SF受體；SEQ ID NO 15) (Dean, Μ.,等，自然(Nature) 318 (1985) 385-8 ;Chan，Α· Μ·，等，癌基因 (Oncogene) 1 (1987) 229-33 ；Bottaro, D. P.，等，科學(xué)(Science) 251 (1991) 802-4 ；Naldini, L.，等，EMBO 雜志(ΕΜΒ0 J.) 10 (1991) 2867-78 ；Maulik, G.，等，細胞因子生長因子綜述 (Cytokine Growth Factor Rev.) 13 (2002) 41-59)。MET 是胚胎發(fā)育和傷口愈合必需的膜受體。肝細胞生長因子(HGF)是MET受體僅有的已知配體。MET被上皮來源的細胞正常表達， 而HGF的表達局限于間充質(zhì)來源的細胞。經(jīng)HGF刺激，MET誘導(dǎo)數(shù)種生物學(xué)反應(yīng)，它們共同產(chǎn)生已知為侵襲性生長的程序。癌癥中異常的MET活化與差的預(yù)后相關(guān)，在此異?；钚缘?MET引發(fā)腫瘤生長，形成向腫瘤供應(yīng)營養(yǎng)素的新血管(血管生成)，以及癌癥擴散到其它器官(轉(zhuǎn)移)。MET在許多類型的人惡性腫瘤中下調(diào)，所述人惡性腫瘤包括腎癌、肝癌、胃癌、 乳腺癌和腦癌。通常，僅有干細胞和祖細胞表達MET，其允許這些細胞侵襲性生長以便在胚胎中產(chǎn)生新組織或在成人中再生受損傷的組織。然而，認為癌癥干細胞劫持了正常干細胞表達MET的能力，因此成為癌癥持續(xù)和擴散到身體中的其它部位的原因。特異性結(jié)合人c-Met的抗原結(jié)合位點，且特別是重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和/或抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)，可以來源于a)已知的抗-c-Met抗體，如例如在US 5，686，292， US 7,476,724， WO 2004/072117， WO 2004/108766， WO 2005/016382， WO 2005/063816， WO 2006/015371，WO 2006/104911, WO 2007/126799，或 WO 2009/007427 中所述的抗體，b)通過使用特別是人抗-c-Met蛋白或核酸或其片段的從頭免疫法或通過噬菌體展示獲得的新的抗-c-Met抗體。本發(fā)明的另一方面是特異性結(jié)合人ErbB-I和人c_Met的雙特異性抗體，其包含特異性結(jié)合人ErbB-I的第一抗原結(jié)合位點和特異性結(jié)合人c-Met的第二抗原結(jié)合位點，其特征在于，
i)所述特異性結(jié)合ErbB-I的第一抗原結(jié)合位點包含作為重鏈可變結(jié)構(gòu)域的序列 SEQ ID NO 1和作為輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的序列SEQ ID NO 2 ；和所述特異性結(jié)合c-Met的第二抗原結(jié)合位點包含作為重鏈可變結(jié)構(gòu)域的序列SEQ ID NO 5和作為輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的序列SEQ ID NO 6 ；或ii)所述特異性結(jié)合ErbB-I的第一抗原結(jié)合位點包含作為重鏈可變結(jié)構(gòu)域的序列SEQ ID NO 3和作為輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的序列SEQ ID NO 4 ；和所述特異性結(jié)合c-Met的第二抗原結(jié)合位點包含作為重鏈可變結(jié)構(gòu)域的序列SEQ ID NO 5和作為輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的序列SEQ ID NO :6?？贵w特異性指抗體對于抗原特定表位的選擇性識別。例如，天然抗體是單特異性的。根據(jù)本發(fā)明所述的“雙特異性抗體”是具有兩種不同的抗原結(jié)合特異性的抗體。如果抗體具有超過一種的特異性，識別的表位可以與單抗原或一種以上的抗原相關(guān)。本發(fā)明的抗體特異于兩種不同的抗原，即作為第一抗原的ErbB-I和作為第二抗原的c-Met。用于本文時，術(shù)語“單特異性”抗體指具有一個或多個分別結(jié)合于相同抗原的相同表位的結(jié)合位點的抗體。術(shù)語“價”在本申請中使用時指在抗體分子上存在的結(jié)合位點的具體數(shù)量。因此， 術(shù)語“二價”、“四價”、和“六價”分別指在抗體分子上存在兩個結(jié)合位點、四個結(jié)合位點、和六個結(jié)合位點。本發(fā)明所述的雙特異性抗體是至少“二價的”，并且可以是“三價”或“多價” 的(例如(“四價”或六價)的)。本發(fā)明的抗體的抗原結(jié)合位點可包含六個互補性決定區(qū)(CDRs)，其在不同程度上有助于結(jié)合位點對于抗原的親和力。存在三個重鏈可變結(jié)構(gòu)域CDRs (CDRH1，CDRH2和 ⑶RH3)和三個輕鏈可變結(jié)構(gòu)域⑶Rs (⑶RL1，⑶RL2和⑶RL3)。⑶R和構(gòu)架區(qū)(FRs)的程度通過與氨基酸序列的匯編數(shù)據(jù)庫進行比較來確定，所述氨基酸序列中那些區(qū)域根據(jù)序列之間的可變性來確定。此外，還包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的是包含更少CDRs的功能性抗原結(jié)合位點(即，在結(jié)合特異性由三個、四個或五個CDRs決定的情形中)。例如，少于6個CDRs的完整組對于結(jié)合可能是足夠的。在一些情形中，VH或VL結(jié)構(gòu)域是足夠的。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的抗體還包含一個或多個人來源的免疫球蛋白種類的免疫球蛋白恒定區(qū)。免疫球蛋白種類包括IgG，IgM, IgA, IgDjP IgE同種型，并且在IgG 和IgA的情形中，包括它們的亞型。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的抗體具有IgG型抗體的恒定結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，但是具有四個抗原結(jié)合位點。這是通過下述來實現(xiàn)，例如通過將一個(或兩個)特異性結(jié)合c-Met的完整抗原結(jié)合位點(例如，單鏈Fab片段或單鏈Fv)與特異性結(jié)合ErbB-I的完整抗體的N-端或C-端重鏈或輕鏈進行連接，產(chǎn)生三價雙特異性抗體(或四價雙特異性抗體)。備選地，如例如，在EP 07024867. 9，EP 07024864. 6，EP 07024865. 3 或 Ridgway，J. B.，蛋白質(zhì)工程(Protein Eng.) 9 (1996) 617-621 ；WO 96/027011 ；Merchant, A.M.，等，自然生物技術(shù)(Nature Biotech) 16 (1998) 677-681 ；Atwel 1, S.，等，分子生物學(xué)雜志(J. Mol. Biol.) 270 (1997) 26-35 和 EP 1870459A1 中所述，可以使用針對人 ErbB-I 和人 c-Met的包含免疫球蛋白恒定區(qū)的IgG樣雙特異性、二價抗體。術(shù)語“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”用于本文中時，指單一氨基酸組成的抗體分子制劑。術(shù)語“嵌合抗體”指這樣的抗體，其包括來自一種來源或物種的可變區(qū)，即結(jié)合區(qū)，以及源自不同來源或物種的恒定區(qū)的至少一部分，其通常通過重組DNA技術(shù)進行制備。優(yōu)選包括鼠可變區(qū)和人恒定區(qū)的嵌合抗體。本發(fā)明涵蓋的“嵌合抗體”的其它優(yōu)選形式是這樣的那些，其中恒定區(qū)已經(jīng)被從初始抗體的恒定區(qū)開始進行修飾或改變以產(chǎn)生本發(fā)明所述的特性，特別是關(guān)于Clq結(jié)合和/或Fc受體(FcR)結(jié)合的特性。也將這種“嵌合”抗體稱作“類別轉(zhuǎn)換抗體”。嵌合抗體是被表達的免疫球蛋白基因的產(chǎn)物，該基因包括編碼免疫球蛋白可變區(qū)的DNA區(qū)段和編碼免疫球蛋白恒定區(qū)的DNA區(qū)段。制備嵌合抗體的方法包括目前在本領(lǐng)域眾所周知的常規(guī)重組DNA和基因轉(zhuǎn)染技術(shù)。見，例如，Morrison，S. L.，等，美國國家科學(xué)院學(xué)報(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 81 (1984) 6851-6855 ；US 5，202，238 和 US5, 204，244。術(shù)語“人源化抗體”指這樣的抗體，其中的構(gòu)架或“互補性決定區(qū)”(CDR)已經(jīng)被修飾為包括與親本免疫球蛋白相比特異性不同的免疫球蛋白的CDR。在一個優(yōu)選實施方案中， 將鼠⑶R移植到人抗體的構(gòu)架區(qū)以制備“人源化抗體”。見，例如，Riechmann, L.，等，自然 (Nature) 332 (1988) 323-327 ；和 Neuberger，Μ. S.，等，自然(Nature) 314 (1985) 268-270。特別優(yōu)選的CDRs對應(yīng)于識別以上指出的關(guān)于嵌合抗體的抗原的那些代表性序列。本發(fā)明涵蓋的“人源化抗體”的其它形式是這樣的那些，其中恒定區(qū)已經(jīng)另外被從初始抗體的恒定區(qū)開始進行修飾或改變以產(chǎn)生本發(fā)明所述的特性，特別是關(guān)于Clq結(jié)合和/或Fc受體(FcR) 結(jié)合的特性。用于本文時，術(shù)語“人抗體”意欲包括具有源自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體。人抗體是現(xiàn)有技術(shù)中公知的(van Dijk，M.A.，和van de Winkel, J. G., 當(dāng)前化學(xué)生物學(xué)觀點(Curr. Opin. Chem. Biol.) 5 (2001) 368-374)。人抗體還可以在轉(zhuǎn)基因動物(例如小鼠)中產(chǎn)生，所述轉(zhuǎn)基因動物在免疫時能夠在缺乏內(nèi)源免疫球蛋白生成的條件下產(chǎn)生人抗體的全部所有組成成分或選擇部分(selection)。在所述種系突變小鼠中轉(zhuǎn)移人種系免疫球蛋白基因陣列將導(dǎo)致在抗原攻擊時產(chǎn)生人抗體(見，例如JakobovitsA.， 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (美國國家科學(xué)院學(xué)報)90 (1993) 2551-2555 Jakobovits, A.，等，Nature (自然)362 (1993) 255-258 ；Bruggemann, M.，等，Year Immunol.(免疫學(xué)年度)7 (1993) 33-40)。人抗體還可以在噬菌體展示文庫中產(chǎn)生(Hoogenboom，H. R.，和 Winter, G. J. Mol. Biol.(分子生物學(xué)雜志)227 (1992) 381-388 ；Marks, J. D.，等，J. Mol. Biol.(分子生物學(xué)雜志)222 (1991) 581-597)。Cole, S. P. C.，等和 Boerner, P.，等的技術(shù)也可以用于制備人單克隆抗體(Cole，S. P. C.，等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (單克隆抗體和癌癥治療)，Liss，A. L.，(1985) 77-96 ；和 Boerner，P.，等， J. Immunol.(免疫學(xué)雜志)147 (1991) 86-95)。如已經(jīng)對本發(fā)明所述的嵌合和人源化抗體所提及地，術(shù)語“人抗體”用于本文中時還包括這樣的抗體，其在恒定區(qū)內(nèi)進行修飾以產(chǎn)生本發(fā)明所述的特性，特別是關(guān)于Clq結(jié)合和/或FcR結(jié)合的特性，例如通過“類別轉(zhuǎn)換”即改變或突變Fc部分(例如由IgGl到IgG4和/或IgGl/IgG4突變)進行。用于本文時，術(shù)語“重組人抗體”意欲包括通過重組方法制備、表達、產(chǎn)生或分離的所有人抗體，諸如分離自宿主細胞，諸如NSO或CHO細胞的抗體或分離自人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因動物(例如小鼠)的抗體，或利用轉(zhuǎn)染到宿主細胞中的重組表達載體表達的抗體。 這種重組人抗體具有處于重排形式的可變區(qū)和恒定區(qū)。按照本發(fā)明的重組人抗體已經(jīng)經(jīng)歷了體內(nèi)體細胞高變。因此，重組抗體的VH和VL區(qū)域的氨基酸序列是這樣的序列，所述序列盡管源自并涉及人種系VH和VL序列，但在體內(nèi)可能不天然存在于人抗體種系所有組成成分中?！翱勺兘Y(jié)構(gòu)域”(輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域(VL)，重鏈的可變區(qū)(VH))用于本文中時，表示直接參與抗體與抗原結(jié)合的每對輕鏈和重鏈對。可變?nèi)溯p鏈和重鏈的結(jié)構(gòu)域具有相同的一般結(jié)構(gòu)且每個結(jié)構(gòu)域包括4個構(gòu)架(FR)區(qū)，所述構(gòu)架區(qū)的序列普遍保守，其通過3個“高變區(qū)”(或互補性決定區(qū)，⑶Rs)相連接。構(gòu)架區(qū)采用β-折疊構(gòu)象且⑶Rs可以形成連接 β-折疊結(jié)構(gòu)的環(huán)。每條鏈中的CDRs通過構(gòu)架區(qū)以其三維結(jié)構(gòu)保持并與來自另一條鏈的 CDRs 一起形成抗原結(jié)合位點?？贵w重鏈和輕鏈CDR3區(qū)在本發(fā)明所述的抗體的結(jié)合特異性 /親和力方面發(fā)揮特別重要的作用并因此提供本發(fā)明的另一個目的。用于本文時，術(shù)語“高變區(qū)”或“抗體的抗原結(jié)合部分或抗原結(jié)合位點”指抗體負責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。高變區(qū)包括來自“互補性決定區(qū)”或“CDRs”的氨基酸殘基?！皹?gòu)架”或“FR”區(qū)是除本文中定義的高變區(qū)殘基之外的那些可變結(jié)構(gòu)域區(qū)域。因此，抗體的輕鏈和重鏈從N端到C端包括結(jié)構(gòu)域FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。各條鏈上的CDRs 通過所述構(gòu)架氨基酸分開。特別地，重鏈的CDR3是最有助于抗原結(jié)合的區(qū)域。按照Kabat 等，免疫目的的蛋白質(zhì)序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest),第 5 版，公眾健康服務(wù)，全國衛(wèi)生研究所(Public Health Service, National Institutes of Health)，Bethesda, MD (1991))的標準定義確定 CDR 和 FR 區(qū)域。用于本文時，術(shù)語“結(jié)合”或“特異性結(jié)合”指在體外測定法中，優(yōu)選地在使用純化的野生型抗原的等離子共振測定(BIAcore，GE-Healthcare Uppsala，瑞典)中，抗體與抗原(人ErbB-I或人c-Met)的表位的結(jié)合。結(jié)合的親和力由術(shù)語ka(來自抗體/抗原復(fù)合物的抗體的締合的速率常數(shù))，kD (解離常數(shù))和KD(kD/ka)定義。結(jié)合或特異性結(jié)合意為 10_8mol/l以下，優(yōu)選地10_9M到10_13mol/l的結(jié)合親和力(Kd)。因此，本發(fā)明所述的雙特異性<ErbBl-C-Met>抗體特異性結(jié)合每種抗原，對于每種抗原其是特異性的，具有10_8mOl/l 以下，優(yōu)選地ΙΟ-、到10_13mOl/l的結(jié)合親和力(Kd)?？贵w與Fc γ RIII 的結(jié)合可以通過 BIAcore 測定法(GE-Healthcare，Uppsala，瑞典)進行研究。結(jié)合的親和力由術(shù)語ka(來自抗體/抗原復(fù)合物的抗體的締合的速率常數(shù))，kD (解離常數(shù))和Kd (kD/ka)定義。術(shù)語“表位”包括能夠特異性結(jié)合抗體的任何多肽決定簇。