本發(fā)明屬于生物工程技術領域，涉及一種微生物電轉化的方法，具體涉及一種提高大腸桿菌電轉化陽性重組子獲取效率的方法。

背景技術：

電轉化技術應用于生物領域用于得到有一定功能的工程菌，是一種非常實用的技術。但是，轉化過程中存在轉化過程繁瑣，重組效率不高等問題，重組子篩選也存在篩選結果不準確的問題。影響重組率的因素眾多，同源臂長度、阿拉伯糖誘導濃度及時間、復蘇時間、溫度、轉化電壓等都會影響其轉化效率，而其中最主要的影響因素為同源臂長度、電轉化電壓及阿拉伯糖誘導濃度。在用常規(guī)方法進行重組子篩選過程中也會出現(xiàn)將假陽性重組子誤認為陽性的后果。

技術實現(xiàn)要素：

鑒于現(xiàn)有技術存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種提高大腸桿菌電轉化陽性重組子獲取效率的方法，從而解決現(xiàn)有的大腸桿菌電轉化效率低、篩選不準確的問題。

為解決上述問題，本發(fā)明采用以下技術方案來實現(xiàn)：

一種提高大腸桿菌電轉化陽性重組子獲取效率的方法，采用的步驟包括，

(1)含卡那霉素抗性基因的外源線性靶DNA片段的構建；

(2)大腸桿菌電轉化感受態(tài)細胞的制備；

(3)外源線性靶基因DNA片段與大腸桿菌電轉化感受態(tài)細胞基因整合；

(4)篩選大腸桿菌陽性重組子；

所述篩選大腸桿菌陽性重組子的鑒定引物包括正向引物和反向引物，

正向引物為：

purn-F：5′-CCCAGGAACACGCTATTTATCC-3′

ppx-R：5′-CATCTACCACACGGGCTATGAC-3′

反向引物為：

p-F：5′-TCTGCGTTACTGCCTTGATGAT-3′

p-R：5′-TAATCAATATTGCGCGTCATCC-3′。

所述步驟(1)構建時，用于擴增外源線性靶DNA片段的引物基因序列包括SEQ ID No.1所示上游引物F-Kan和SEQ ID No.2所示下游引物R-Kan。

5’-ATGGGTCAGGAAAAGCTATACATCGAAAAAGAGCTCAGTTGGTTATCGTTGCGATTGTGTAGGCTGGAG-3’

5’-TTATTCAGGTTGTTCGAGTGATTTGATGTAGTCGTAAATCGCCAACTGCGTAACGGCTGACATGGGAATTAG-3’

所述步驟(2)大腸桿菌電轉化感受態(tài)細胞的制備方法，包括以下步驟：

挑取大腸桿菌單菌落接種于液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)；

移接菌液于預熱的含氨芐霉素LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待OD600＝0.2～0.25時，加入L-阿拉伯糖，所述L-阿拉伯糖摩爾濃度為10-20mmol/L，待OD600＝0.5～0.6后轉移菌液于預冷的離心管冰浴、離心，棄上清液，用冰冷無菌水重懸沉淀；

沉淀后再次離心，棄上清液，凍存，即得到大腸桿菌感受態(tài)細胞。

優(yōu)選的，所述L-阿拉伯糖摩爾濃度為15mmol/L。

所述大腸桿菌為E.coli/pKD46。

所述步驟(3)包括以下步驟：

將外源線性靶基因DNA片段與大腸桿菌感受態(tài)細胞懸液混合后，預冷條件下進行脈沖電擊，脈沖電擊結束后，室溫下加入SOC液體培養(yǎng)基得到電轉液，篩選獲得含外源線性靶基因的大腸桿菌的陽性轉化子；

所述脈沖電擊條件為：電脈沖為25uF，電阻為200Ω，電壓為1.6-1.8kV。

優(yōu)選的，所述脈沖電擊電壓為1.8kV。

本發(fā)明的有益效果是：

(1)本發(fā)明根據待敲除目標基因序列兩端的互補序列設計的短臂同源序列范圍，使外源DNA片段更易與細菌染色體發(fā)生交換并重組。

(2)本發(fā)明提出的重組電轉化電壓，提高電轉化效率。

(3)本發(fā)明提出的誘導重組子生長的阿拉伯糖濃度范圍，在此合適范圍內更易得到大量陽性重組子。

(4)本發(fā)明設計正反向鑒定引物，對陽性重組子進行進一步鑒定，提高鑒定準確性。

附圖說明

圖1是外源目的DNA的PCR擴增譜圖；

圖2是重組菌株正向PCR驗證譜圖；

圖3是野生型菌株和重組菌株反向PCR驗證結果。

具體實施方式

下面結合附圖和具體實施方式對本發(fā)明進行詳細說明，不能認定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應當視為屬于本發(fā)明的保護范圍。

