本發(fā)明屬于分子育種領(lǐng)域，尤其涉及一種利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除大鱗副泥鰍色素基因從而生產(chǎn)白化大鱗副泥鰍的方法。

背景技術(shù)：

隨著觀賞水族行業(yè)在國內(nèi)的穩(wěn)步發(fā)展，觀賞類生物的品種的逐年激增，以鰍科魚類為代表的原生魚種也逐漸為廣大水族愛好者所熟知。其中，白化鰍科魚種從外觀上可以看到其皮膚白色或淺紅色，眼睛紅色并且透明。因為這種性狀的奇異性和稀少性，所以尤其受到廣大水族消費(fèi)者的追捧。目前，這些新的觀賞魚類資源主要由野外捕撈篩選，隨機(jī)性大，產(chǎn)量極少，難已滿足廣大水族愛好者的獵奇需求。并且由于白化魚種的白化魚苗發(fā)育胚胎的透明性，它們經(jīng)常被用來做單性發(fā)育的研究材料，為研究遺傳基因在正常魚體所發(fā)揮的作用提供可見的有力的證據(jù)。因此，運(yùn)用現(xiàn)代生物技術(shù)定向改造魚類體色，穩(wěn)定批量生產(chǎn)符合市場及科研需求的白化鰍科魚類將具有很大的發(fā)展空間。

CRISPR/Cas9基因敲除系統(tǒng)是近兩年發(fā)展起來的一種來源于細(xì)菌獲得性免疫系統(tǒng)的基因編輯技術(shù)，經(jīng)過人工的改造，目前已被廣泛運(yùn)用于多種模式生物的研究，成為一種強(qiáng)大的研究工具。酪氨酸酶(Tyrosinase,TYR)是催化黑色素形成的關(guān)鍵酶，主要存在于黑色素細(xì)胞中。黑色素細(xì)胞廣泛存在于魚類等脊椎動物的表皮中。TYR基因主要在皮膚、腦和眼中都有表達(dá)，其中眼部和黑色皮膚表達(dá)最高。從青鳉魚中分離出多個白化突變體，對它們TYR突變基因的分析表明，缺失突變和轉(zhuǎn)座子插入是導(dǎo)致白化的兩種主要突變類型。將正常的TYR基因轉(zhuǎn)移到白化魚體內(nèi)，轉(zhuǎn)基因魚的體色得到了不同程度的恢復(fù)。是一種常染色體隱性遺傳病。

因此，在分子育種領(lǐng)域中，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除鰍科魚類TYR基因生產(chǎn)白化鰍科魚種的技術(shù)，將是一種具有重大意義的發(fā)明，且目前還沒有出現(xiàn)相關(guān)研究的報道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除鰍科魚類大鱗副泥鰍的TYR基因，從而生產(chǎn)白化大鱗副泥鰍的分子育種技術(shù)。用于定向改造魚類體色，不僅可以有效解決觀賞魚市場白化魚種供需困難的問題，還可以提供科學(xué)研究所需要的白化魚類胚胎。

本發(fā)明通過以下內(nèi)容實(shí)現(xiàn)：

1、大鱗副泥鰍TYR基因序列信息的確定：

①首先，使用RNAiso Plus試劑(TaKaRa，日本)提取大鱗副泥鰍皮膚總RNA，再使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa，日本)體外合成第一鏈cDNA。

②由NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取斑馬魚，草魚，團(tuán)頭魴等魚類TYR基因全長cDNA序列，后進(jìn)行多重比對，讀取這些魚類保守區(qū)域氨基酸序列的保守區(qū)域設(shè)計合成1對簡并引物，用于克隆大鱗副泥鰍TYR基因核心片段，回收產(chǎn)物送公司測序，得到其序列信息。

③使用SMART RACE cDNA Amplification Kit(Clontech,USA)試劑盒，參照試劑盒推薦方法合成5’、3’-RACE cDNA第一鏈。再在②步驟中得到的核心片段序列上的設(shè)計RACE引物，分別以5’、3’-RACE cDNA第一鏈為模板，克隆大鱗副泥鰍TYR基因5’和3’末端片段，回收產(chǎn)物送公司測序，得到其序列信息。