在某些實施方案中，表位決定簇包括分子的化學(xué)活性表面分組(groupings)，諸如氨基酸、糖側(cè)鏈、磷?；蚧酋；?，在某些實施方案中，可以具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征，和或特定的帶電特征。表位是被抗體結(jié)合的抗原區(qū)域。在某些實施方案中，當(dāng)抗體在蛋白和/或大分子的復(fù)雜混合物中優(yōu)選識別其靶抗原時，將該抗體稱為與抗原特異性結(jié)合。術(shù)語“恒定區(qū)”用于本申請時指除了可變區(qū)之外的抗體的結(jié)構(gòu)域的總和。恒定區(qū)不直接參與抗原的結(jié)合，但是顯示不同的效應(yīng)子功能。取決于它們重鏈的恒定區(qū)的氨基酸序列，抗體被分為下述類別IgA，IgD, IgE, IgG和IgM，并且這些中的一些可以被進一步分為亞類，如IgGl，IgG2，IgG3，和IgG4，IgAl和IgA2。對應(yīng)于不同種類的抗體的重鏈恒定區(qū)分別被稱為α、δ、ε、Y和μ?？梢栽谒?種抗體種類中發(fā)現(xiàn)的輕鏈恒定區(qū)被稱為 κ (kappa)和λ (lambda)。恒定區(qū)優(yōu)選地來自人來源。術(shù)語“來自人來源的恒定區(qū)”在本申請中使用時，指亞類IgGl，IgG2，IgG3，或IgG4的人抗體的恒定重鏈區(qū)和/或恒定輕鏈κ或λ區(qū)域。這樣的恒定區(qū)是現(xiàn)有技術(shù)中公知的并且例如由Kabat, Ε. Α.，描述(見，例如Johnson, G.和ffu, Τ. T.，核酸研究(Nucleic Acids Res.) 28 (2000) 214-218 ;Kabat，Ε. Α.，等，美國國家科學(xué)院學(xué)報(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)72(1975)2785-2788)。在一個實施方案中，本發(fā)明所述的雙特異性抗體包含IgGl或IgG3亞類(優(yōu)選 IgGl亞類)的恒定區(qū)，其優(yōu)選地來自人來源。在一個實施方案中，本發(fā)明所述的雙特異性抗體包含IgGl或IgG3亞類(優(yōu)選IgGl亞類)的Fc部分，其優(yōu)選地來自人來源。當(dāng)IgG4亞類的抗體顯示減少的Fc受體(Fe YRIIIa)結(jié)合時，其它IgG亞類的抗體顯示強烈的結(jié)合。然而，Pro238，Asp265，Asp270，Asn297(失去 Fc 糖)，Pro329，Leu234， Leu235，Gly236，Gly237, Ile253, Ser254, Iys288, Thr307, Gln311，Asn434，和 His435 是這樣的殘基，其如果改變的話，還提供減少的Fc受體結(jié)合(Shields，R. L.，等，生物化學(xué)雜志 (J. Biol. Chem.) 276 (2001) 6591-6604 ； Lund, J.，等，F(xiàn)ASEB J. 9(1995) 115-119 ；Morgan, Α.， 等，免疫學(xué)(Immunology) 86 (1995) 319-324 ；EP 0 307 434)。在一個實施方案中，本發(fā)明所述的抗體與IgGl抗體比較具有減少的FcR結(jié)合，并且所述全長親本抗體涉及IgG4亞類的FcR結(jié)合或具有突變S228，L234，L235和/或D265 的IgGl或IgG2亞類的FcR結(jié)合，和/或包含PVA236突變。在一個實施方案中，在全長親本抗體中的突變是S228P，L234A，L235A，L235E和/或PVA236。在另一個實施方案中，在全長親本抗體中的突變在IgG4中是S228P，在IgGl中是L234A和L235A?？贵w的恒定區(qū)直接參與ADCC(抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒作用)和CDC(補體依賴的細胞毒性)。補體激活(CDC)由補體因子Clq與大多數(shù)IgG抗體亞類的恒定區(qū)結(jié)合而起始。Clq與抗體的結(jié)合由在所謂的結(jié)合位點的定義的蛋白-蛋白相互作用所導(dǎo)致。這樣的恒定區(qū)結(jié)合位點在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的，并且例如由Lukas，Τ.，J.，等，免疫學(xué)雜志(J. Immunol.) 127 (1981) 2555-2560 ；Brunhouse, R.，和 Cebra, J.，J.，分子免疫學(xué) (Mol. Immunol.) 16(1979)907-917 ；Burton, D.，R.，等，自然(Nature) 288 (1980) 338-344 ； Thommesen, J. , E.，等，分子免疫學(xué)(Mol. Immunol.) 37 (2000) 995-1004 ；Idusogie, E.， E.，等，免疫學(xué)雜志(J. Immunol.) 164 (2000) 4178-4184 ；Hezareh, Μ.，等，病毒學(xué)雜志 (J. Virol.) 75 (2001) 12161-12168 ；Morgan, Α.，等，免疫學(xué)(Immunology) 86 (1995) 319-324 ； 和EP 0 307 434所描述。例如，所述恒定區(qū)結(jié)合位點特征在于氨基酸L234，L235，D270， N297, E318, K320, K322, P331，和 P329 (根據(jù) Kabat 的 EU 索引編號)。術(shù)語“抗體依賴性細胞毒作用(ADCC) ”指在存在效應(yīng)細胞時，由本發(fā)明所述的抗體裂解人靶細胞。ADCC優(yōu)選地通過用本發(fā)明所述的抗體在存在效應(yīng)細胞時處理表達ErB-I和 c-Met的細胞的制備物進行測量，所述效應(yīng)細胞如新鮮分離的PBMC或來自暗黃覆蓋層的純化的效應(yīng)細胞，如單核細胞或天然殺傷(NK)細胞或永久生長的NK細胞系。術(shù)語“補體依賴的細胞毒性(⑶C)，，指由補體因子Clq與大多數(shù)IgG抗體亞類的 Fc部分結(jié)合而起始的過程。Clq與抗體的結(jié)合由在所謂的結(jié)合位點的限定的蛋白_蛋白相互作用所導(dǎo)致。這些Fc部分結(jié)合位點是現(xiàn)有技術(shù)已知的(見上)。例如，這些Fc部分結(jié)合位點特征在于氨基酸 L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331，和 P329 (根據(jù) Kabat 的EU索引編號)。亞類IgGl，IgG2，和IgG3的抗體通常顯示包括Clq和C3結(jié)合的補體激活，而IgG4不激活補體系統(tǒng)并且不結(jié)合Clq和/或C3。
單克隆抗體的細胞介導(dǎo)的效應(yīng)子功能可以通過改造它們的寡糖成分而得以增強，如在 Umana, P.，等，自然生物技術(shù)(Nature Biotechnol.) 17(1999) 176-180， 和US 6，602，684中所述。IgGl型抗體是最常用的治療性抗體，其是在每個CH2結(jié)構(gòu)域的Asn297處具有保守的N-連接的糖基化位點的糖蛋白。與Asn297附著的兩個復(fù)合雙分支(biantermary)寡糖包埋在CH2結(jié)構(gòu)域之間，形成了與多肽主鏈的廣泛接觸，并且它們的存在對于抗體介導(dǎo)效應(yīng)子功能諸如抗體依賴性細胞毒作用(ADCC)是必要的(Lifely，Μ. R.，等，糖生物學(xué)(Glycobiology) 5 (1995) 813-822 ； Jefferis, R.,等，免疫學(xué)綜述(Immunol Rev.) 163 (1998) 59-76 ；Wright, Α.和 Morrison, S. L.，生物技術(shù)趨勢(Trends Biotechnol.) 15(1997)26-32)。Umana, P.， 等，自然生物技術(shù)(Nature Biotechnol.) 17 (1999) 176-180 和 WO 99/54342 顯示， β (1,4)-N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶III( “GnTIII”)，一種催化平分型(bisected)寡糖形成的糖基轉(zhuǎn)移酶，在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中的過量表達，顯著增加了抗體的體外ADCC活性。在Asn297糖的組成上的改變或其消除也影響Fc γ R和Clq的結(jié)合(Umana, P.，等，自然生物技術(shù)(Nature Biotechnol.) 17 (1999) 176-180 ；Davies, J.,等，生物技術(shù)生物工程(Biotechnol. Bioeng.) 74 (2001) 288-294 ；Mimura, Y.， 等，生物化學(xué)雜志(J. Biol. Chem.) 276 (2001) 45539-45547 ；Radaev, S.，等，生物化學(xué)雜志(J. Biol. Chem.) 276 (2001) 16478-16483 ；Shields, R. L.，等，生物化學(xué)雜志 (J. Biol. Chem.) 276 (2001) 6591-6604 ；Shields, R. L.，等，生物化學(xué)雜志(J.Biol. Chem.) 277 (2002) 26733-26740 ；Simmons, L. C.，等，免疫學(xué)方法雜志(J. Immunol. Methods)263(2002)133-147)。通過降低巖藻糖的量增強單克隆抗體的細胞介導(dǎo)的效應(yīng)子功能的方法例如記述在 WO 2005/018572, WO 2006/116260, WO 2006/114700, WO 2004/065540, WO 2005/011735， WO 2005/027966, WO 1997/028267， US 2006/0134709, US 2005/0054048, US 2005/0152894, WO 2003/035835, WO 2000/061739, Niwa, R.，等，免疫方法雜志 (J. Immunol. Methods) 306 (2005) 151-160 ；Shinkawa,T.，等，生物化學(xué)雜志(J Biol Chem)， 278(2003)3466-3473 ；WO 03/055993 或 US 2005/0249722 中。在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明所述的雙特異性抗體是在Asn297處用糖鏈糖基化的(IgGl或IgG3亞類)，其中在所述糖鏈中的巖藻糖的量是65%以下(根據(jù)Kabat 的編號)。在另一個實施方案中，巖藻糖在所述糖鏈中的量在5% -65%，優(yōu)選地20%-40%o 根據(jù)本發(fā)明所述的“Asn297”意為在Fc區(qū)域中位于約位置297的氨基酸天冬酰胺?；诳贵w的微小序列變化，Asn297也可以在定位在位置297上游或下游的一些氨基酸上(通常不超過士3個氨基酸)，即在位置294-300之間。人IgGl或IgG3在Asn297發(fā)生糖基化，該糖基化作為核心巖藻糖基化的雙分支復(fù)合寡糖糖基化，末端為多至兩個Gal殘基。IgGl或IgG3亞類的人恒定重鏈區(qū)由 Kabat, Ε· A. ， ·， 貞目的胃白；^歹Ij (Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第5版.公眾健康服務(wù)(Public Health Service)，全國衛(wèi)生研究所 (National Institutes of Health), Bethesda, MD. (1991),禾口由 Bruggemann, Μ.,等， 實驗醫(yī)學(xué)雜志(J. Exp. Med.) 166 (1987) 1351-1361 ；Love, Τ. W.，等，酶學(xué)方法(Methods Enzymol.) 178 (1989) 515-527中詳細報道。根據(jù)末端Gal殘基的量，將這些結(jié)構(gòu)稱為G0，Gl (α-1，6-或 α-1，3_)，或 G2 聚糖殘基(Raju, Τ. S.，Bioprocess Int. 1(2003)44-53)。 例如，抗體Fc部分的CHO型糖基化由Routier，F(xiàn). H.，糖綴合物雜志(Glycoconjugate J). 14 (1997) 201-207描述。在未進行糖修飾的CHO宿主細胞中重組表達的抗體通常以至少 85%的量在Asn297進行巖藻糖基化。全長親本抗體的修飾的寡糖可以是雜合型的或復(fù)合型的。優(yōu)選地，所述平分型的、減少的/未-巖藻糖基化的寡糖是雜合型的。在另一個實施方案中，所述平分型的、減少的/未_巖藻糖基化的寡糖是復(fù)合型的。根據(jù)本發(fā)明，“巖藻糖的量”意為與在Asn297附著的所有糖結(jié)構(gòu)的總和(例如， 復(fù)合型、雜合型和高甘露糖型結(jié)構(gòu))相比的在Asn297的糖鏈中所述糖的量，所述糖的量通過MALDI-T0F質(zhì)譜測量并且計算為平均值。巖藻糖的相對量是包含巖藻糖的結(jié)構(gòu)相對于在 N-糖苷酶F處理的樣品中由MALDI-T0F鑒定的所有糖結(jié)構(gòu)(例如，分別為復(fù)合型、雜合型和低聚-與高甘露糖型結(jié)構(gòu))的百分比。(參見，例如WO 2008/077546 (Al)).一個實施方案是制備IgGl或IgG3亞類的雙特異性抗體的方法，所述抗體在Asn297用糖鏈糖基化，其中所述糖鏈中的巖藻糖的量為65%以下，該方法使用在WO 2005/044859，WO 2004/065540, W02007/031875, Umana, P.，等，自然生物技術(shù)(Nature Biotechnol. ) 17(1999) 176-180，W099/154342, WO 2005/018572，WO 2006/116260， WO 2006/114700， W02005/011735, WO 2005/027966， WO 97/028267， US 2006/0134709， US2005/0054048, US 2005/0152894, WO 2003/035835 或 WO 2000/061739 中描述的程序。一個實施方案是制備IgGl或IgG3亞類的雙特異性抗體的方法，所述抗體在 Asn297用糖鏈糖基化，其中所述糖鏈中的巖藻糖的量為65%以下，該方法使用在Niwa，R.， 等，免疫學(xué)方法雜志(J. Immunol. Methods) 306 (2005) 151-160 ;Shinkawa，Τ.等，生物化學(xué)雜志(J Biol Chem)，278 (2003) 3466-3473 ；WO 03/055993 或US 2005/0249722 中描述的程序。雙特異性抗體形式本發(fā)明的抗體具有兩個以上的結(jié)合位點，并且是多特異性的，優(yōu)選是雙特異性的。 即，即使是在存在兩個以上結(jié)合位點(即，抗體是三價或多價的)的情形中，所述抗體可以是雙特異性的。本發(fā)明的雙特異性抗體包括，例如多價單鏈抗體、雙抗體和三鏈抗體，以及具有全長抗體的恒定結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的抗體，另外的抗原結(jié)合位點(例如單鏈Fv、VH結(jié)構(gòu)域和 /或VL結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)ab，或(Fab) 2)通過一個或多個肽接頭連接所述全長抗體的恒定結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)。所述抗體可以是來自單一物種的全長抗體，或可以是嵌合化或人源化的。對于具有超過兩個抗原結(jié)合位點的抗體，一些結(jié)合位點可以是相同的，只要所述蛋白具有對于兩個不同抗原的結(jié)合位點。即，當(dāng)?shù)谝唤Y(jié)合位點特異于ErbB-I時，第二結(jié)合位點特異于c-Met，反之亦然。在一個優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的特異性結(jié)合人ErbB-I和人c_Met的雙特異性抗體包含抗體(優(yōu)選IgGl或IgG3亞類)的Fc區(qū)。二價雙特異性形式針對人ErbB-I和人c_Met的包含免疫球蛋白恒定區(qū)的雙特異性、二價抗體可如，例如 W02009/080251, W02009/080252, W02009/080253 或 Ridgway, J. B.，蛋白質(zhì)工程(Protein Eng.) 9 (1996) 617-621 ；WO 96/027011 ；Merchant, A.M.，等，自然生物技術(shù)(Nature Biotech) 16 (1998) 677-681 ；Atwell, S.，等，分子生物學(xué)雜志(J. Mol.