實施例1

本實施例提供一種提高大腸桿菌電轉化陽性重組子獲取效率的方法，包括大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備方法及含卡那霉素抗性基因的外源線性靶基因DNA片段的獲取方法，本發(fā)明設計了50bp的同源臂序列，構建含卡那霉素抗性基因的外源DNA片段。其次：以大腸桿菌ATCC25922為受體菌，制備感受態(tài)大腸桿菌E.coli/PKD46，其中，阿拉伯糖濃度為15mmol/L，最后將外源DNA片段導入大腸桿菌，其中電轉化電壓為1.8kV。

具體步驟如下(以敲除大腸桿菌ppk基因中，將外源基因DNA片段重組入大腸桿菌為例)：

1、含卡那霉素抗性基因的外源線性靶DNA片段的構建

對待敲除目標基因序列進行分析設計出用于擴增外源靶基因DNA片段的引物，其5′端為50bp待敲除目標基因ppk兩側的延伸短臂同源序列，3′端為20bp的用于擴增兩側帶有FRT標記的卡那霉素抗性基因。以pKD4質粒為模板，常規(guī)PCR方法擴增靶基因片段，產物片段長度約1600bp，膠回收后用于電轉化。

上游同源臂引物F-Kan(劃線部分為同源臂，是從起始密碼子開始的50bp的序列)：

5’-ATGGGTCAGGAAAAGCTATACATCGAAAAAGAGCTCAGTTGGTTATCGTTGCGATTGTGTAGGCTGGAG-3’

下游同源臂引物R-Kan(劃線部分為同源臂，是從終止密碼子向左的50bp的序列)：

5’-TTATTCAGGTTGTTCGAGTGATTTGATGTAGTCGTAAATCGCCAACTGCGTAACGGCTGACATGGGAATTAG-3’

以pKD4質粒為模板擴增靶基因DNA片段的反應體系和條件見表1。

PCR擴增條件：94℃預變性1min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，反應進行30個循環(huán)；72℃再延伸10min；4℃保溫至∞。

擴增完成后，1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。

表1 PCR反應體系

2、大腸桿菌(E.coli/pKD46)電轉化感受態(tài)細胞的制備

具體操作如下：

(a)從新鮮瓊脂板挑取大腸桿菌(E.coli/pKD46)單菌落接種于5mlLB液體培養(yǎng)基中30℃，170rpm過夜培養(yǎng)16小時；

(b)按1:50移接菌液于50ml預熱的含氨芐霉素(60ug/ml)LB培養(yǎng)基中，30℃，220rpm培養(yǎng)，每隔30min測定其OD600值，待OD600＝0.2～0.25時，加入L-阿拉伯糖，使之終濃度分別為5mmol/L、、15mmol/L、30mmol/L、50mmol/L誘導培養(yǎng)約1h，使其OD600＝0.5～0.6；

(c)當OD₆₀₀＝0.5～0.6時，轉移20ml菌液于50ml預冷的離心管后，迅速將離心管冰浴30min，不時緩慢搖勻以保證內容物充分冷卻，為下一步準備；

(d)4℃，4300rpm離心15min，以回收細胞，棄上清，用40ml冰冷無菌水重懸沉淀；

(e)4℃，4300rpm離心20min，以回收細胞，棄上清，用25ml冰冷10％除菌甘油重懸沉淀兩次；

(f)加入1ml冰冷的10％除菌甘油重懸后，分裝于1.5ml滅的Eppendorf離心管中，每管100ul；

(h)凍存于-70℃冰箱中。使用前室溫下待融解后將管轉移至冰上。

3、外源線性靶基因DNA片段整合到大腸桿菌野生菌基因組

具體操作如下：

(a)以8～10ul的體積向每個含有E.coli/pKD46感受態(tài)細胞的離心管中加入約100ng構建好的外源線性靶基因DNA片段，置于冰上3～5min；

(b)調節(jié)電轉化儀，使電脈沖為25uF，電阻為200Ω、電壓分別為1.8kv、2.0kv、2.3kv；

(c)將感受態(tài)細胞與外源線性靶基因DNA片段的混合物加至預冷的電轉化杯中，輕擊液體以確保感受態(tài)細胞與外源線性打靶DNA懸液位于電轉化杯底部。擦干電轉化杯外側的冷凝水和霧氣，將其放進電轉化儀上；

(d)進行脈沖電擊；

(e)脈沖結束后，盡可能快的取出電轉化杯。室溫下加入1mlSOC液體培養(yǎng)基,，吹打后，吸取1ml電轉液于1.5ml滅菌Eppendorf離心管中；

(f)30℃，170rpm振蕩培養(yǎng)2.5h后，6000rpm離心5min，棄800ul上清后，剩余菌液200ul涂布于含有卡那霉素(25ug/ml)的營養(yǎng)瓊脂平板上正置3h后，再倒置培養(yǎng)12h。