④拼接得到大鱗副泥鰍TYR基因全長序列信息。大鱗副泥鰍TYR基因全長序列信息如SEQ ID NO：1所示。

2、CRISPR/Cas9靶位點(diǎn)設(shè)計及確認(rèn)：

在大鱗副泥鰍TYR基因的ORF序列上，按照CRISPR/Cas敲除原理，設(shè)計TYR基因靶位點(diǎn)。靶位點(diǎn)通式為：5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-NGG-3’(N為任意堿基)，盡量在ORF前端設(shè)計。同時在靶位點(diǎn)周圍300-500bp大小范圍內(nèi)設(shè)計引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物直接送測序。要求：①正反向引物距離靶位點(diǎn)處至少100bp。②PCR條帶清晰，無雜帶。③測序結(jié)果與設(shè)計的靶位點(diǎn)序列相同，且測序峰圖顯示為純合子(即未出現(xiàn)疊峰)。大鱗副泥鰍TYR基因靶位點(diǎn)序列信息如SEQ ID NO：2所示。

3、Cas9mRNA和gRNA的制備：

以純化后的線性化Cas9質(zhì)粒(pSP6-2sNLS-SpCas9vector)為模版，進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄得到Cas9mRNA，將其純化后于-80℃保存。保存濃度為830ng/μL。設(shè)計含有TYR基因靶位點(diǎn)序列的上游引物及與其匹配的下游引物，以gRNA骨架質(zhì)粒為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再以純化后的產(chǎn)物為模版，進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄得到gRNA，將其純化后于-80℃保存，保存濃度為1210ng/μL。含有TYR基因靶位點(diǎn)序列的上游引物如SEQ ID NO：3所示，與其匹配的下游引物如SEQ ID NO：4所示。

4、體外顯微注射：

注射前一天晚上，挑選2對發(fā)育較好的大鱗副泥鰍，進(jìn)行人工催產(chǎn)，人工催產(chǎn)藥物的劑量為每kg雌親魚注射LRH-A₂ 40ug、DOM 4mg，雄魚減半。然后將親本置于水溫為27℃的黑暗環(huán)境中靜養(yǎng)。第二天早上即可進(jìn)行人工授精，獲得受精卵后將其置于顯微注射專用培養(yǎng)皿上，用顯微注射儀對到達(dá)1細(xì)胞期的受精卵進(jìn)行顯微注射。之后將注射完畢的受精卵置于28℃恒溫箱進(jìn)行孵化培育。Cas9mRNA的終濃度為500ng/μL，gRNA的終濃度為30ng/μL，每次注射的量為2nL，注射部位為動物極。

5、TYR基因敲除魚的篩選：

在步驟4中得到的受精卵孵化48小時之后，對比相同孵化條件下的野生型大鱗副泥鰍胚胎，在顯微鏡下挑選出體色素出現(xiàn)異常的基因敲除魚。

6、能夠穩(wěn)定遺傳的白化大鱗副泥鰍的獲得：

將步驟5中得到的TYR基因敲除魚進(jìn)行雜交，獲得的F1代中無體色素出現(xiàn)的個體，即為能夠穩(wěn)定遺傳的白化大鱗副泥鰍。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1、TYR基因敲除魚的篩選

本發(fā)明敲除效率極高，且無需通過分子手段篩選，只需通過肉眼觀察，即可以高效獲得大量TYR基因敲除成功個體。

2、能夠穩(wěn)定遺傳的白化大鱗副泥鰍的獲得

將TYR基因敲除魚作為親本雜交，F(xiàn)1代即可得到能夠穩(wěn)定遺傳的白化大鱗副泥鰍，仍無需通過分子手段，只需肉眼觀察篩選。簡單高效，周期短。

附圖說明

圖1是T7E1酶切檢測突變體的瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖2是TYR基因敲除大鱗副泥鰍的雜交策略示意圖。