16Biol.) 270 (1997) 26-35 和 EP 1870459A1 中的描述進行使用。因此在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明所述的雙特異性<ErbB-l-c-Met>抗體是二價、雙特異性抗體，其包含a)特異性結(jié)合ErbB-I的全長抗體的輕鏈和重鏈；和b)特異性結(jié)合人c-Met的全長抗體的輕鏈和重鏈，其中恒定結(jié)構(gòu)域CL和CHl和/或可變結(jié)構(gòu)域VL和VH被相互替換。在本發(fā)明的另一個實施方案中，本發(fā)明所述的雙特異性<ErbB-l-c-Met>抗體是二價、雙特異性抗體，其包含a)特異性結(jié)合人c-Met的全長抗體的輕鏈和重鏈；和b)特異性結(jié)合ErbB-I的全長抗體的輕鏈和重鏈，其中恒定結(jié)構(gòu)域CL和CHl和/或可變結(jié)構(gòu)域VL和VH被相互替換。對于如下所述的“凸起-進入-孔洞(knob-into-holes)，，技術(shù)的示例性圖解結(jié)構(gòu)，參見圖2a_c。為了提高這種異二聚體的二價的、雙特異性的抗-ErbB-I/抗-c-Met抗體的產(chǎn)量，所述全長抗體的CH3結(jié)構(gòu)域可以通過“凸起_進入-孔洞，，技術(shù)改變，該技術(shù)用例如WO 96/027011, Ridgway J.，B.，等，Protein Eng (蛋白質(zhì)工程)9 (1996) 617-621 ；和 Merchant， Α.，Μ.，等，Nat BiotechnoK自然生物技術(shù))16 (1998) 677-681中的若干實例詳細記述。 在該方法中，改變兩個CH3結(jié)構(gòu)域的相互作用表面，以增加包含這兩個CH3結(jié)構(gòu)域的兩條重鏈的異二聚化。(兩條重鏈的)兩個CH3結(jié)構(gòu)域之一可以是“凸起”，而另一個是“孔洞”。二硫鍵的引入穩(wěn)定該異二聚體(Merchant, Α.，Μ，等，Nature Biotech(自然生物技術(shù))16 (1998) 677-681 ；Atwell, S.，等·，J. Mol. Biol.(分子生物學(xué)雜志)270 (1997) 26-35) 并增加產(chǎn)率。因此，在本發(fā)明的一個方面，所述二價雙特異性抗體進一步特征在于一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域和另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域分別在包括抗體CH3結(jié)構(gòu)域之間的初始界面的界面處相接；其中改變所述界面以促進二價雙特異性抗體的形成，其中所述改變的特征在于a)改變一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域，由此，在與二價雙特異性抗體內(nèi)的另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的初始界面相接的一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的初始界面內(nèi)，氨基酸殘基被替換為具有較大側(cè)鏈體積的氨基酸殘基，由此在一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)生成突起，該突起可以定位在另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)的凹洞中；并且b)改變另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域，由此，在與二價雙特異性抗體內(nèi)的第一 CH3結(jié)構(gòu)域的初始界面相接的第二 CH3結(jié)構(gòu)域的初始界面內(nèi)，氨基酸殘基被替換為具有較小側(cè)鏈體積的氨基酸殘基，由此在第二 CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)生成凹洞，第一 CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)的突起可以定位在該凹洞中。優(yōu)選地，所述具有較大側(cè)鏈體積的氨基酸殘基選自由精氨酸(R)，苯丙氨酸(F)， 酪氨酸(Y)，色氨酸(W)組成的組。
優(yōu)選地，所述具有較小側(cè)鏈體積的氨基酸殘基選自由丙氨酸(A)，絲氨酸(S)，蘇氨酸(T)，纈氨酸(V)組成的組。在本發(fā)明的一個方面中，通過引入半胱氨酸(C)作為每個CH3結(jié)構(gòu)域相應(yīng)位置處的氨基酸，進一步改變這兩個CH3結(jié)構(gòu)域，從而可以形成兩個CH3結(jié)構(gòu)域之間的二硫鍵。在優(yōu)選實施方案中，所述二價雙特異性抗體包含在“凸起鏈” CH3結(jié)構(gòu)域中的T366W突變和在“孔洞鏈”CH3結(jié)構(gòu)域中的T366S，L368A，Y407V突變。還可以使用在CH3結(jié)構(gòu)域之間的另外的鏈間二硫鍵(Merchant，A.M，等，自然生物技術(shù)(Nature Biotech) 16 (1998) 677-681)，例如，通過向“凸起鏈” CH3結(jié)構(gòu)域中引入Y349C突變和向“孔洞鏈” CH3結(jié)構(gòu)域中引入E356C突變或S354C突變。因此，在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述二價雙特異性抗體在兩個CH3結(jié)構(gòu)域中的一個中包含Y349C，T366W突變，在這兩個CH3 結(jié)構(gòu)域中的另一個中包含E356C，T366S，L368A，Y407V突變，或所述二價雙特異性抗體包含在兩個CH3結(jié)構(gòu)域中的一個中的Y349C，T366W突變和在這兩個CH3結(jié)構(gòu)域中的另一個中的S354C，T366S，L368A，Y407V突變(在一個CH3結(jié)構(gòu)域中的另外的Y349C突變與在另一個CH3結(jié)構(gòu)域中的另外的E356C或S354C突變形成鏈間二硫鍵)(根據(jù)Kabat的EU索引編號)。但是，也可以備選或者另外地使用EP 1870459A1所述的其它凸起-入-孔洞技術(shù)。 所述二價、雙特異性抗體的優(yōu)選實例是在“凸起鏈” CH3結(jié)構(gòu)域中的R409D ；K370E突變和在 “孔洞鏈” CH3結(jié)構(gòu)域中的D399K ；E357K突變(根據(jù)Kabat的EU索引編號)。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述二價、雙特異性抗體包含在“凸起鏈” CH3結(jié)構(gòu)域中的T366W突變和在“孔洞鏈” CH3結(jié)構(gòu)域中的T366S，L368A，Y407V突變，并且額外地， 包含在“凸起鏈” CH3結(jié)構(gòu)域中的R409D ；K370E突變和在“孔洞鏈” CH3結(jié)構(gòu)域中的D399K ； E357K突變。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述二價、雙特異性抗體包含在兩個CH3結(jié)構(gòu)域中的一個中的Y349C，T366W突變和在這兩個CH3結(jié)構(gòu)域中的另一個中的S354C，T366S, L368A, Y407V突變，或者所述二價、雙特異性抗體包含在兩個CH3結(jié)構(gòu)域中的一個中的Y349C， T366W突變和在這兩個CH3結(jié)構(gòu)域中的另一個中的S354C，T366S, L368A, Y407V突變，并且額外地，包含在“凸起鏈” CH3結(jié)構(gòu)域中的R409D ；K370E突變和在“孔洞鏈” CH3結(jié)構(gòu)域中的 D399K ；E357K 突變。三價雙特異性形式本發(fā)明的另一個優(yōu)選方面是三價、雙特異性抗體，其包含a)特異性結(jié)合人ErbB-I并且由兩個抗體重鏈和兩個抗體輕鏈組成的全長抗體； 禾口b)特異性結(jié)合人c-Met的一個單鏈Fab片段，其中b)中所述單鏈Fab片段通過肽連接體在a)中所述全長抗體的重鏈或輕鏈的 C-或N-末端融合到所述全長抗體。對于如下所述的“凸起-進入-孔洞”技術(shù)的示例性圖解結(jié)構(gòu)，參見圖5a。本發(fā)明的另一個優(yōu)選方面是三價、雙特異性抗體，其包含a)特異性結(jié)合人ErbB-I并且由兩個抗體重鏈和兩個抗體輕鏈組成的全長抗體； 禾口b)特異性結(jié)合人c-Met的一個單鏈Fv片段，
其中b)中所述單鏈Fv片段通過肽連接體在a)中所述全長抗體的重鏈或輕鏈的 C-或N-末端融合到所述全長抗體。對于如下所述的“凸起_進入-孔洞”技術(shù)的示例性圖解結(jié)構(gòu)，參見圖5b。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述結(jié)合人c-Met的單鏈Fab或Fv片段通過肽連接體在所述全長抗體的重鏈的C-末端融合到所述全長抗體。本發(fā)明的另一個優(yōu)選方面是三價、雙特異性抗體，其包含a)特異性結(jié)合人ErbB-I并且由兩個抗體重鏈和兩個抗體輕鏈組成的全長抗體； 和b)由下述組成的多肽ba)抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)；或bb)抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和抗體恒定結(jié)構(gòu)域1 (CHl)，其中所述多肽的VH結(jié)構(gòu)域N端通過肽連接體融合到所述全長抗體的兩條重鏈中的一條重鏈的C端；c)由下述組成的多肽ca)抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)，或cb)抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)和抗體輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域(CL)；其中所述多肽的VL結(jié)構(gòu)域N端通過肽連接體融合到所述全長抗體的兩條重鏈中的另一條重鏈的C端；并且其中b)中所述多肽的抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和C)中所述多肽的抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL) —起形成特異性結(jié)合人c-Met的抗原結(jié)合位點。優(yōu)選地，b)和C)中所述的肽連接體是相同的，并且是至少25個氨基酸的肽，優(yōu)選在30和50個氨基酸之間的肽。對于示例性圖解結(jié)構(gòu)參見圖3a_c。任選地，b)中所述多肽的抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和C)中所述多肽的抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)通過鏈間二硫鍵連接并得以穩(wěn)定，所述鏈間二硫鍵通過在下述位置之間引入二硫鍵形成i)重鏈可變結(jié)構(gòu)域位置44到輕鏈可變結(jié)構(gòu)域位置100，ii)重鏈可變結(jié)構(gòu)域位置105到輕鏈可變結(jié)構(gòu)域位置43，或iii)重鏈可變結(jié)構(gòu)域位置101到輕鏈可變結(jié)構(gòu)域位置100 (總是根據(jù)Kabat的EU 索引編號)。例如，引入用于穩(wěn)定的非天然二硫鍵的技術(shù)記述在WO 94/029350，Rajagopal, 等，蛋白質(zhì)工程(Prot. Engin.) 10(1997) 1453-59 ；Kobayashi，H.，等，核醫(yī)學(xué)和生物學(xué)(Nuclear Medicine & Biology)25(1998)387-393 ；或 Schmidt， Μ·，等，癌基因 (Oncogene) 18(1999) 1711-1721中。在一個實施方案中，在b)和c)中所述多肽的可變結(jié)構(gòu)域之間的任選的二硫鍵在重鏈可變結(jié)構(gòu)域位置44和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域位置100之間。在一個實施方案中，在b)和c)中所述多肽的可變結(jié)構(gòu)域之間的任選的二硫鍵在重鏈可變結(jié)構(gòu)域位置105和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域位置43之間。(總是根據(jù)Kabat的EU索引編號)在一個實施方案中，優(yōu)選在單鏈Fab片段的可變結(jié)構(gòu)域VH和VL之間沒有所述任選的二硫化物穩(wěn)定的三價、雙特異性抗體。
通過將單鏈Fab、Fv片段融合到一條重鏈上(圖5a或5b)或通過將不同多肽融合到全長抗體的兩條重鏈上(圖3a_c)，產(chǎn)生異二聚化的、三價雙特異性抗體。為了提高這種異二聚體的三價的、雙特異性的抗-ErbB-I/抗-c-Met抗體的產(chǎn)量，所述全長抗體的CH3結(jié)構(gòu)域可以通過“凸起-進入-孔洞”技術(shù)改變，該技術(shù)用例如WO 96/02701 LRidgway J.，B.， 等，ProteinEng (蛋白質(zhì)工程)9 (1996) 617-621 ；和 Merchant，Α· M.，等，Nat Biotechnol (自然生物技術(shù))16(1998)677-681中的若干實例詳細記述。在該方法中，改變兩個CH3結(jié)構(gòu)域的相互作用表面，以增加包含這兩個CH3結(jié)構(gòu)域的兩條重鏈的異二聚化。(兩條重鏈的) 兩個CH3結(jié)構(gòu)域之一可以是“凸起”，而另一個是“孔洞”。二硫鍵的引入穩(wěn)定該異二聚體 (Merchant，A.M.，等，Nature Biotech (自然生物技術(shù))16 (1998) 677-681 ；Atwel 1, S.，等·， J. Mol. Biol.(分子生物學(xué)雜志)270 (1997) 26-35)并增加產(chǎn)率。因此，在本發(fā)明的一個方面，所述三價雙特異性抗體進一步特征在于全長抗體的一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域和該全長抗體的另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域分別在包括抗體CH3結(jié)構(gòu)域之間的初始界面的界面處相接；其中改變所述界面以促進二價雙特異性抗體的形成，其中所述改變的特征在于a)改變一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域，由此，在與二價雙特異性抗體內(nèi)的另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的初始界面相接的一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的初始界面內(nèi)，氨基酸殘基被替換為具有較大側(cè)鏈體積的氨基酸殘基，由此在一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)生成突起，該突起可以定位在另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)的凹洞中；并且b)改變另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域，由此，在與三價雙特異性抗體內(nèi)的第一 CH3結(jié)構(gòu)域的初始界面相接的第二 CH3結(jié)構(gòu)域的初始界面內(nèi)，氨基酸殘基被替換為具有較小側(cè)鏈體積的氨基酸殘基，由此在第二 CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)生成凹洞，第一 CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)的突起可以定位在該凹洞中。優(yōu)選地，所述具有較大側(cè)鏈體積的氨基酸殘基選自由精氨酸(R)，苯丙氨酸(F)， 酪氨酸(Y)，色氨酸(W)組成的組。優(yōu)選地，所述具有較小側(cè)鏈體積的氨基酸殘基選自由丙氨酸(A)，絲氨酸(S)，蘇氨酸(T)，纈氨酸(V)組成的組。在本發(fā)明的一個方面中，通過引入半胱氨酸(C)作為每個CH3結(jié)構(gòu)域相應(yīng)位置處的氨基酸，進一步改變這兩個CH3結(jié)構(gòu)域，從而可以形成兩個CH3結(jié)構(gòu)域之間的二硫鍵。在優(yōu)選實施方案中，所述三價雙特異性抗體包含在“凸起鏈” CH3結(jié)構(gòu)域中的T366W突變和在“孔洞鏈”CH3結(jié)構(gòu)域中的T366S，L368A，Y407V突變。