實驗發(fā)現(xiàn)，當分別采用電轉化電壓為1.8,2.0,2.3kV時，L-阿拉伯糖誘導摩爾濃度5，15，30，50mmol/L，只有在電轉化電壓為1.8kV和L-阿拉伯糖誘導摩爾濃度為15mmol/L條件下，得到了重組子，而其余條件下并未有重組子長出。

實施例2

本實施例對實施例1的結果進行篩選驗證

1、重組菌的篩選

(a)待上述含有卡那霉素(25ug/ml)的營養(yǎng)瓊脂平板上長出菌落后，挑取單菌落接種至50mlLB培養(yǎng)基中。30℃，170rpm培養(yǎng)5h后，將溫度升高到42℃，170rpm繼續(xù)培養(yǎng)10h；

(b)采用劃線分離的方式，取菌液一環(huán)，分別接種至含有卡那霉素(25ug/ml)和含有氨芐霉素(60ug/ml)的營養(yǎng)瓊脂平板上，30℃過夜培養(yǎng)；

(c)篩選與菌種保藏挑取能夠在含有卡那霉素的平板上生長而在氨芐霉素的平板上不生長的菌落，接種至含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)16h后，接種至營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基30℃后4℃保藏備用。

2、陽性重組子的分子鑒定

設計鑒定引物對含卡那霉素抗性重組子進行PCR擴增，通過擴增產物的大小判斷野生菌基因組上的ppk基因是否被替換成功。

A.正向引物鑒定

1)引物設計

根據GenBank提供的大腸桿菌基因組序列信息，運用Primer Premier5.0和Oligo6.0設計出所需的PCR引物，序列如下：

purn-F：5′-CCCAGGAACACGCTATTTATCC-3′

ppx-R：5′-CATCTACCACACGGGCTATGAC-3′

2)擴增體系及條件

正向引物鑒定靶基因替換大腸桿菌野生菌ppk基因PCR擴增反應，采用25ul反應體系，具體反應體系和條件見表2。

表2 PCR反應體系

PCR擴增條件：95℃預變性5min；95℃變性30s，53℃退火45s，72℃延伸1.5min，反應進行30個循環(huán)；72℃再延伸10min；4℃保溫至∞。

擴增完成后，1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。膠回收后克隆測序。

B.反向引物鑒定

1)引物設計

根據GenBank提供的大腸桿菌基因組序列信息運用Primer Premier5.0和Oligo6.0設計出所需的PCR引物，序列如下：

p-F：5′-TCTGCGTTACTGCCTTGATGAT-3′

p-R：5′-TAATCAATATTGCGCGTCATCC-3′

2)擴增體系及條件

反向引物鑒定靶基因替換大腸桿菌野生菌ppk基因時的PCR擴增反應，采用25ul反應體系，具體反應體系和條件見表3。

表3 PCR反應體系

PCR擴增條件：95℃預變性5min；95℃變性30s，49.5℃退火45s，72℃延伸1.5min，反應進行30個循環(huán)；72℃再延伸10min；4℃保溫至∞。

擴增完成后，1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，膠回收后克隆測序。

測序結果表明，采用正向鑒定引物purn-F/ppx-R，重組菌株E.coli/ppk^-Kan⁺的擴增條帶約2000bp，與預期結果相符。采用反向鑒定引物p-F/p-R，野生型菌株擴增條帶大小約為1200bp，與預期結果相符，重組菌未擴增出任何條帶，經測序驗證及BLAST比對后，表明大腸桿菌重組菌E.coli/ppk^-Kan⁺重組成功，外源DNA已整合入大腸桿菌基因組中。