圖3是野生、G0代、F1代白化大鱗副泥鰍的對比照片。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施案例對本發(fā)明實(shí)施應(yīng)用進(jìn)行說明。

1、大鱗副泥鰍皮膚總RNA的提取

使用TaKaRa公司RNAiso Plus試劑進(jìn)行大鱗副泥鰍總RNA的提取，具體步驟如下：

1)提取RNA：所用器皿、手術(shù)剪、鑷子均要用DEPC處理過夜；所用到的水為TaKaRa公司購買的RNase-free Water；離心EP管，各型號槍頭為提RNA專用的或者用DEPC水浸泡過夜并高壓滅菌處理。注意：提取總RNA過程中要及時佩戴口罩，更換手套，避免說話。實(shí)驗前將取樣器械置于冰上預(yù)冷；

2)處死大鱗副泥鰍，快速分離皮膚組織，并取30mg-50mg組織樣品于2mL離心管中，離心管置于冰浴，事先加入1.5mL RNAiso Plus試劑，3顆經(jīng)DEPC水浸泡過夜并高壓滅菌處理的玻璃珠。加好后使用組織破碎儀破碎至呈無顆粒透明狀即可；

3)取出離心管，室溫靜置5min；

4)將離心管移至低溫高速離心機(jī)，12000r/min、4℃離心5min；

5)離心后取出，吸取上清液轉(zhuǎn)移到新的1.5mL離心管中；

6)向上述勻漿裂解液中加入氯仿，用量為RNAiso Plus試劑體積的1/5，蓋上離心蓋，用手劇烈震蕩15s，待充分乳化后，再室溫靜置5min；

7)將離心管移至低溫高速離心機(jī)，12000r/min、4℃離心15min；

8)由離心機(jī)中小心取出離心管，此時勻漿液分為三層，無色上清液，中間白色蛋白質(zhì)層及帶有鮮紅顏色的下層有機(jī)層，吸取上清液到另一新離心管中；

9)向上清液中加入等體積的異丙醇，充分混勻，室溫條件下靜置10min；

10)于低溫離心機(jī)中，12000r/min離心批評，試管底部會出現(xiàn)沉淀；

11)RNA沉淀的清洗：小心棄去上清液，緩慢地沿管壁加入75％乙醇溶液1mL，輕輕顛倒混勻洗滌管壁，12000r/min、4℃離心5min后小心棄去乙醇；

12)于超凈工作臺中室溫干燥沉淀2-5min，加入10-20μL RNase-free Water溶解沉淀；

13)將充分溶解的RNA樣品取1-2μL，用1-2％瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的提取結(jié)果；

14)將充分溶解的RNA樣品取1-2μL，用紫外分光光度計檢測RNA濃度與純度。

2、大鱗副泥鰍皮膚cDNA第一鏈的合成

1)大鱗副泥鰍皮膚cDNA第一鏈的合成使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa，日本)；記錄由紫外分光光度計測定的RNA樣品濃度。

2)在提取RNA專用離心管中配制10μL如下反應(yīng)體系：

3)將該反應(yīng)體系置于PCR儀上42℃2min后，冰上急冷。

4)另取提取RNA專用離心管中配制10μl如下反應(yīng)體系：

5)混合均勻，置于PCR儀運(yùn)行程序：37℃15min；85℃5s；4℃停止。

3、大鱗副泥鰍皮膚cDNA基因核心區(qū)序列引物設(shè)計

由NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取斑馬魚，草魚，團(tuán)頭魴等魚類TYR基因全長cDNA序列，后進(jìn)行多重比對，讀取這些魚類保守區(qū)域氨基酸序列的保守區(qū)域設(shè)計合成1對簡并引物：