還可以使用在CH3結(jié)構(gòu)域之間的另外的鏈間二硫鍵(Merchant，Α. Μ.，等，自然生物技術(shù)(Nature Biotech) 16 (1998) 677-681)，例如，通過向“凸起鏈” CH3結(jié)構(gòu)域中引入Y349C突變和向“孔洞鏈” CH3結(jié)構(gòu)域中引入E356C突變或S354C突變。因此，在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述三價雙特異性抗體包含在兩個CH3結(jié)構(gòu)域中的一個中的Y349C，T366W突變和在這兩個 CH3結(jié)構(gòu)域中的另一個中的E356C，T366S，L368A，Y407V突變，或所述三價雙特異性抗體包含在兩個CH3結(jié)構(gòu)域中的一個中的Y349C，T366W突變和在這兩個CH3結(jié)構(gòu)域中的另一個中的S354C，T366S，L368A，Y407V突變(在一個CH3結(jié)構(gòu)域中的另外的Y349C突變與在另一個CH3結(jié)構(gòu)域中的另外的E356C或S354C突變形成鏈間二硫鍵)(總是根據(jù)Kabat的EU索引編號)。但是，也可以備選或者另外地使用EP 1870459A1所述的其它凸起-入-孔洞技術(shù)。所述三價、雙特異性抗體的優(yōu)選實例是在“凸起鏈”CH3結(jié)構(gòu)域中的R409D ；K370E突變和在“孔洞鏈” CH3結(jié)構(gòu)域中的D399K ；E357K突變(總是根據(jù)Kabat的EU索引編號)。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述三價、雙特異性抗體包含在“凸起鏈” CH3結(jié)構(gòu)域中的T366W突變和在“孔洞鏈” CH3結(jié)構(gòu)域中的T366S，L368A，Y407V突變，并且額外地， 包含在“凸起鏈” CH3結(jié)構(gòu)域中的R409D ；K370E突變和在“孔洞鏈” CH3結(jié)構(gòu)域中的D399K ； E357K突變。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述三價、雙特異性抗體包含在兩個CH3結(jié)構(gòu)域中的一個中的Y349C，T366W突變和在這兩個CH3結(jié)構(gòu)域中的另一個中的S354C，T366S, L368A, Y407V突變，或者所述三價、雙特異性抗體包含在兩個CH3結(jié)構(gòu)域中的一個中的Y349C， T366W突變和在這兩個CH3結(jié)構(gòu)域中的另一個中的S354C，T366S, L368A, Y407V突變，并且額外地，包含在“凸起鏈” CH3結(jié)構(gòu)域中的R409D ；K370E突變和在“孔洞鏈” CH3結(jié)構(gòu)域中的 D399K ；E357K 突變。本發(fā)明的另一個實施方案是三價、雙特異性抗體，其包含a)全長抗體，其特異性結(jié)合人ErbB-I并且由下述組成aa)兩個抗體重鏈，其在N-端至C-端方向由抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)，抗體恒定重鏈結(jié)構(gòu)域1 (CHl)，抗體鉸鏈區(qū)(HR)，抗體重鏈恒定結(jié)構(gòu)域2 (CH2)，和抗體重鏈恒定結(jié)構(gòu)域3 (CH3)組成；和ab)兩個抗體輕鏈，其在N-端至C-端方向由抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)，和抗體輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域(CL) (VL-CL)組成；和b) 一個特異性結(jié)合人C-Met的單鏈Fab片段，其中所述單鏈Fab片段由抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和抗體恒定結(jié)構(gòu)域1 (CHl)，抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)，抗體輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域(CL)和接頭組成，并且其中所述抗體結(jié)構(gòu)域和所述接頭在N-端至C-端方向具有下述順序之一ba) VH-CHl-接頭-VL-CL，或 bb) VL-CL-接頭-VH-CH1 ；其中所述接頭是至少30個氨基酸的肽，優(yōu)選在32和50個氨基酸殘基之間的肽；并且其中b)中所述單鏈Fab片段通過肽連接體在a)中所述全長抗體的重鏈或輕鏈的C-或N-末端(優(yōu)選重鏈的C-末端)融合到所述全長抗體；其中所述肽連接體是至少5個氨基酸的肽，優(yōu)選在10和50個氨基酸之間的肽。在這一實施方案中，優(yōu)選地，所述三價、雙特異性抗體包含在兩個CH3結(jié)構(gòu)域中的一個中的T366W突變和在這兩個CH3結(jié)構(gòu)域中的另一個中的T366S，L368A, Y407V突變，并且更優(yōu)選地，所述三價、雙特異性抗體包含在兩個CH3結(jié)構(gòu)域中的一個中的Y349C，T366W突變和在這兩個CH3結(jié)構(gòu)域中的另一個中的S354C (或E356C)，T366S, L368A, Y407V突變。任選地，在所述實施方案中，所述三價、雙特異性抗體包含在“凸起鏈”CH3結(jié)構(gòu)域中的R409D ； K370E突變和在“孔洞鏈” CH3結(jié)構(gòu)域中的D399K ；E357K突變。本發(fā)明的另一個實施方案是三價、雙特異性抗體，其包含a)全長抗體，其特異性結(jié)合人ErbB-I并且由下述組成
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aa)兩個抗體重鏈，其在N-端至C-端方向由抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)，抗體恒定重鏈結(jié)構(gòu)域1 (CHl)，抗體鉸鏈區(qū)(HR)，抗體重鏈恒定結(jié)構(gòu)域2 (CH2)，和抗體重鏈恒定結(jié)構(gòu)域3(CH3)組成；和ab)兩個抗體輕鏈，其在N-端至C-端方向由抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)，和抗體輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域(CL) (VL-CL)組成；和b) 一個特異性結(jié)合人c-Met的單鏈Fv片段，其中b)中所述單鏈Fv片段通過肽連接體在a)中所述全長抗體的重鏈或輕鏈的 C-或N-末端(優(yōu)選重鏈的C-末端)融合到所述全長抗體；其中所述肽連接體是至少5個氨基酸的肽，優(yōu)選在10和50個氨基酸之間的肽。在這一實施方案中，優(yōu)選地，所述三價、雙特異性抗體包含在兩個CH3結(jié)構(gòu)域中的一個中的T366W突變和在這兩個CH3結(jié)構(gòu)域中的另一個中的T366S，L368A, Y407V突變，并且更優(yōu)選地，所述三價、雙特異性抗體包含在兩個CH3結(jié)構(gòu)域中的一個中的TO49C，T366W突變和在這兩個CH3結(jié)構(gòu)域中的另一個中的S3MC (或E356C)，T366S, L368A, Y407V突變。任選地，在所述實施方案中，所述三價、雙特異性抗體包含在“凸起鏈”CH3結(jié)構(gòu)域中的R409D ； K370E突變和在“孔洞鏈” CH3結(jié)構(gòu)域中的D399K ；E357K突變。因此，優(yōu)選的實施方案是三價、雙特異性抗體，其包含a)全長抗體，其特異性結(jié)合人ErbB-I并且由下述組成aa)兩個抗體重鏈，其在N-端至C-端方向由抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)，抗體恒定重鏈結(jié)構(gòu)域1 (CHl)，抗體鉸鏈區(qū)(HR)，抗體重鏈恒定結(jié)構(gòu)域2 (CH2)，和抗體重鏈恒定結(jié)構(gòu)域3(CH3)組成；和ab)兩個抗體輕鏈，其在N-端至C-端方向由抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)，和抗體輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域(CL) (VL-CL)組成；和b) 一個特異性結(jié)合人c-Met的單鏈Fv片段，其中b)中所述單鏈Fv片段通過肽連接體在a)中所述全長抗體的重鏈的C_末端融合到所述全長抗體(產(chǎn)生兩抗體重鏈-單鏈Fv融合肽)；和其中所述肽連接體是至少5個氨基酸的肽。本發(fā)明的另一個實施方案是三價、雙特異性抗體，其包含a)全長抗體，其特異性結(jié)合人ErbB-I并且由下述組成aa)兩個抗體重鏈，其在N-端至C-端方向由抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)，抗體恒定重鏈結(jié)構(gòu)域1 (CHl)，抗體鉸鏈區(qū)(HR)，抗體重鏈恒定結(jié)構(gòu)域2 (CH2)，和抗體重鏈恒定結(jié)構(gòu)域3(CH3)組成；和ab)兩個抗體輕鏈，其在N-端至C-端方向由抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)，和抗體輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域(CL)組成；和b)由下述組成的多肽ba)抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)；或bb)抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和抗體恒定結(jié)構(gòu)域1 (CHl)，其中所述多肽的VH結(jié)構(gòu)域N端通過肽連接體融合到所述全長抗體的兩條重鏈中的一條重鏈的C端(產(chǎn)生抗體重鏈-VH融合肽)，其中所述肽連接體是至少5個氨基酸的肽，優(yōu)選在25和50個氨基酸之間的肽；
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c)由下述組成的多肽ca)抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)，或cb)抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)和抗體輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域(CL)；其中所述多肽的VL結(jié)構(gòu)域N端通過肽連接體融合到所述全長抗體的兩條重鏈中的另一條重鏈的C端(產(chǎn)生抗體重鏈-VL融合肽)；其中所述肽連接體與b)中所述肽連接體相同；并且其中b)中所述多肽的抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和C)中所述多肽的抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL) —起形成特異性結(jié)合人c-Met的抗原結(jié)合位點。在這一實施方案中，優(yōu)選地，所述三價、雙特異性抗體包含在兩個CH3結(jié)構(gòu)域中的一個中的T366W突變和在這兩個CH3結(jié)構(gòu)域中的另一個中的T366S，L368A, Y407V突變，并且更優(yōu)選地，所述三價、雙特異性抗體包含在兩個CH3結(jié)構(gòu)域中的一個中的TO49C，T366W突變和在這兩個CH3結(jié)構(gòu)域中的另一個中的S3MC (或E356C)，T366S, L368A, Y407V突變。任選地，在所述實施方案中，所述三價、雙特異性抗體包含在“凸起鏈”CH3結(jié)構(gòu)域中的R409D ； K370E突變和在“孔洞鏈” CH3結(jié)構(gòu)域中的D399K ；E357K突變。在本發(fā)明的另一個方面中，本發(fā)明所述的三價、雙特異性抗體包含a)結(jié)合人ErbB-I的全長抗體，其由兩個抗體重鏈VH-CH1-HR-CH2-CH3和兩個抗體輕鏈VL-CL組成；(其中優(yōu)選地，兩個CH3結(jié)構(gòu)域中的一個包含TO49C，T366W突變，并且這兩個CH3 結(jié)構(gòu)域中的另一個包含S354C (或E356C)，T366S, L368A, Y407V突變)；b)由下述組成的多肽ba)抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)；或bb)抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和抗體恒定結(jié)構(gòu)域1 (CHl)，其中所述多肽的VH結(jié)構(gòu)域N端通過肽連接體融合到所述全長抗體的兩條重鏈中的一條重鏈的C端；c)由下述組成的多肽 ca)抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)，或cb)抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)和抗體輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域(CL)；其中所述多肽的VL結(jié)構(gòu)域N端通過肽連接體融合到所述全長抗體的兩條重鏈中的另一條重鏈的C端；并且其中b)中所述多肽的抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和C)中所述多肽的抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL) —起形成特異性結(jié)合人c-Met的抗原結(jié)合位點。四價雙特異性形式在一個實施方案中，本發(fā)明所述的多特異性抗體是四價的，其中特異性結(jié)合人 c-Met的抗原結(jié)合位點抑制c-Met 二聚化(例如，如在WO 2009/007427中所述)。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述抗體是特異性結(jié)合人ErbB-I和人c-Met的四價的、雙特異性抗體，其包含特異性結(jié)合人ErbB-I的兩個抗原結(jié)合位點和特異性結(jié)合人 c-Met的兩個抗原結(jié)合位點，其中所述特異性結(jié)合人c-Met的抗原結(jié)合位點抑制c_Met的二聚化(例如，如在WO 2009/007427中所述)。因此，本發(fā)明的另一個方面是四價、雙特異性抗體，其包含
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a)全長抗體，其特異性結(jié)合人C-Met并且由兩個抗體重鏈和兩個抗體輕鏈組成； 和b)特異性結(jié)合ErbB-I的兩個相同的單鏈Fab片段，其中b)中所述單鏈Fab片段通過肽連接體在a)中所述全長抗體的重鏈或輕鏈的 C-或N-末端融合到所述全長抗體。因此，本發(fā)明的另一個優(yōu)選方面是四價、雙特異性抗體，其包含a)全長抗體，其特異性結(jié)合人ErbB-I并且由兩個抗體重鏈和兩個抗體輕鏈組成； 和b)特異性結(jié)合人c-Met的兩個相同的單鏈Fab片段，其中b)中所述單鏈Fab片段通過肽連接體在a)中所述全長抗體的重鏈或輕鏈的 C-或N-末端融合到所述全長抗體。對于示例性圖解結(jié)構(gòu)，參見圖6a。因此，本發(fā)明的另一個優(yōu)選方面是四價、雙特異性抗體，其包含a)全長抗體，其特異性結(jié)合ErbB-I并且由兩個抗體重鏈和兩個抗體輕鏈組成；和b)特異性結(jié)合人c-Met的兩個相同的單鏈Fv片段，其中b)中所述單鏈Fv片段通過肽連接體在a)中所述全長抗體的重鏈或輕鏈的 C-或N-末端融合到所述全長抗體。因此，本發(fā)明的另一個優(yōu)選方面是四價、雙特異性抗體，其包含a)全長抗體，其特異性結(jié)合人c-Met并且由兩個抗體重鏈和兩個抗體輕鏈組成； 和b)特異性結(jié)合ErbB-I的兩個相同的單鏈Fv片段，其中b)中所述單鏈Fv片段通過肽連接體在a)中所述全長抗體的重鏈或輕鏈的 C-或N-末端融合到所述全長抗體。對于示例性圖解結(jié)構(gòu)，參見圖6b。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述結(jié)合人c-Met或人ErbB-Ι的單鏈Fab或Fv片段通過肽連接體在所述全長抗體的重鏈的C-端融合到所述全長抗體。本發(fā)明的另一個實施方案是四價、雙特異性抗體，其包含a)全長抗體，其特異性結(jié)合人ErbB-I并且由下述組成aa)兩個相同的抗體重鏈，其在N-端至C-端方向由抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)，抗體恒定重鏈結(jié)構(gòu)域1 (CHl)，抗體鉸鏈區(qū)(HR)，抗體重鏈恒定結(jié)構(gòu)域2 (CH2)，和抗體重鏈恒定結(jié)構(gòu)域3(CH3)組成；和ab)兩個相同的抗體輕鏈，其在N-端至C-端方向由抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)，和抗體輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域(CL) (VL-CL)組成；和b)特異性結(jié)合人c-Met的兩個單鏈Fab片段，其中所述單鏈Fab片段由抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和抗體恒定結(jié)構(gòu)域1 (CHl)，抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)，抗體輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域(CL)和接頭組成，并且其中所述抗體結(jié)構(gòu)域和所述接頭在N-端至C-端方向具有下述順序之一ba) VH-CHl-接頭-VL-CL，或 bb) VL-CL-接頭-VH-CH1 ；其中所述接頭是至少30個氨基酸的肽，優(yōu)選在32和50個氨基酸殘基之間的肽；