核苷酸或氨基酸序列表

<110> 西安建筑科技大學

<120> 一種提高大腸桿菌電轉化陽性重組子獲取效率的方法

<160>

<210> 1

<211> 22

<212> 正向引物purn-F

<213>

<220>

<400> 1

CCCAGGAACACGCTATTTATCC

<210> 2

<211> 22

<212> 正向引物ppx-R

<213>

<220>

<400> 2

CATCTACCACACGGGCTATGAC

<210> 3

<211> 22

<212> 反向引物p-F

<213>

<220>

<400>3

TCTGCGTTACTGCCTTGATGAT

<210> 4

<211> 22

<212> 反向引物p-R

<213>

<220>

<400> 4

TAATCAATATTGCGCGTCATCC

<210> 5

<211> 69

<212> SEQ ID No.5

<213>

<220>

<400> 5

ATGGGTCAGGAAAAGCTATACATCGAAAAAGAGCTCAGTTGGTTATCGTTGCGATTGTGTAGGCTGGAG

<210> 6

<211> 71

<212> SEQ ID No.6

<213>

<220>

<400> 6

TTATTCAGGTTGTTCGAGTGATTTGATGTAGTCGTAAATCGCCAACTGCGTAACGGCTGACATGGGAATTAG

<210> 7

<211> 2067

<212> 待敲除目標基因序列

<213>

<220>

<400> 7

ATGGGTCAGGAAAAGCTATACATCGAAAAAGAGCTCAGTTGGTTATCGTTCAATGAACGCGTGCTTCAGGAAGCGGCGGACAAATCTAACCCGCTGATTGAAAGGATGCGTTTCCTGGGGATCTATTCCAATAACCTTGATGAGTTCTATAAAGTCCGCTTCGCTGAACTGAAGCGACGCATCATTATTAGCGAAGAACAAGGCTCCAACTCTCATTCCCGCCATTTACTGGGCAAAATTCAGTCCCGGGTGCTGAAAGCCGATCAGGAATTCGACGGCCTCTACAACGAGTTGTTGCTGGAGATGGCGCGCAACCAGATCTTCCTGATTAATGAACGCCAGCTCTCCGTCAATCAACAAAACTGGCTGCGTCATTATTTTAAGCAGTATCTGCGTCAGCACATTACGCCGATTTTAATCAATCCTGACACTGATTTAGTGCAGTTCCTGAAAGATGATTACACCTATCTGGCGGTGGAAATTATCCGTGGCGATACCATCCGTTACGCGCTGCTGGAGATCCCATCAGATAAAGTGCCGCGCTTTGTGAATTTACCGCCAGAAGCGCCGCGTCGACGCAAGCCGATGATTCTTCTGGATAACATTCTGCGTTACTGCCTTGATGATATTTTCAAAGGCTTCTTTGATTATGACGCGCTGAATGCCTATTCAATGAAGATGACCCGCGATGCCGAATACGATTTAGTGCATGAGATGGAAGCCAGCCTGATGGAGTTGATGTCTTCCAGTCTCAAGCAGCGTTTAACTGCTGAGCCGGTGCGTTTTGTTTATCAGCGCGATATGCCCAATGCGCTGGTTGAAGTGTTACGCGAAAAACTGACTATTTCCCGCTACGACTCCATCGTCCCTGGTGGTCGTTATCATAATTTTAAAGACTTTATTAATTTCCCCAATGTCGGCAAAGCCAATCTGGTGAACAAACCACTGCCGCGTTTACGCCACATTTGGTTTGATAAAGCCCAGTTCCGCAATGGTTTTGATGCTATTCGCGAACGCGATGTGTTGCTCTATTATCCTTATCATACCTTTGAGCATGTACTGGAACTGCTGCGTCAGGCTTCGTTCGACCCGAGCGTACTGGCGATTAAAATTAACATTTACCGCGTGGCGAAAGATTCACGCATCATCGACTCGATGATCCACGCCGCACACAACGGTAAGAAAGTCACCGTGGTGGTTGAGTTACAGGCGCGTTTCGACGAAGAAGCCAACATTCACTGGGCGAAGCGCCTGACCGAAGCAGGCGTGCACGTTATCTTCTCTGCGCCGGGGCTGAAAATTCACGCCAAACTGTTCCTGATTTCACGTAAAGAAAACGGTGAAGTGGTGCGTTACGCACACATCGGGACCGGGAACTTTAACGAAAAAACCGCGCGTCTTTATACTGACTATTCGTTGCTGACCGCCGATGCGCGCATAACCAACGAAGTACGGCGGGTGTTCAACTTTATTGAAAACCCATACCGTCCGGTGACATTTGATTATTTAATGGTGTCGCCGCAAAACTCCCGCCGCCTGTTGTATGAAATGGTGGACCGCGAAATCGCCAACGCGCAGCAAGGGCTGCCCAGCGGTATCACCCTGAAGCTAAATAACCTTGTCGATAAAGGCCTGGTTGATCGTCTGTATGCGGCCTCCAGCTCCGGCGTACCGGTTAATCTGCTGGTTCGCGGCATGTGTTCGCTGATCCCCAATCTGGAAGGCATTAGCGACAACATTCGTGCCATCAGTATTGTTGACCGTTACCTTGAACATGACCGGGTTTATATTTTTGAAAATGGCGGCGATAAAAAGGTCTACCTTTCTTCCGCCGACTGGATGACGCGCAATATTGATTATCGTATTGAAGTGGCGACGCCGCTGCTCGATCCGCGCCTGAAGCAGCGGGTGCTGGACATCATCGACATATTATTCAGCGATACAGTCAAAGCACGTTATATCGATAAAGAACTCAGTAATCGCTACGTTCCCCGCGGCAATCGCCGCAAAGTACGGGCGCAGTTGGCGATTTACGACTACATCAAATCACTCGAACAATCTGAATAA