F：ACTTYACCAKCCCKTACTSGGACTGGC

R：ATGTCTTCMGTGYAGGGGBCCGCCAACG

預(yù)期PCR產(chǎn)物片段大小為500bp左右。經(jīng)合成的引物12000r充分離心，后用去離子雙蒸水(ddH₂O)將引物溶解至濃度為20μmol/L,置于-20℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

4、大鱗副泥鰍TYR核心片段的PCR擴(kuò)增

1)配制如下60μl PCR反應(yīng)體系：

2)將反應(yīng)體系混勻，離心后置于PCR儀上，進(jìn)行PCR反應(yīng)。大鱗副泥鰍TYR基因核心片段PCR擴(kuò)增條件如下：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，進(jìn)行35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。注意：配制反應(yīng)體系時必須在冰上進(jìn)行。

3)PCR純化產(chǎn)物與pMD-19T載體的連接，小型離心管中10μl反應(yīng)體系如下：

純化PCR產(chǎn)物 4μl

pMD19-T載體 1μl

SolutionⅠ 5μl

4)將該10μL體系混合均勻，置于PCR儀上，設(shè)置程序16℃30min反應(yīng)，取全部反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α(100μl)感受態(tài)細(xì)胞中，涂LB/Amp平板，37℃倒置培養(yǎng)過夜；挑取單菌落置于5ml LB/Amp液體培養(yǎng)基中，37℃/180rpm振蕩培養(yǎng)10-12h至菌液渾濁；取500μl菌液測序送往上海生工生物技術(shù)有限公司，引物為M13反向引物，使用ABI PRISMTM全自動熒光測序儀完成序列測定，測序要求為雙向測序，并進(jìn)行校對與拼接，得到大鱗副泥鰍TYR基因核心序列。

5、大鱗副泥鰍TYR基因5’、3’-RACE cDNA的合成

1)5’-RACE引物的設(shè)計

根據(jù)步驟4中克隆得到的大鱗副泥鰍TYR基因cDNA核心序列，使用SMART RACE cDNA Amplification Kit(Clontech,USA)試劑盒，按照試劑盒說明設(shè)計5’-RACE上游引物如下：

擴(kuò)5’端：

OUTER1：GGCGGATCCCTGCACTGAAGACAT

INER1：CTCATACTCTGTCAGTCTGAGCACCGA

下游引物UPM(通用混合引物Universal Primer Mix)、NUP(UPM的嵌套引物Nested Universal Primer)由試劑盒提供。

2)大鱗副泥鰍TYR基因cDNA 5’末端

使用SMART RACE cDNA Amplification Kit(Clontech,USA)試劑盒，進(jìn)行5’-RACE PCR擴(kuò)增(使用巢式引物擴(kuò)增)，1st PCR反應(yīng)體系(10μl體系)如下:

PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，62℃退火30s，72℃延伸1min，30個循環(huán)；最后72℃額外延伸10min。

嵌套PCR反應(yīng)(60μl)體系：

PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，65℃退火30s，72℃延伸1min，30個循環(huán)；最后72℃額外延伸10min。

3)5’-RACE PCR產(chǎn)物的pMD-19T載體克隆

將5’-RACE PCR產(chǎn)物按照步驟4中的操作步驟進(jìn)行pMD-19T載體克隆，最后將陽性克隆送往公司測序，得到大鱗副泥鰍TYR基因cDNA 5’末端序列信息。

4)再按照上述方法得到大鱗副泥鰍TYR基因cDNA3’末端序列信息。其中，3’-RACE上游引物如下：

擴(kuò)3’端：

OUTER2：CTTCACCATCCCGTACTGGGACTGGC

INER2：TCAGTCCATCCTCTGTATTCTCCTCGT

1st PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，30個循環(huán)；最后72℃額外延伸10min。嵌套PCR94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，65℃退火30s，72℃延伸1min，30個循環(huán)；最后72℃額外延伸10min。

6、大鱗副泥鰍TYR基因序列信息的確定

將步驟4和步驟5中得到的序列拼接，得到大鱗副泥鰍TYR基因全長序列信息。大鱗副泥鰍TYR基因全長序列信息如SEQ ID NO：1所示。

7、CRISPR/Cas9靶位點(diǎn)設(shè)計及確認(rèn)