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并且其中b)中所述單鏈Fab片段通過肽連接體在a)中所述全長抗體的重鏈或輕鏈的C-或N-末端融合到所述全長抗體；其中所述肽連接體是至少5個氨基酸的肽，優(yōu)選在10和50個氨基酸之間的肽。當(dāng)用在三價或四價形式中時，術(shù)語“全長抗體”指由兩條“全長抗體重鏈”和兩條 “全長抗體輕鏈”組成的抗體(見

圖1)?！叭L抗體重鏈”是這樣的多肽，其在N端到C端方向由抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)、抗體恒定重鏈結(jié)構(gòu)域1 (CHl)，抗體鉸鏈區(qū)(HR)，抗體重鏈恒定結(jié)構(gòu)域2 (CH2)，和抗體重鏈恒定結(jié)構(gòu)域3 (CH3)組成，縮寫為VH-CH1-HR-CH2-CH3 ；并且在IgE亞類的抗體的情形中，任選地還包括抗體重鏈恒定結(jié)構(gòu)域4(CH4)。優(yōu)選地，“全長抗體重鏈”是在N端到C端方向由VH，CHI, HR, CH2和CH3組成的多肽。“全長抗體輕鏈”是在N端到C端方向由抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)，和抗體輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域(CL)組成的多肽， 縮寫為VL-CL。所述抗體輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域(CL)可以是κ (kappa)或λ (lambda) 0兩條全長抗體鏈通過在CL結(jié)構(gòu)域和CHl結(jié)構(gòu)域之間的多肽間二硫鍵和全長抗體重鏈的鉸鏈區(qū)之間的多肽間二硫鍵連接在一起。典型的全長抗體的實例是天然抗體如IgG(例如，IgGl和 IgG2)，IgM，IgA，IgDjP IgE。根據(jù)本發(fā)明所述的全長抗體可以來自單一物種，例如人，或它們可以是嵌合的或人源化的抗體。根據(jù)本發(fā)明所述的全長抗體包含分別由VH和VL配對形成的兩個抗原結(jié)合位點，這兩個抗原結(jié)合位點都特異性結(jié)合于相同的抗原。所述全長抗體的重鏈或輕鏈的C端指在所述重鏈或輕鏈的C端的最后的氨基酸。所述全長抗體的重鏈或輕鏈的N端指在所述重鏈或輕鏈的N端的最后的氨基酸。術(shù)語“肽連接體”用于本發(fā)明時指具有氨基酸序列的肽，其優(yōu)選地是合成來源的。 這些本發(fā)明所述的肽連接體用于將單鏈Fab片段融合到全長抗體的C-或N-端，以形成本發(fā)明所述的多特異性抗體。優(yōu)選地，b)中所述肽連接體是具有長度為至少5個氨基酸的氨基酸序列的肽，優(yōu)選長度為5-100個、更優(yōu)選長度為10-50個氨基酸的氨基酸序列的肽。在一個實施方案中，所述肽連接體是(GxS)n或(GxS)nGm，其中G=甘氨酸，S=絲氨酸，且(χ =3，η = 3，4，5 或 6，且 m = 0，1，2 或 3)或(χ = 4，η = 2，3，4 或 5 且 m = 0，1，2 或 3)， 優(yōu)選地χ = 4且η = 2或3，更優(yōu)選地χ = 4，η = 2。優(yōu)選地，在三價、雙特異性抗體中，其中VH或VH-CHl多肽和VL或VL-CL多肽(圖7a_c)通過兩個相同的肽連接體融合到全長抗體的C-端，所述肽連接體是至少25個氨基酸的肽，優(yōu)選是30-50個氨基酸的肽，并且更優(yōu)選地，所述肽連接體是(GxS)n或(GxS)nGm，其中G=甘氨酸，S=絲氨酸，且(x = 3，n = 6，7或8，且111 = 0，1，2或3)或(1 = 4，11 = 5，6，或7且111 = 0，1，2 或 3)，優(yōu)選 χ = 4 且η =5,6,7?！皢捂淔ab片段”(見圖2a)是由抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)，抗體恒定結(jié)構(gòu)域 1 (CHl)，抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)，抗體輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域(CL)和接頭組成的多肽，其中所述抗體結(jié)構(gòu)域和所述接頭從N端到C端方向具有下列順序之一 a) VH-CHl-接頭-VL-CL，b) VL-CL-接頭-VH-CHl，c) VH-CL-接頭-VL-CH1或d) VL-CHl-接頭-VH-CL ；并且其中所述接頭是至少30個氨基酸的多肽，優(yōu)選地32-50個氨基酸的多肽。所述單鏈Fab片段a) VH-CHl-接頭-VL-CL，b) VL-CL-接頭-VH-CH1，c) VH-CL-接頭-VL-CH1 和 d) VL-CHl-接頭-VH-CL，通過在CL結(jié)構(gòu)域和CHl結(jié)構(gòu)域之間的天然二硫鍵穩(wěn)定。術(shù)語“N-端”指N端的最后的氨基酸。術(shù)語“C-端”指C端的最后的氨基酸。術(shù)語“接頭”在本發(fā)明中與單鏈Fab片段聯(lián)系使用，并且指具有氨基酸序列的肽，
25其優(yōu)選地是合成來源的。將本發(fā)明所述的這些肽用于連接a) VH-CHl與VL-CL，b) VL-CL與 VH-CHl，c) VH-CL與VL-CHl或d) VL-CHl與VH-CL從而形成下列本發(fā)明所述的單鏈Fab片段 a) VH-CHl-接頭-VL-CL，b) VL-CL-接頭-VH-CH1，c) VH-CL-接頭-VL-CH1 或 d) VL-CHl-接頭-VH-CL。在所述單鏈Fab片段中的所述接頭是具有至少30個氨基酸長度的氨基酸序列， 優(yōu)選地具有32-50個氨基酸長度的氨基酸序列。在一個實施方案中，所述接頭是(focS)n， 其中G =甘氨酸，S =絲氨酸，& = 3，11 = 8，9或10和111 = 0，1，2或3)或(x = 4和η = 6，7或8和m = 0，1，2或3)，優(yōu)選地其中乂 = 4，11 = 6或7和111 = 0，1，2或3，更優(yōu)選地χ = 4，n = 7*m = 2。在一個實施方案中，所述接頭是(QS)#2。在一個優(yōu)選的實施方案中，在所述單鏈Fab片段中的所述抗體結(jié)構(gòu)域和所述接頭在N-端至C-端方向具有下述順序之一a) VH-CHl-接頭-VL-CL，或 b) VL-CL-接頭-VH-CHl，更優(yōu)選地 VL-CL-接頭-VH-CHl。在另一個優(yōu)選的實施方案中，在所述單鏈Fab片段中的所述抗體結(jié)構(gòu)域和所述接頭在N-端至C-端方向具有下述順序之一a) VH-CL-接頭-VL-CH1 或 b) VL-CHl-接頭-VH-CL。任選地，在所述單鏈Fab片段中，除了在CL-結(jié)構(gòu)域和CHl結(jié)構(gòu)域之間的天然二硫鍵之外，還通過在下列位置之間引入二硫鍵來對抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)進行二硫化物穩(wěn)定i)重鏈可變結(jié)構(gòu)域位置44到輕鏈可變結(jié)構(gòu)域位置100，ii)重鏈可變結(jié)構(gòu)域位置105到輕鏈可變結(jié)構(gòu)域位置43，或iii)重鏈可變結(jié)構(gòu)域位置101到輕鏈可變結(jié)構(gòu)域位置100 (總是根據(jù)Kabat的EU 索引編號)。單鏈Fab片段的這些另外的二硫化物穩(wěn)定通過在單鏈Fab片段的可變結(jié)構(gòu)域VH 和VL之間引入二硫鍵來實現(xiàn)。例如，引入非天然的二硫鍵來穩(wěn)定單鏈Fv的技術(shù)描述在WO 94/029350, Rajagopal，V.，等，蛋白質(zhì)工程(Prot. Engin.) 10 (1997) 1453-59 ；Kobayashi， H.，等，核醫(yī)學(xué)和生物學(xué)(Nuclear Medicine & Biology)，25 (1998) 387-393 ；或 khmidt， Μ.，等，癌基因(Oncogene) 18(1999) 1711-1721中。在一個實施方案中，包含在本發(fā)明所述的抗體中的單鏈Fab片段的可變結(jié)構(gòu)域之間的任選的二硫鍵在重鏈可變結(jié)構(gòu)域位置44和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域位置100之間。在一個實施方案中，包含在本發(fā)明所述的抗體中的單鏈Fab 片段的可變結(jié)構(gòu)域之間的任選的二硫鍵在重鏈可變結(jié)構(gòu)域位置105和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域位置43之間(總是根據(jù)Kabat的EU索引編號)。在一個實施方案中，優(yōu)選在單鏈Fab片段的可變結(jié)構(gòu)域VH和VL之間不具有所述任選的二硫化物穩(wěn)定的單鏈Fab片段?！皢捂淔v片段”(見圖2b)是由抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)、抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域 (VL)、和單鏈Fv接頭組成的多肽，其中所述抗體結(jié)構(gòu)域和所述單鏈Fv接頭從N端到C端方向具有下列順序之一 a) VH-單鏈Fv接頭-VL，b) VL-單鏈Fv接頭-VH ；優(yōu)選a) VH-單鏈Fv 接頭-VL，并且其中所述單鏈Fv接頭是具有至少15個氨基酸長度的氨基酸序列的多肽，在一個實施方案中，是具有至少20個氨基酸長度的氨基酸序列的多肽。術(shù)語“N-端”指N端的最后的氨基酸。術(shù)語“C-端”指C端的最后的氨基酸。
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當(dāng)用于單鏈Fv片段中時，術(shù)語“單鏈Fv接頭”指具有氨基酸序列的肽，其優(yōu)選地是合成來源的。所述單鏈Fv接頭是具有至少15個氨基酸長度的氨基酸序列的肽，在一個實施方案中，是具有至少20個氨基酸長度的氨基酸序列的肽，且優(yōu)選是具有15-30個氨基酸長度的氨基酸序列的肽。在一個實施方案中，所述單鏈接頭是(fo^)n，其中G=甘氨酸， S =絲氨酸，(χ = 3 且 η = 4，5 或 6)或(χ = 4 且 η = 3，4，5 或 6)，優(yōu)選 χ = 4，η = 3，4 或5，更優(yōu)選χ = 4，n = 3或4。在一個實施方案中，所述單鏈Fv接頭是(QS) 3或(G4S)40此外，所述單鏈Fv片段優(yōu)選是二硫化物穩(wěn)定的。單鏈抗體的這些另外的二硫化物穩(wěn)定通過在單鏈抗體的可變結(jié)構(gòu)域之間引入二硫鍵來實現(xiàn)，并且，例如，在WO 94/029350, Rajagopal, V.，等，蛋白質(zhì)工程(Prot. Engin.) 10 (1997) 1453-59 ；Kobayashi, H.，等，核醫(yī)學(xué)和生物學(xué)(Nuclear Medicine& Biology)，25 (1998) 387-393 ；或 khmidt，Μ.，等，癌基因 (Oncogene) 18(1999) 1711-1721 中所述。在二硫化物穩(wěn)定的單鏈Fv片段的一個實施方案中，對于每種單鏈Fv片段，包含在本發(fā)明所述的抗體中的單鏈Fv片段的可變結(jié)構(gòu)域之間的二硫鍵獨立地選自i)重鏈可變結(jié)構(gòu)域位置44到輕鏈可變結(jié)構(gòu)域位置100，ii)重鏈可變結(jié)構(gòu)域位置105到輕鏈可變結(jié)構(gòu)域位置43，或iii)重鏈可變結(jié)構(gòu)域位置101到輕鏈可變結(jié)構(gòu)域位置100。在一個實施方案中，包含在本發(fā)明所述的抗體中的單鏈Fv片段的可變結(jié)構(gòu)域之間的二硫鍵在重鏈可變結(jié)構(gòu)域位置44和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域位置100之間。在一個實施方案中，本發(fā)明所述的雙特異性Herl/c-Met抗體在不存在HGF時抑制 A431 (ATCC No. CRL-1555)癌細胞增殖至少30% (48小時后測量，見實施例7a)。在一個實施方案中，本發(fā)明所述的雙特異性Herl/c-Met抗體在存在HGF時抑制 A431 (ATCC No. CRL-1555)癌細胞增殖至少30% (48小時后測量，見實施例7b)。本發(fā)明所述的抗體由重組方式產(chǎn)生。因此，本發(fā)明的一個方面是編碼本發(fā)明所述的抗體的核酸，并且另一個方面是包含編碼本發(fā)明所述的抗體的核酸的細胞。用于重組生產(chǎn)的方法是現(xiàn)有技術(shù)中廣泛已知的并且包括在原核細胞和真核細胞中的蛋白表達， 以及隨后的抗體分離和通常純化為藥用純度。對于前述抗體在宿主細胞中的表達，將編碼各個修飾的輕鏈和重鏈的核酸通過標準方法插入表達載體中。在適合的原核或真核宿主細胞如CHO細胞，NSO細胞，SP2/0細胞，HEK293細胞，COS細胞，PER. C6細胞，酵母， 或大腸桿菌(E. coli)細胞中進行表達，并且將所述抗體從細胞(上清液或裂解后的細胞)中回收。用于抗體重組生產(chǎn)的一般方法是現(xiàn)有技術(shù)中公知的，并且例如在Makrides， S. C.，蛋白表達和純化(Protein Expr. Purif.) 17 (1999) 183-202 ；Geisse, S.，等，蛋白表達和純化(Protein Expr. Purif.) 8 (1996) 271-282 ；Kaufman, R.，J.，分子生物技術(shù)(Mol. Biotechnol.) 16 (2000) 151-160 ；Werner, R.，G.，藥物研究(Drug Res.) 48 (1998) 870-880 的綜述文章中描述。通過常規(guī)免疫球蛋白純化方法，將雙特異性抗體適當(dāng)?shù)貜呐囵B(yǎng)基中分離，所述純化方法如，例如蛋白質(zhì)A-瓊脂糖，羥基磷灰石層析法，凝膠電泳，透析或親和層析法。編碼所述單克隆抗體的DNA和RNA容易地使用常規(guī)方法進行分離和測序。雜交瘤細胞可以充當(dāng)所述DNA和RNA的來源。一旦被分離，可以將DNA插入表達載體中，所述表達載體接著被轉(zhuǎn)染到不另外產(chǎn)生免疫球蛋白的宿主細胞如HEK 293細胞、CHO細胞、或骨髓瘤細胞中，從而
27在宿主細胞中獲得重組單克隆抗體的合成。雙特異性抗體的氨基酸序列變體(或突變體)通過將適合的核苷酸變化引入抗體 DNA中，或通過核苷酸合成進行制備。然而，這樣的修飾可以僅在例如如上述的非常有限的范圍內(nèi)進行。例如，修飾不改變上述提及的抗體特征如IgG同種型和抗原結(jié)合，但是可以提高重組生產(chǎn)的產(chǎn)率、蛋白穩(wěn)定性或有利于純化。術(shù)語“宿主細胞”用于本申請時是指可以被改造從而產(chǎn)生本發(fā)明所述的抗體的細胞系統(tǒng)的任何種類。在一個實施方案中，將HEK293細胞和CHO細胞用作宿主細胞。用于本文時，表述“細胞”、“細胞系”和“細胞培養(yǎng)物”可互換使用，且全部這些名稱都包括后代。因此，詞語“轉(zhuǎn)化體”和“轉(zhuǎn)化的細胞”包括原代受試者細胞和來源于其的培養(yǎng)物，而不考慮轉(zhuǎn)移數(shù)。還理解，由于有意或無意的突變，所有的后代的DNA內(nèi)容物可能不精確一致。包括具有與在最初轉(zhuǎn)化的細胞中篩選的功能或生物學(xué)活性相同的功能或生物學(xué)活性的變體后代。在NSO細胞中的表達記述在，例如，Barnes, L. Μ.，等，細胞技術(shù)學(xué) (Cytotechnology) 32 (2000) 109-123 ；Barnes, L. Μ.，等，生物技術(shù)和生物工程(Biotech. Bioeng. )73(2001)261-270中。瞬時表達記述在，例如，Durocher，Y.，等，核酸研究(Nuc 1. Acids. Res.) 30 (2002) E9中?？勺兘Y(jié)構(gòu)域的克隆記述在Orlandi，R.，等，美國國家科學(xué)院學(xué)報(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 86 (1989) 3833-3837 ；Carter, P.，等，美國國家科學(xué)院學(xué)報(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 89 (1992) 4285-4289 ；和 Norderhaug，L.，等，免疫學(xué)方法雜志(J. Immunol. Method) 204 (1997) 77-87中。優(yōu)選的瞬時表達系統(tǒng)(HEK四3)記述在 Schlaeger, E. -J.，和 Christensen, K.，細胞技術(shù)學(xué)(Cytotechnology) 30 (1999) 71-83 中和 Schlaeger, E. -J.，免疫學(xué)方法雜志(J. Immunol. Methods) 194 (1996) 191-199 中。適合用于原核生物的控制序列，例如包括啟動子，任選地操縱子序列，和核糖體結(jié)合位點。已知真核細胞利用啟動子、增強子和多腺苷酸化信號。當(dāng)核酸在被置于與另一個核酸序列的功能關(guān)系中時，其是“可操作地連接的”。例如，前序列(pre-sequence)或分泌前導(dǎo)序列的DNA與多肽的DNA可操作地連接，條件是其表達為參與多肽分泌的前蛋白(pre-protein)；啟動子或增強子與編碼序列可操作地連接，條件是其影響序列的轉(zhuǎn)錄；或核糖體結(jié)合位點與編碼序列可操作地連接，條件是其被定位為促進翻譯。一般地，“可操作地連接的”意指被連接的DNA序列是連續(xù)的，且在分泌前導(dǎo)序列的情形中，是連續(xù)的且在閱讀框中。然而，增強子不必須是連續(xù)的。連接通過在方便的限制性位點處的連接來實現(xiàn)。如果不存在這樣的位點，則根據(jù)常規(guī)實踐使用合成的寡核苷酸適體或接頭。通過標準技術(shù)，包括堿/SDS處理，CsCl分級(CsCl banding)，柱層析法，瓊脂糖凝膠電泳，和其它本領(lǐng)域公知的技術(shù)，進行抗體的純化從而消除細胞成分或其它污染物，例如其它細胞核酸或蛋白。見Ausubel，F(xiàn).，等，編，現(xiàn)代分子生物學(xué)方法(Current Protocols in Molecular Biology), Greene Publishing 禾口 Wiley Interscience, (1987)。不同的方法是充分建立的并且廣泛用于蛋白純化，如用微生物蛋白進行的親和層析法(例如，蛋白質(zhì)A或蛋白質(zhì)G親和層析法)，離子交換層析法(例如陽離子交換(羧甲基樹脂)，陰離子交換(氨基乙基樹脂)和混合模式的交換)，親硫吸附(例如，用巰基乙醇和其它SH 配體)，疏水相互作用或芳香吸附層析法(例如用苯基-瓊脂糖、氮雜-arenophilic樹脂， 或間-氨基苯基硼酸)，金屬螯合親和層析法(例如用Ni (II)-和Cu(II)-親和性材料)，
28大小排阻層析法和電泳方法(如凝膠電泳，毛細管電泳)(VijayalakshmLM.，Α.，應(yīng)用生物化學(xué)生物技術(shù)(App 1. Biochem. Biotech.) 75 (1998) 93-102)。用于本文時，表述“細胞”、“細胞系”和“細胞培養(yǎng)物”可互換使用，且全部這些名稱都包括后代。因此，詞語“轉(zhuǎn)化體”和“轉(zhuǎn)化的細胞”包括原代受試者細胞和來源于其的培養(yǎng)物，而不考慮轉(zhuǎn)移數(shù)。還理解，由于有意或無意的突變，所有的后代的DNA內(nèi)容物可能不精確一致。包括具有與在最初轉(zhuǎn)化的細胞中篩選的功能或生物學(xué)活性相同的功能或生物學(xué)活性的變體后代。在需要不同命名的情形中，其將從上下文中變得清楚。術(shù)語“轉(zhuǎn)化”用于本文中時，指將載體/核酸轉(zhuǎn)移到宿主細胞中的過程。如果將不具有難以克服的細胞壁屏障的細胞用作宿主細胞，則轉(zhuǎn)染例如通過如Graham，F(xiàn). L.，和 van der Eb, A.J.，Virology (病毒學(xué))52 (1973) 456-467所述的磷酸鈣沉淀法來進行。然而，還可以使用其他將DNA引入細胞的方法，諸如通過核注射或通過原生質(zhì)體融合。如果使用原核細胞或包含實質(zhì)細胞壁結(jié)構(gòu)的細胞，例如一種轉(zhuǎn)染方法是利用氯化鈣的鈣處理，如 Cohen, S.，N，等，PNAS (美國科學(xué)院學(xué)報)· 69 (1972) 2110-2114 所述。用于本文中時，“表達”指將核酸轉(zhuǎn)錄為mRNA的過程和/或?qū)⑥D(zhuǎn)錄的mRNA(也稱為轉(zhuǎn)錄物)隨后翻譯為肽、多肽或蛋白質(zhì)的過程。轉(zhuǎn)錄物和所編碼的多肽共同稱為基因產(chǎn)物。 如果多核苷酸源自基因組DNA，則在真核細胞中的表達可以包括mRNA的剪接?！拜d體”是一種核酸分子，特別是自體復(fù)制的，其將插入的核酸分子轉(zhuǎn)移到宿主細胞之中和/或之間。該術(shù)語包括主要功能為將DNA或RNA插入細胞(例如，染色體整合) 的載體，主要功能是復(fù)制DNA或RNA的復(fù)制載體，和功能是轉(zhuǎn)錄和/或翻譯DNA或RNA的表達載體。還包括提供多于一種上述功能的載體?！氨磉_載體”是一種多核苷酸，其在引入到合適的宿主細胞中時能夠被轉(zhuǎn)錄和翻譯為多肽?！氨磉_系統(tǒng)”通常指包括表達載體的適當(dāng)宿主細胞，所述表達載體可以起作用產(chǎn)生所需的表達產(chǎn)物。藥物組合物本發(fā)明的一個方面是包含本發(fā)明所述的抗體的藥物組合物。本發(fā)明的另一個方面是本發(fā)明所述的抗體用于制備藥物組合物的應(yīng)用。本發(fā)明的另一個方面是制備包含本發(fā)明所述的抗體的藥物組合物的方法。在另一個方面中，本發(fā)明提供一種組合物，例如，一種藥物組合物，其包含本發(fā)明所述的抗體，本發(fā)明所述的抗體與藥物載體一起配制。本發(fā)明的一個實施方案是用于治療癌癥的本發(fā)明所述的雙特異性抗體。本發(fā)明的另一個方面是用于治療癌癥的所述藥物組合物。本發(fā)明的另一個方面是本發(fā)明所述的抗體用于制備用于治療癌癥的藥物的應(yīng)用。本發(fā)明的另一個方面是治療患有癌癥的患者的方法，其通過向需要所述治療的患者施用本發(fā)明所述的抗體進行。當(dāng)用于本文時，“藥物載體”意在包括生理相容的任何和所有的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。優(yōu)選地，所述載體適于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、 腸胃外、脊髓或表皮施用(例如，通過注射或輸注)。本發(fā)明的組合物可以通過多種本領(lǐng)域已知的方法施用。如技術(shù)人員清楚地，施用的路徑和/或方式將根據(jù)需要的結(jié)果變化。為了通過某些施用路徑施用本發(fā)明的化合物， 可能需要用防止其失活的材料包被所述化合物，或使所述化合物與防止其失活的材料共同
29施用。例如，所述化合物可以在適合的載體中施用于受試者，所述載體例如是脂質(zhì)體或稀釋劑。藥用稀釋劑包括鹽水和水性緩沖溶液。藥物載體包括無菌水溶液或分散體和用于即時制備無菌可注射溶液或分散體的無菌粉末。這些介質(zhì)和藥劑用于藥物活性物質(zhì)是本領(lǐng)域已知的。措辭“腸胃外施用”和“腸胃外地施用”用于本文時意為除了腸和局部施用之外的施用方式，通常通過注射施用，并且包括，但不限于，靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眼內(nèi)、心內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、角質(zhì)下(subcuticular)、關(guān)節(jié)內(nèi)、囊下、蛛網(wǎng)膜下、脊內(nèi)、硬膜外和胸骨內(nèi)注射和輸注。術(shù)語癌癥用于本文時指增生性疾病，如淋巴瘤(lymphomas)，淋巴細胞白血病 (lymphocytic leukemias),月市癌(lung cancer),非小細胞肺(NSCL)癌(non small cell lung (NSCL) cancer)，支氣管月市泡細胞月市癌(bronchioloalviolar cell lung cancer),骨
(bone cancer)，月夷—(pancreatic cancer)，1 月夫· (skin cancer), ^JlKSIilS (cancer of the head or neck)，夫 $ 目艮內(nèi) 11 ;) (cutaneous or intraocular melanoma)，〒宮癌(uterine cancer)，卵巢癌(ovarian cancer)，直腸癌(rectal cancer),月工區(qū)癌(cancer of the anal region)，胃· (stomach cancer), (gastric cancer),(colon
cancer)，乳腺癌(breast cancer)，子宮癌(uterine cancer)，輸卵管癌(carcinoma of the fallopian tubes),子宮內(nèi)膜癌(carcinoma of the endometrium),子宮頸癌 (carcinoma of the cervix)，陰道癌(carcinoma of the vagina),夕卜陰癌(carcinoma of the vulva)，霍奇金病(Hodgkin' s Disease)，食管癌(cancer of the esophagus), 小腸癌(cancer of the small intestine),內(nèi)分泌系統(tǒng)癌(cancer of the endocrine system)，甲狀腺癌(cancer of the thyroid gland)，甲狀旁腺癌(cancer of the parathyroid gland)，l^f Jl—(cancer of the adrenal gland), ^kM^Rf^j^ (sarcoma of soft tissue),尿道癌(cancer of the urethra)，陰蓮癌(cancer of the penis),前列腺癌(prostate cancer),膀胱癌(cancer of thebladder),腎癌或輸尿管癌(cancer of the kidney or ureter),腎細胞癌(renal cell carcinoma),腎盂癌(carcinoma of the renal pelvis),間皮瘤(mesothelioma),肝細胞癌(hepatocellular cancer),膽管癌(biliary cancer),中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)月中瘤(neoplasms of the central nervous system(CNS)), 脊椎軸腫瘤(spinal axis tumors)，腦干膠質(zhì)瘤(brain stem glioma)，多形性成膠質(zhì)細胞瘤(glioblastoma multiforme),星形細胞瘤(astrocytomas),神經(jīng)鞘瘤(schwanomas), 室管膜瘤(印endymonas)，成髓細胞瘤(medulloblastomas)，腦膜瘤(meningiomas)，鱗狀細胞癌(squamous cell carcinomas),垂體腺瘤(pituitary adenoma),禾口埃文斯肉瘤 (Ewings sarcoma)，包括任一種上述癌癥的難治性形式，或一種或多種上述癌癥的組合。本發(fā)明的另一方面是作為抗-血管生成劑的本發(fā)明所述的雙特異性抗體或所述藥物組合物。這種抗-血管生成劑可用于治療癌癥(特別是實體瘤)和其它血管疾病。本發(fā)明的一個實施方案是用于治療血管疾病的本發(fā)明所述的雙特異性抗體。本發(fā)明的另一方面是本發(fā)明所述的抗體用于制備用于治療血管疾病的藥物的應(yīng)用。本發(fā)明的另一方面是治療患有血管疾病的患者的方法，其通過向需要這種治療的患者施用本發(fā)明所述的抗體進行。
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術(shù)語“血管疾病(vascular diseases) ”包括癌癥(Cancer)，炎癥疾病 (Inflammatory diseases),云力脈粥樣硬化(Atherosclerosis), iE^iil (Ischemia),倉丨J傷 (Trauma)，膿毒癥(S印sis)，COPD,哮喘(Asthma)，糖尿病(Diabetes)，AMD,視網(wǎng)膜病 (Retinopathy)，中風(fēng)(Stroke)，肥胖(Adipositas)，急性肺損傷(Acute lung injury)， 出血(Hemorrhage)，血管滲漏(Vascular leak)(例如細胞因子誘導(dǎo)的血管滲漏)，變態(tài)反應(yīng)(Allergy)，格雷夫斯病(Graves，Disease)，橋本自身免疫性甲狀腺炎(Hashimoto，s Autoimmune Thyroiditis),{4 (Idiopathic Thrombocytopenic Purpura)，巨細胞動脈炎(Giant Cell Arteritis)，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis)，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic Lupus Erythematosus (SLE))，狼瘡性腎炎(Lupus N印hritis)，局限性回腸炎(Crohn，s Disease)，多發(fā)性硬化(Multiple Sclerosis), 潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative Colitis)，特別是實體瘤，眼內(nèi)新血管綜合征(intraocular neovascular syndrome) i者如 ±曾殖性視網(wǎng)月莫病(proliferative retinopathies)或年齡相關(guān)的黃斑變性(age-related macular degeneration) (AMD)，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 (rheumatoid arthritis)禾口銀屑病(psoriasis) (Folkman, J.，等，J. Biol. Chem.(生物化學(xué)雜志)267 (1992) 10931-10934 ；Klagsbrun, Μ.，等，Annu. Rev. Physiol.(生理學(xué)年度綜述)53 (1991) 217-239 ；和 Garner，Α.，Vascular diseases (血管疾病)，在Pathobiology of ocular disease, A dynamic approach (目艮禾斗疾病，艮口動力學(xué)途徑的病理學(xué))，Garner, A.，和 Klintworth，G. K，(編)第 2 版，Marcel Dekker，紐約(1994) 1625-1710)。這些組合物還可以包含輔藥如防腐劑、濕潤劑、乳化劑和分散劑。防止微生物的存在可以通過滅菌方法(見上文)和通過包含各種抗細菌和抗真菌藥劑來確保，所述抗細菌和抗真菌藥劑例如對羥基苯甲酸酯類、氯丁醇、苯酚、山梨酸等?？赡苄枰诮M合物中包含等滲劑，如糖、氯化鈉等。此外，可以通過包含延緩吸附的試劑如單硬脂酸鋁和明膠來導(dǎo)致可注射藥物形式的延長的吸收。不管所選擇的施用路徑為何，通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方式，將可以以適合的水合形式使用的本發(fā)明的化合物、和/或本發(fā)明的藥物組合物配制成藥用劑型。在本發(fā)明的藥物組合物中的活性成分的實際劑量水平可以變化從而獲得這樣的活性成分的量，其對于特定的患者、組合物和施用方式有效獲得需要的治療反應(yīng)，而不會對患者具有毒性。選定的劑量水平將取決于多種藥物代謝動力學(xué)因素，包括所用的本發(fā)明的特定組合物的活性、施用路徑、施用時間、使用的特定化合物的排泄速率、治療的延續(xù)時間、 與所用的特定組合物組合使用的其它藥物、化合物和/或材料、待治療的患者的年齡、性別、體重、病癥、一般健康和以前的醫(yī)療病史，以及醫(yī)療領(lǐng)域中公知的類似因素。所述組合物必需是無菌和可流動的，到所述組合物可通過注射器遞送的程度。除了水之外，所述載體優(yōu)選地是等滲緩沖的鹽水溶液。適當(dāng)?shù)牧鲃有钥梢岳缤ㄟ^使用涂層如磷脂酰膽堿(lecithin)，在分散體的情形中通過維持需要的顆粒大小，和通過使用表面活性劑來維持。在許多情形中，優(yōu)選在所述組合物中包括等滲劑，例如，糖、多元醇如甘露醇或山梨醇、和氯化鈉?，F(xiàn)在已經(jīng)可見，本發(fā)明所述的針對人ErbB-I和人c_Met的雙特異性抗體具有有價值的特征，諸如生物學(xué)或藥理學(xué)活性。提供下述實施例、序列表和附圖來輔助理解本發(fā)明，本發(fā)明的真正范圍在后附的