根據(jù)靶位點(diǎn)通式：5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-NGG-3’(N為任意堿基)及靶位點(diǎn)基本設(shè)計原則，在大鱗副泥鰍TYR基因的ORF序列上，設(shè)計TYR基因靶位點(diǎn)。設(shè)計靶位點(diǎn)序列信息如SEQ ID NO：2所示。同時在靶位點(diǎn)周圍設(shè)計如下正反引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，

F：TGCTTCTCTTCATCATTCAGTACC

R：GCTCGTGCCGTTGTTCATT

體系如下：

PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，64℃退火30s，72℃延伸1min，30個循環(huán)；最后72℃額外延伸10min。

根據(jù)步驟4所述方法得到擴(kuò)增產(chǎn)物序列信息，然后和靶位點(diǎn)序列比較，發(fā)現(xiàn)結(jié)果相同，說明靶位點(diǎn)可用，可以進(jìn)行下一步。當(dāng)然，大鱗副泥鰍TYR基因靶位點(diǎn)不限于SEQ ID NO：2所示序列，符合要求能夠敲除TYR基因的其它靶位點(diǎn)也在保護(hù)范圍之內(nèi)。

8、gRNA的制備

首先，設(shè)計含有TYR基因靶位點(diǎn)序列的gRNA上游引物及與其匹配的下游引物：

F：TAATACGACTCACTATAGCTCCAGAGGTTCTCCTAAGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC

R：AAAGCACCGACTCGGTGCCA

在滅菌PCR管中配制如下反應(yīng)體系，其中模板DNA：p-T7-gRNA質(zhì)粒(購自http://www.biovector.net/product/99362.html)：

PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，30個循環(huán)；最后72℃額外延伸10min。

再利用AXYGEN公司的AxyPrep PCR清潔試劑盒對產(chǎn)物進(jìn)行清洗回收，主要步驟如下：

1)在PCR產(chǎn)物中加150μl的Buffer PCR-A；

2)混勻后，轉(zhuǎn)移到制備管中，將制備管置于2ml離心管(試劑盒內(nèi)提供)中，12,000×g離心1min，棄濾液；

3)將制備管置回2ml離心管，加700μl Buffer W2，12,000×g離心1min，棄濾液；

4)將制備管置于潔凈的1.5ml離心管(試劑盒內(nèi)提供)中，在制備管膜中央加25μl Eluent，室溫靜置1min。12,000×g離心1min洗脫回收DNA。

然后利用Ambion公司的T7 Kit試劑盒對洗脫回收DNA進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，主要步驟如下：

將上述試劑加入滅菌EP管中，37℃水浴1h，然后加入1μL TURBO DNase，37℃水浴15min以去除DNA模板，最后用Ambion公司的mirVana^TM miRNA Isolation Kit進(jìn)行回收，步驟如下：

用RNase-free water將gRNA轉(zhuǎn)錄體系稀釋到300μL，加入330μL無水乙醇；

2)將溶液加到回收柱中，10000g離心15s；

3)加入700μL的miRNA Wash Solution I，離心10s；

4)加入500μL的Wash Solution II，離心10s；重復(fù)一次；

5)棄去收集管中的液體，離心1min，去除殘余的液體；

6)加入適量95℃預(yù)熱的RNase-free water，最大轉(zhuǎn)速離心30s，收集得到gRNA溶液，測得濃度為1210ng/μL，零下80℃保存。

9、Cas9mRNA的制備

通過XbaI單酶切線性化pSP6-2sNLS-spCas9載體(37℃水浴，4h以上)，取少量電泳確認(rèn)線性化完全后，直接回收線性化產(chǎn)物。以純化后的線性化Cas9質(zhì)粒為模版，進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄得到Cas9mRNA，將其純化后于-80℃保存。保存濃度為830ng/μL。純化回收和體外轉(zhuǎn)錄同步驟8。