31權(quán)利要求書中描述。應(yīng)該理解，在不背離本發(fā)明的精神的前提下，可以在所述的方法中進行 修改。氨基酸序列描述SEQ ID NO 1重鏈可變結(jié)構(gòu)域<ErbB_l>西妥昔單抗SEQ ID NO 2輕鏈可變結(jié)構(gòu)域<ErbB_l>西妥昔單抗SEQ ID NO 3重鏈可變結(jié)構(gòu)域<ErbB_l>人源化ICR62SEQ ID NO 4輕鏈可變結(jié)構(gòu)域<ErbB_l>人源化ICR62SEQ ID NO 5 重鏈可變結(jié)構(gòu)域 <c_Met>Mab 5D5SEQ ID NO 6 輕鏈可變結(jié)構(gòu)域 <c_Met>Mab 5D5SEQ ID NO 7 重鏈 <c_Met>Mab 5D5SEQ ID NO 8 輕鏈 <c_Met>Mab 5D5SEQ ID NO 9 重鏈 <c_Met>Fab 5D5SEQ ID NO :10 輕鏈 <c_Met>Fab 5D5SEQ ID NO :11人IgGl的重鏈恒定區(qū)SEQ ID NO 12人IgG3的重鏈恒定區(qū)SEQ ID NO: 13人輕鏈k恒定區(qū)SEQ ID NO: 14人輕鏈\恒定區(qū)SEQ ID NO 15 人 c-MetSEQ ID NO: 16 人 ErbB-ISEQ ID NO 17 重鏈 CDR3H，<ErbB_l> 西妥昔單抗SEQ ID NO 18 重鏈 CDR2H，<ErbB_l> 西妥昔單抗SEQ ID NO 19 重鏈 CDR1H，<ErbB_l> 西妥昔單抗SEQ ID NO 20 輕鏈 CDR3L，<ErbB_l> 西妥昔單抗SEQ ID NO 21 輕鏈 CDR2L，<ErbB_l> 西妥昔單抗SEQ ID NO 22 輕鏈 CDR1L，<ErbB_l> 西妥昔單抗SEQ ID NO 23 重鏈 CDR3H, <ErbB_l> 人源化 ICR62SEQ ID NO 24 重鏈 CDR2H, <ErbB_l> 人源化 ICR62SEQ ID NO 25 重鏈 CDR1H，<ErbB_l> 人源化 ICR62SEQ ID NO 26 輕鏈 CDR3L, <ErbB_l> 人源化 ICR62SEQ ID NO 27 輕鏈 CDR2L, <ErbB_l> 人源化 ICR62SEQ ID NO 28 輕鏈 CDR1L，<ErbB_l> 人源化 ICR62SEQ ID NO 29 重鏈 CDR3H，<c_Met>Mab 5D5SEQ ID NO :30 重鏈 CDR2H，<c_Met>Mab 5D5SEQ ID NO :31 重鏈 CDR1H，<c_Met>Mab 5D5SEQ ID NO :32 輕鏈 CDR3L，<c_Met>Mab 5D5SEQ ID NO :33 輕鏈 CDR2L，<c_Met>Mab 5D5SEQ ID NO :34 輕鏈 CDR1L, <c_Met>Mab 5D5附圖描述圖1特異性結(jié)合第一抗原1的不具有CH4結(jié)構(gòu)域的全長抗體的示意性結(jié)構(gòu)，所述全長抗體具有以典型順序包含可變結(jié)構(gòu)域和恒定結(jié)構(gòu)域的兩對重鏈和輕鏈。圖加-c 二價雙特異性<ErbB-l/c-Met>抗體的示意性結(jié)構(gòu)，所述抗體包含a)特異性結(jié)合人ErbB-I的全長抗體的輕鏈和重鏈；和b)特異性結(jié)合人c-Met的全長抗體的輕鏈和重鏈，其中恒定結(jié)構(gòu)域CL和CHl、和/或可變結(jié)構(gòu)域VL和VH相互替換，其用凸起-進入-孔洞技術(shù)修飾。圖3本發(fā)明所述的三價雙特異性<ErbB-l/c-Met>抗體示意圖，所述抗體包含特異性結(jié)合ErbB-I的全長抗體，對其a)圖3a 融合兩個多肽VH和VL (這兩個多肽的VH和VL結(jié)構(gòu)域一起形成特異性結(jié)合c-Met的抗原結(jié)合位點)；b)圖北融合兩個多肽VH-CHl和VL-CL (這兩個多肽的VH和VL結(jié)構(gòu)域一起形成特異性結(jié)合c-Met的抗原結(jié)合位點)；圖3c 具有“凸起和孔洞”的本發(fā)明所述的三價雙特異性抗體的示意圖，所述抗體包含特異性結(jié)合ErbB-I的全長抗體，對其融合兩個多肽VH和VL (這兩個多肽的VH和VL 結(jié)構(gòu)域一起形成特異性結(jié)合c-Met的抗原結(jié)合位點)；圖3d 具有“凸起和孔洞”的本發(fā)明所述的三價雙特異性抗體示意圖，所述抗體包含特異性結(jié)合ErbB-I的全長抗體，對其融合兩個多肽VH和VL (這兩個多肽的VH和VL結(jié)構(gòu)域一起形成特異性結(jié)合c-Met的抗原結(jié)合位點，其中這些VH和VL結(jié)構(gòu)域包含在位置VH44 和VL100之間的鏈間二硫鍵)。圖44a 四種可能的單鏈Fab片段的示意性結(jié)構(gòu)；4b 兩種單鏈Fv片段的示意性結(jié)構(gòu)。圖5三價雙特異性<ErbB-l/c-Met>抗體的示意性結(jié)構(gòu)，所述抗體包含全長抗體和一個單鏈Fab片段(圖5a)或一個單鏈Fv片段(圖恥)-具有凸起和孔洞的雙特異性三價實例圖6四價雙特異性<ErbB-l/c-Met>抗體的示意性結(jié)構(gòu)，所述抗體包含全長抗體和兩個單鏈Fab片段(圖6a)或兩個單鏈Fv片段(圖6b) -c-Met結(jié)合位點來源于抑制c_Met 二聚化的抗體。圖7a在鱗狀細胞癌細胞系A(chǔ)431中ErbBl/2/3和c_Met的細胞表面表達的流式細胞術(shù)分析。圖7b在卵巢癌細胞系0VCAR-8中ErbBl/2/3和c_Met的細胞表面表達的流式細胞術(shù)分析。圖fe在癌細胞系A(chǔ)431中的增殖測定-與單特異性親本<HER1>和<C_Met>抗體相比較，本發(fā)明所述的雙特異性<HERl/c-Met>抗體BsABOl (BsAb)對癌細胞增殖的抑制。圖8b存在HGF時，癌細胞系A(chǔ)431中的增殖測定-與單特異性親本<HER1>和 <c-Met>抗體相比較，本發(fā)明所述的雙特異性<HERl/c-Met>抗體BsABOl (BsAb)對癌細胞增殖的抑制。圖9在0，30，60和120分鐘(=0，0. 5，1，和2小時)測量的0VCAR-8癌細胞中的內(nèi)在化測定。圖IOa 0VCAR-8癌細胞中的增殖測定。與單特異性親本<HER1>和<c_Met>抗體相比較，本發(fā)明所述的雙特異性<HERl/c-Met>抗體BsABOl (BsAb)對癌細胞增殖的抑制。
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圖IOb存在HGF時，在癌細胞系A(chǔ)431中的增殖測定。與單特異性親本<HER1>和 <c-Met>抗體相比較，本發(fā)明所述的雙特異性<HERl/c-Met>抗體BsABOl (BsAb)對癌細胞增殖的抑制。實驗方法
實施例材料和方法重組DNA技術(shù)使用標準方法操作 DNA，如 Sambrook，J.等，Molecular cloning :Alaboratory manual (分子克隆實驗室手冊)；Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港實驗室出版社)，Cold Spring Harbor (冷泉港)，紐約，1989中所述。分子生物學(xué)試劑按照供應(yīng)商的使用說明使用。DNA和蛋白序列分析和序列數(shù)據(jù)管理關(guān)于人免疫球蛋白輕鏈和重鏈的核苷酸序列的通用信息在Kabat，Ε.，Α.，等， (1991) : 目的的歹I」(Sequences of Proteins of Immunological Interest), 第五版，NIH出版號91-3242中提供。抗體鏈的氨基酸按照EU編號進行編號(Edelman， G.M.，等，PNAS 63(1969)78-85 ；Kabat, Ε. A.，等，(1991)免疫目的的蛋白質(zhì)序列 (Sequences of Proteins of Immunological Interest),第五版，NIH 出版號 91-3242)。 GCG (Genetics Computer Group (遺傳學(xué)計算小組)，Madison，威斯康星)的軟件包版本 10. 2禾口 Infomax載體NTl 進展組版本8. O (Infomax’ s Vector NTI Advance suite version 8. 0)用于序列構(gòu)建、作圖、分析、注解和說明。DNA 測序DNA序列通過在 SequiServe (Vaterstetten,德國)禾口 Geneart AG (Regensburg,德國)進行的雙鏈測序來確定?；蚝铣伤杌騾^(qū)段由Geneart AG (Regensburg，德國)從化學(xué)合成的寡核苷酸和通過自動化基因合成的PCR產(chǎn)物來制備。將側(cè)鄰單個限制性內(nèi)切核酸酶裂解位點的基因區(qū)段克隆到pGA18 (ampR)質(zhì)粒中。從轉(zhuǎn)化的細菌純化質(zhì)粒DNA，并且通過UV光譜法確定濃度。亞克隆基因片段的DNA序列通過DNA測序驗證。以相似的方式，通過基因合成制備編碼在CH3 結(jié)構(gòu)域中攜帶S3MC和T366W突變的修飾的“凸起-進入-孔洞” <ErbB-l>抗體重鏈(其有/無由肽連接體連接的C-端<c-Met>5D5 scFab VH區(qū))的DNA序列和編碼攜帶TO49C， T366S，L368A和Y407V突變的修飾的“凸起-進入-孔洞” <ErbB_l>抗體重鏈(其有/無由肽連接體連接的C-端<c-Met>5D5 scFab VL區(qū))的DNA序列，所述DNA序列具有側(cè)連的 BamHI和)(bal限制性位點。最后，合成編碼<ErbB_l>抗體和<c_Met>5D5抗體的未修飾的重鏈和輕鏈的DNA序列，所述DNA序列具有側(cè)連的BamHI和)(baI限制性位點。將所有的構(gòu)建體設(shè)計具有編碼前導(dǎo)肽(MGWSCIILFLVATATGVHS)的5’ -端DNA序列，所述前導(dǎo)肽靶向用以在真核細胞中分泌的蛋白。構(gòu)建表達質(zhì)粒將Roche表達載體用于構(gòu)建所有編碼重鏈和輕鏈scFv融合蛋白的表達質(zhì)粒。所
34述載體包括下述元件-作為選擇標記的潮霉素抗性基因，-埃巴病毒(EBV)的復(fù)制起點，oriP，-來自載體pUC18的復(fù)制起點，其允許該質(zhì)粒在大腸桿菌中復(fù)制，-β-內(nèi)酰胺酶基因，其賦予大腸桿菌氨芐青霉素抗性，-來自人巨細胞病毒(HCMV)的即時早期增強子和啟動子，-人1-免疫球蛋白聚腺苷酸化(“聚Α”)信號序列，和-特有的BamHI和)(baI限制性位點。如所描述的，通過基因合成制備免疫球蛋白融合基因，其包含重鏈或輕鏈構(gòu)建體以及具有C端VH和VL結(jié)構(gòu)域的“凸起-進入-孔洞”構(gòu)建體，將該融合基因克隆進入 pGA18 (ampR)質(zhì)粒。帶有合成的DNA區(qū)段和Roche表達載體的pG18(ampR)質(zhì)粒用BamHI 和)(bal限制性酶(Roche Molecular Biochemicals)消化并進行瓊脂糖凝膠電泳。然后將純化的重鏈和輕鏈編碼DNA區(qū)段連接到分離的Roche表達載體BamHlAbaI片段，產(chǎn)生最終表達載體。將最終表達載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌細胞中，分離表達質(zhì)粒DNA (Minipr印)并進行限制性酶分析和DNA測序。正確的克隆在150mlLB-Amp培養(yǎng)基中生長，再次分離質(zhì)粒 DNA(Maxiprep)并通過DNA測序確認序列完整性。免疫球蛋白變體在HEK293細胞中的瞬時表達根據(jù)供應(yīng)商的說明書，使用Fre必tyle 293表達系統(tǒng)(Invitrogen，USA) 通過人胚腎^3-F細胞的瞬時轉(zhuǎn)染來表達重組免疫球蛋白變體。簡言之，將混懸的 Freestyle 293-F細胞在FreeMyle 293表達培養(yǎng)基中在37°C /8% CO2進行培養(yǎng)，并在轉(zhuǎn)染當(dāng)天將細胞以1-2χ106個活細胞/ml的密度接種在新鮮的培養(yǎng)基中。使用325μ 1 的^3fectin (Invitrogen，德國)和250 μ g 1 1摩爾比率的重鏈和輕鏈質(zhì)粒DNA在 Opti-MEM I培養(yǎng)基(Invitrogen，USA)中制備DNA-293fectin 復(fù)合物，最終轉(zhuǎn)染體積為250ml?！巴蛊?進入-孔洞"DNA-293feCtin復(fù)合物如下制備在Opti-MEM I培養(yǎng)基 (Invitrogen，USA)中使用 325μ 1 的293fectin (Invitrogen，德國)和 250μ g的 1 :1:2 摩爾比的“凸起-進入-孔洞”重鏈1和2和輕鏈質(zhì)粒DNA(最終轉(zhuǎn)染體積250ml)制備。在轉(zhuǎn)染后7天，通過以14000g離心30分鐘并通過無菌濾器(0. 22 μ m)過濾收獲包含抗體的細胞培養(yǎng)物上清液。將上清液貯存在_20°C直到純化。雙特異性抗體和對照抗體的純化使用蛋白質(zhì)A-S印harose (GE Healthcare，瑞典)和Superdex200大小排阻層析法，通過親和層析法從細胞培養(yǎng)物上清液中純化三價雙特異性抗體和對照抗體。簡言之，將無菌過濾的細胞培養(yǎng)物上清液應(yīng)用到用PBS緩沖液(IOmM Na2HPO4, ImM KH2PO4,137mM NaCl 和2.7mM KCl, pH7. 4)平衡的HiTrap蛋白質(zhì)A HP(5ml)柱上。將未結(jié)合的蛋白用平衡緩沖液洗滌下來。抗體和抗體變體用PH 2.8的0. IM檸檬酸緩沖液洗脫，并且用pH 8. 5的 0. Iml IM Tris中和含有蛋白的級分。然后，匯聚洗脫的蛋白級分，將其用Amicon超離心過濾裝置(MWC0 :30K,Millipore)濃縮至3ml體積，并且上樣到用pH 6. 0的20mM Histidin, 140mM NaCl 平衡的 Superdex200 HiLoad 120ml 16/60 凝膠過濾柱(GE Healthcare，瑞典) 上。匯聚具有少于5%的高分子量聚集物的包含純化的雙特異性抗體和對照抗體的級分，并且以1. 0mg/ml的等分試樣保存在-80°C。通過木瓜蛋白酶消化純化的5D5單克隆抗體產(chǎn)生