10、體外顯微注射

注射前一天晚上，挑選2對發(fā)育較好的大鱗副泥鰍，進(jìn)行人工催產(chǎn)，人工催產(chǎn)藥物的劑量為每kg雌親魚注射LRH-A₂ 40ug、DOM 4mg，雄魚減半。然后將親本置于水溫為27℃的黑暗環(huán)境中靜養(yǎng)。第二天早上即可進(jìn)行人工授精，獲得受精卵后將其置于顯微注射專用培養(yǎng)皿上，用顯微注射儀對到達(dá)1細(xì)胞期的受精卵進(jìn)行顯微注射。之后將注射完畢的受精卵置于28℃恒溫箱進(jìn)行孵化培育。Cas9mRNA的終濃度為500ng/μL，gRNA的終濃度為30ng/μL，每次注射的量為2nL，注射部位為動物極。

11、TYR基因敲除魚的篩選

在受精卵孵化約6小時之后，對比相同孵化條件下的野生型大鱗副泥鰍胚胎，在顯微鏡下可以看出TYR敲除魚的眼睛仍為無色透明，而野生型的已經(jīng)開始出現(xiàn)黑色素。可以初步判斷靶位點(diǎn)有效。孵化48小時后，就可以從外觀明顯區(qū)別G0代是否為敲除成功的魚。然后隨機(jī)選取10尾基因敲除成功的魚，分別提基因組DNA，進(jìn)行T7E1法驗證，T7E1酶切檢測突變體實(shí)驗步驟來自http://www.docin.com/p-1292084266.html。發(fā)現(xiàn)全部切開，結(jié)果如圖1所示。因此，TYR基因敲除魚的篩選，可以直接通過體色出現(xiàn)異常這個特點(diǎn)判斷。最后統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，共存注射400余顆受精卵，12顆畸形或死亡，18顆表現(xiàn)出正常體色(不一定未敲除成功)，突變率超過95％。

12、能夠穩(wěn)定遺傳的白化大鱗副泥鰍的獲得

繁殖策略是將得到的TYR基因敲除魚進(jìn)行雜交，如圖2所示，獲得的F1代中無體色素出現(xiàn)的個體，即為能夠穩(wěn)定遺傳的白化大鱗副泥鰍。如圖3所示。

綜上所述，本發(fā)明是一種簡單，高效，周期短，易實(shí)施的分子育種技術(shù)，且該技術(shù)只是破壞本身基因功能，不涉及外來基因，不存在轉(zhuǎn)基因問題，便于推廣運(yùn)用。

序 列 表

<110>華中農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>一種能夠穩(wěn)定遺傳的白化大鱗副泥鰍育種方法