35Fab片段，并且隨后通過蛋白質(zhì)A層析法去除污染的Fc結(jié)構(gòu)域。將未結(jié)合的Fab片段進一步在用 pH 6. 0 的 20mMHistidin，140mM NaCl 平衡的 Superdex200 HiLoad 120ml 16/60 凝膠過濾柱(GE Healthcare，瑞典)上純化，并且以1. Omg/ml的等分試樣保存在_80°C。純化的蛋白的分析利用基于氨基酸序列計算的摩爾消光系數(shù)，通過測量280nm的光密度(OD)，來確定純化的蛋白樣品的蛋白濃度。通過在存在和不存在還原劑(5mM 1，4-二硫蘇糖醇)條件下的SDS-PAGE并且用考馬斯亮藍染色，分析雙特異性抗體和對照抗體的純度和分子量。 按照供應(yīng)商的使用說明使用NuPAGE I^e-Cast凝膠系統(tǒng)(Invitrogen，USA) (4-20 % Tris-甘氨酸凝膠)。使用Superdex 200分析級大小排阻柱(GE Healthcare,瑞典)，在 200mMKH2P04,250mM KCl, pH 7. 0運行緩沖液中在25°C，通過高效SEC分析雙特異性抗體和對照抗體樣品的聚集物含量。將25 μ g蛋白以0. 5ml/分鐘的流速注射到柱上，并且在50 分鐘內(nèi)勻速(isocratic)洗脫。對于穩(wěn)定性分析，將濃度為lmg/ml的純化的蛋白在4°C 和40°C溫育7天，然后通過高效SEC評估。在通過用肽-N-糖苷酶F(Roche Molecular Biochemicals)酶處理去除N-聚糖后，通過納米電噴霧Q-TOF質(zhì)譜法驗證還原的雙特異性抗體輕鏈和重鏈的氨基酸骨架的完整性。c-Met磷酸化測定在HGF刺激前一天，將切1(^5個A549細胞接種在6孔板的每個孔中的具有0. 5% FCS(胎牛血清)的RPMI中。次日，用含有0.2% BSA(牛血清白蛋白)的RPMI替換生長培養(yǎng)基1小時。然后，向培養(yǎng)基中加入5 μ g/mL雙特異性抗體，并且將細胞溫育10分鐘， 對其加入HGF以50ng/mL的終濃度繼續(xù)10分鐘。將細胞用含有ImM釩酸鈉的冰冷PBS洗滌一次，將其置于冰上，在細胞培養(yǎng)板中用100 μ L裂解緩沖液(50mMTris-Cl pH7. 5，150mM NaCl, 1% NP40,0. 5% DOC, aprotinine, 0. 5mMPMSF, ImM 釩酸鈉)裂解。將細胞裂解物轉(zhuǎn)移到印pendorf管中，并且允許裂解在冰上繼續(xù)進行30分鐘。利用BCA法(Pierce)確定蛋白濃度。在4-12% Bis-Tris NuPage凝膠(Invitrogen)上分離30-50 μ g裂解物，并且將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到硝基纖維素膜上。將膜用含有5% BSA的TBS-T封閉1小時，并且用針對Y1230,1234，1235的磷-特異性c-Met抗體(44-888, Biosource)按照供應(yīng)商的使用說明進行顯色。免疫印跡用結(jié)合未磷酸化的c-Met的抗體(AF276，R&D)再次探測。ErbBl/Herl 磷酸化測定在加入抗體前一天，將hl0e5個A431細胞接種在6孔板的每個孔中的具有10% FCS (胎牛血清)的RPMI中。次日，向培養(yǎng)基中加入5 μ g/mL對照抗體或雙特異性抗體，并且將細胞再溫育1小時。將細胞用含有ImM釩酸鈉的冰冷PBS洗滌一次，將其置于冰上，在細胞培養(yǎng)板中用 100 μ L 裂解緩沖液(50mM Tris-Cl pH7. 5,150mM NaCl, 1% NP40,0. 5% DOC, aprotinine, 0. 5mM PMSF, ImM釩酸鈉)裂解。將細胞裂解物轉(zhuǎn)移到印pendorf管中， 并且允許裂解在冰上繼續(xù)進行30分鐘。利用BCA法(Pierce)確定蛋白濃度。在4-12% Bis-Tris Nul^age凝膠(Invitrogen)上分離30-50 μ g裂解物，并且將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到硝基纖維素膜上。將膜用含有5% BSA的TBS-T封閉1小時，并且用針對Y1173的磷-特異性EGFR抗體(sc-12351，Santa Cruz)按照供應(yīng)商的使用說明進行顯色。免疫印跡用結(jié)合未磷酸化的EGFR的抗體(06-847，Upstate)再次探測。AKT磷酸化測定
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在加入抗體前一天，將個A431細胞接種在6孔板的每個孔中的具有10% FCS (胎牛血清)的RPMI中。次日，向培養(yǎng)基中加入5 μ g/mL對照抗體或雙特異性抗體，并且將細胞再溫育1小時。然后，將細胞亞組用25ng/mL HGF(R&D, 294-HGN)刺激另外的15 分鐘。將細胞用含有ImM釩酸鈉的冰冷PBS洗滌一次，將其置于冰上，在細胞培養(yǎng)板中用 100 μ L 裂解緩沖液(50mM Tris-Cl pH7. 5,150mM NaCl, 1% NP40,0. 5% DOC, aprotinine, 0. 5mM PMSF, ImM釩酸鈉)裂解。將細胞裂解物轉(zhuǎn)移到印pendorf管中，并且允許裂解在冰上繼續(xù)進行30分鐘。利用BCA法(Pierce)確定蛋白濃度。在4-12 % Bis-Tris NuPage 凝膠(Irwitrogen)上分離30-50yg裂解物，并且將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到硝基纖維素膜上。將膜用含有5% BSA的TBS-T封閉1小時，并且用針對Thr308的磷-特異性AKT抗體 (Cell Signaling,9275)按照供應(yīng)商的使用說明進行顯色。免疫印跡用結(jié)合肌動蛋白的抗體(Abcam，ab20272)再次探測。ERK1/2磷酸化測定在加入抗體前一天，將hl0e5個A431細胞接種在6孔板的每個孔中的具有10% FCS (胎牛血清)的RPMI中。次日，向培養(yǎng)基中加入5 μ g/mL對照抗體或雙特異性抗體，并且將細胞再溫育1小時。然后，將細胞亞組用25ng/mL HGF(R&D, 294-HGN)刺激另外的15 分鐘。將細胞用含有ImM釩酸鈉的冰冷PBS洗滌一次，將其置于冰上，在細胞培養(yǎng)板中用 100 μ L 裂解緩沖液(50mM Tris-Cl pH7. 5,150mM NaCl, 1% NP40,0. 5% DOC, aprotinine, 0. 5mM PMSF, ImM釩酸鈉)裂解。將細胞裂解物轉(zhuǎn)移到印pendorf管中，并且允許裂解在冰上繼續(xù)進行30分鐘。利用BCA法(Pierce)確定蛋白濃度。在4-12% Bis-Tris NuI^age凝膠(Invitrogen)上分離30-50 μ g裂解物，并且將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到硝基纖維素膜上。將膜用含有5% BSA的TBS-T封閉1小時，并且用針對Thr202/Tyr204的磷-特異性Erkl/2 抗體(CellSignaling，Nr.9106)按照供應(yīng)商的使用說明進行顯色。免疫印跡用結(jié)合肌動蛋白的抗體(Abcam，ab20272)再次探測。細胞-細胞散布測定(分散測定)在化合物處理前一天，將A549 (4000個細胞/孔)或A431 (8000個細胞/孔)以 200 μ L的總體積接種在96孔E-板(Roche, 05232368001)中的具有0. 5 % FCS的RPMI中。 貼壁和細胞生長用實時細胞分析儀機器監(jiān)測過夜，每15分鐘掃描(swe印s)監(jiān)測阻抗。次日，將細胞用5 μ L在PBS中的各自抗體稀釋液預(yù)先溫育，每5分鐘掃描。30分鐘后，加入產(chǎn)生20ng/mL終濃度的2，5 μ L的HGF溶液，并且允許實驗再繼續(xù)進行72小時。每分鐘掃描持續(xù)180分鐘監(jiān)測即時變化，然后其余的時間每15分鐘掃描。流式細胞術(shù)測定(FACS)a)結(jié)合測定解離并且計數(shù)c-Met和ErbB-Ι表達細胞。將1. 5xl0e5個細胞接種在錐形96孔平板的每個孔中。將細胞離心(1500rpm，4°C，5分鐘)并且在冰上在具有2% FCS(胎牛血清)的PBS中的50μ L各自的雙特異性抗體的系列稀釋液中溫育30分鐘。將細胞再次離心，并且用200 μ L含有2 % FCS的PBS洗滌一次，然后用針對人Fc的藻紅蛋白-偶聯(lián)的抗體第二次溫育30分鐘，所述藻紅蛋白-偶聯(lián)的抗體稀釋在含有2% FCS的PBS(Jackson Immunoresearch (杰克遜免疫研究)，109116098)中。將細胞離心，用200 μ L含有2% FCS 的PBS洗滌兩次，重懸在BD CellFix溶液(BD Biosciences (BD生物科學(xué)))中并且在冰上
37溫育至少10分鐘。通過流式細胞術(shù)(FACSCanto，BD)確定細胞的平均熒光強度(mfi)。至少進行重復(fù)的兩次獨立染色來確定Mfi。使用FlowJo軟件(Tre必tar)進一步處理流式細胞術(shù)光譜。使用XLFit 4. O (IDBS)和劑量反應(yīng)單位點模型(one site model) 205確定半最
大結(jié)合。b)內(nèi)在化測定解離并且計數(shù)細胞。將切10巧個細胞置于印？拙(10什管中的501^完全培養(yǎng)基中，并且在37°C用5μ g/mL各自的雙特異性抗體溫育。在溫育時間點后，將細胞保存在冰上，直到時間過程結(jié)束。然后，將細胞轉(zhuǎn)移到FACS管中，離心(1500rpm，4°C，5分鐘)，用 PBS+2% FCS洗滌，并且在50 μ L針對人Fc的藻紅蛋白-偶聯(lián)的二級抗體中溫育30分鐘， 所述二級抗體稀釋在含有2 % FCS的PBS (Jackson Immunoresearch (杰克遜免疫研究)， 109116098)中。將細胞再次離心，用PBS+2% FCS洗滌，并且通過流式細胞術(shù)(FACS Canto, BD)確定熒光強度。細胞滴定發(fā)光測定(CellTiter Glow Assay)使用細胞滴定發(fā)光測定(!Iomega)量化細胞存活力和增殖。該測定按照供應(yīng)商的使用說明進行。簡言之，將細胞在96孔板中以100 μ L的總體積培養(yǎng)所需要的時間期間。對于增殖測定，將細胞從溫箱中取出，并且置于室溫下30分鐘。加入100 μ L細胞滴定發(fā)光試劑，并且將多孔板放置在定軌搖床上2分鐘。15分鐘后在微量平板讀數(shù)儀(Tecan)上定量發(fā)光。Wst-I 測定進行Wst-I存活力和細胞增殖測定作為終點分析，以檢測代謝活性細胞的數(shù)目。 簡言之，向200 μ L培養(yǎng)基中加入20 μ L Wst-I試劑(Roche，11644807001)。將96孔板進一步溫育30分鐘-1小時，直到出現(xiàn)染料的強顯色。在微量平板讀數(shù)儀(Tecan)上在450nm 波長定量染色強度。設(shè)計雙特異性<ErbBl-c_Met>抗體所有下述表達的和純化的雙特異性<ErbBl-c-Met>抗體包括IgGl亞類的恒定區(qū)或至少Fc部分(SEQ ID NO 11的人恒定IgGl區(qū))，其最終按下述修飾。在表1中具有表1所示的各自的特征的基于全長ErbB-I抗體(西妥昔單抗或人源化ICR62)和來自c-Met抗體(cMet 5D5)的一個單鏈Fab片段(關(guān)于基本結(jié)構(gòu)圖見圖 5a)的三價雙特異性<ErbBl-c-Met>抗體按照上述通用方法表達和純化或可以按照上述通用方法表達和純化。在序列表中提供西妥昔單抗或人源化ICR62的相對應(yīng)的VH和VL。表1
權(quán)利要求
1.特異性結(jié)合人ErbB-I和人c-Met的雙特異性抗體，其包含特異性結(jié)合人ErbB-I的第一抗原結(jié)合位點和特異性結(jié)合人c-Met的第二抗原結(jié)合位點，其特征在于，當(dāng)在流式細胞術(shù)測定中在0VCAR-8細胞上2小時后測量時，與不存在所述雙特異性抗體時c-Met的內(nèi)在化相比較，所述雙特異性抗體顯示不超過15%的c-Met的內(nèi)在化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的雙特異性抗體，其特征在于是二價的或三價的，其包含特異性結(jié)合人ErbB-I的一個或兩個抗原結(jié)合位點和特異性結(jié)合人c-Met的第三抗原結(jié)合位點。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的抗體，其特征在于包含a)特異性結(jié)合ErbB-I并且由兩條抗體重鏈和兩條抗體輕鏈組成的全長抗體；和b)特異性結(jié)合人c-Met的一個單鏈Fab片段，其中b)中所述單鏈Fab片段通過肽連接體在所述全長抗體的重鏈或輕鏈的C-或N-末端融合到a)中所述全長抗體。
4.特異性結(jié)合人ErbB-I和人c-Met的雙特異性抗體，其包含特異性結(jié)合人ErbB-I的第一抗原結(jié)合位點和特異性結(jié)合人c-Met的第二抗原結(jié)合位點，其特征在于i)所述第一抗原結(jié)合位點在重鏈可變結(jié)構(gòu)域中包含SEQID NO :17的⑶R3H區(qū)，SEQ ID NO 18的⑶R2H區(qū)和SEQ ID NO 19的⑶RlH區(qū)，和在輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中包含SEQ ID NO 20 的 CDR3L 區(qū)，SEQ ID NO 21 的 CDR2L 區(qū)和 SEQ ID NO 58 的 CDRlL 區(qū)或 SEQ ID NO 22 的CDRlL區(qū)；和所述第二抗原結(jié)合位點在重鏈可變結(jié)構(gòu)域中包含SEQ ID N0:30的⑶R3H區(qū)，SEQ ID NO 31的⑶R2H區(qū)和SEQ ID NO 32的⑶RlH區(qū)，和在輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中包含SEQ ID NO 33 的 CDR3L 區(qū)，SEQ ID NO 34 的 CDR2L 區(qū)和 SEQ ID NO 35 的 CDRlL 區(qū)；ii)所述第一抗原結(jié)合位點在重鏈可變結(jié)構(gòu)域中包含SEQID N0:23的⑶R3H區(qū)，SEQ ID NO :24的CDR2H區(qū)和SEQ ID NO :25的CDRlH區(qū)，和在輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中包含SEQ ID NO: 26 的 CDR3L 區(qū)，SEQ ID NO 27 的 CDR2L 區(qū)和 SEQ ID NO 28 的 CDRlL 區(qū)或 SEQ ID NO 29 的CDRlL區(qū)；和所述第二抗原結(jié)合位點在重鏈可變結(jié)構(gòu)域中包含SEQ ID NO :30的⑶R3H區(qū)，SEQ ID NO :31的⑶R2H區(qū)和SEQ ID NO :32的⑶RlH區(qū)，和在輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中包含SEQ ID NO: 33 的 CDR3L 區(qū)，SEQ ID NO 34 的 CDR2L 區(qū)和 SEQ ID NO 35 的 CDRlL 區(qū)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的雙特異性抗體，其特征在于i)所述特異性結(jié)合ErbB-I的第一抗原結(jié)合位點包含作為重鏈可變結(jié)構(gòu)域的序列SEQ ID NO 1和作為輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的序列SEQ ID NO 2 ；和所述特異性結(jié)合c-Met的第二抗原結(jié)合位點包含作為重鏈可變結(jié)構(gòu)域的序列SEQ ID NO 5和作為輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的序列SEQ ID NO 6 ；或 )所述特異性結(jié)合ErbB-I的第一抗原結(jié)合位點包含作為重鏈可變結(jié)構(gòu)域的序列SEQ ID NO 3和作為輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的序列SEQ ID NO 4 ；和所述特異性結(jié)合c-Met的第二抗原結(jié)合位點包含作為重鏈可變結(jié)構(gòu)域的序列SEQ ID NO 5和作為輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的序列SEQ ID NO :6。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5的雙特異性抗體，其特征在于包含IgGl或IgG3亞類的恒定區(qū)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6的雙特異性抗體，其特征在于所述抗體在Asn297用糖鏈糖基化，其中所述糖鏈內(nèi)巖藻糖的量為65%以下。
8.編碼根據(jù)權(quán)利要求1至7的雙特異性抗體的核酸。
9.藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至7的雙特異性抗體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的藥物組合物，其用于治療癌癥。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至7的雙特異性抗體，其用于治療癌癥。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至7的雙特異性抗體在制備用于治療癌癥的藥物中的用途。
13.治療患有癌癥的患者的方法，其通過向需要這樣的治療的患者施用根據(jù)權(quán)利要求 1至7的雙特異性抗體進行。
全文摘要
本發(fā)明涉及針對人ErbB-1和針對人c-Met的雙特異性抗體，制備它們的方法，含有所述抗體的藥物組合物，及其用途。
文檔編號C07K16/28GK102361883SQ201080013459
公開日2012年2月22日 申請日期2010年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月7日
發(fā)明者烏爾里希·布林克曼, 于爾根·邁克爾·尚策, 克勞迪奧·祖斯特曼, 克里斯蒂安·克萊因, 巴勃羅·烏馬納, 格哈德·尼德費爾納, 比吉特·博森梅爾, 沃爾夫?qū)ぶx弗 申請人:羅氏格黎卡特股份公司