<160> 4

<210> 1

<211> 2111

<212> DNA

<213>大鱗副泥鰍TYR基因

<400> 1

TGGGAGGGAG GGCAGTGCGT AAAAGAAAGA GAGAGAGAAC TGAATAAAGT TTTTCTTACT 60

CTTCTGAAAA TGTTTCACGC TCATGCACTG CGTGTCTAAT TTAAAGCACC GTCTTTAGAT 120

AGCTCACCAT GAACCCTTTA TGTGCCTTTC TGCTTCTCTT CATCATTCAG TACCCGGGTC 180

CATCTCTCCA GCAGTTTCCT CGACCATGCA CCACTCCAGA GGTTCTCCTA AGCAAACAAT 240

GCTGTCCGGT TTGGCCAGGG GACGGCTCGG TGTGTGGGAG TCTCTCGGGT CGAGGCTTCT 300

GCCAGGACGT CACGGTCTCT GAGCTTCCCA ACGGGCCTCA GTACCCCCAC TCCGGCCTAG 360

ATGACCGGGA ACGGTGGCCT CTGGTGTTTT ACAACCAAAC CTGCCAGTGC GCAGGTAACT 420

ACATGGGGTT CAACTGCGGC GAGTGCAAGT TCGGGTATTT TGGTGCCAAT TGCGCGGAGA 480

GAAGAGAGTC CGTGCGCAGG AACATCTTCC AGCTGTCGGT AACGGAGAAA CAGCGGTTTA 540

TCTCCTACCT GAACCTTGCC AAAAACACAA TCAGCCCGGA TTACATGATC GCGACGGGCA 600

CGTACGCGCA AATGAACAAC GGCACGAGCC CCATGTTCGC TAACATCAGC GTGTATGATC 660

TGTTCGTGTG GATGCACTAC TACGTGTCCC ATGACACGCT GCTCGGCGGG CCCGGTAACG 720

TGTGGAGAGA CATCGACTTC GCGCACGAGT CTGCGGCGTT CCTACCCCGG CACCGCGTTT 780

ATTTGCTGTT CCGGGAGCAT GAGATCCGGA AACTGACCGG AGACTTTAAC TTCACCATCC 840

CGTACTGGGA CTGGCGTGAC GCGGAGGATT GTCAGGTGTG CACGGATGAA CTGATGGGGG 900

CGCGCAGCTC ACTGAACCGA GGCTTAATCA GTCCATCCTC TGTATTCTCC TCGTGGAAGG 960

TGGTCTGTTC ACAAGCTGAA GACTACAACA ATCGTGAGGT TCTGTGCGAC GGGTCTCCTG 1020

AAGGGCCTTT ACAGCGTAAC CCTGGTGACC ACGACCGAAC CCGTGTCAGA CGGCTGCCGA 1080

CCTCTGCAGA TGTGGAGTCG GTGCTCAGAC TGACAGAGTA TGAGACCGGG TCAATGGACC 1140

GGCAGGCCAA CATGAGTTTC CGTAACGCTC TGGAAGGTTT TGCGAGTCCA GAAACAGGTC 1200

TGGCAGTAAC AGGTCAGAGT CTGATGCACA ACTCACTACA CGTCTTCATG AATGGATCCA 1260

TGTCTTCAGT GCAGGGATCC GCCAACGACC CCATTTTTAT TCTGCATCAT GCCTTTATAG 1320

ACAGCATTTC CGAGCAGTGG TTAAGGCGAC ACCAGCCTCC GCGCACACAT TACCCGACAG 1380

CCAACGCCCC AATCGGGCAC AACGATGGAT ATTTCATGGT TCCCTTCATC CCACTGTACA 1440

GAAACGGAGA TTATTTCTTG TCCACCAAAG CTTTGGGATA CGAATATGCA TATTTAATGG 1500

ACCCTGGCCA GCGGTTCGTA CAAGAGTTTT TGACGCCATA TCTACAGCAA GCTCAGCAGA 1560

TCTGGCACTG GCTGCTGTCC GCAGGAATTT TGGGGGCGCT TGTGGCAGGA ATTATCGCAA 1620

CAATAATCGC CGCAACATGC CGCAGACGGC AAAAAAGACG AAAGCTGTCG GGATACGGAG 1680

AGAGACAGCC GCTTCTGAAC AGCAGCGAGG AAGAGGGTTC GACTTCGTAT CAGACAACGC 1740

TGTGAATCAA ACACATACAC ACTACAGGCA CGTGTCAGTG AGGACAGATA CAATACATAC 1800

TGTAACCAAT GGGAAAAGAC ACAACAGACA GTTAACAAAG TCAGTTTACT TAGTCATGTG 1860

AACAACGGAG GCCTCACCAC TGAATCTTAT GCTGAGGTCT CGCACCTGTA CCAGTTATGA 1920

GATAATGTTG GGAAATGCAT ACTACTGTAA AATAAGTAGG GCGGTCAAAC GATTAATATT 1980

TTAAAAACTT TTAGATTACA GGTTTTAACA GTGGATATTG TACGCAGTAT GCAAACTGTC 2040

TATATAAACC ATTAATACTA CTAATATTAA AAAGATCAAA GTAAAAAAAA AAAAAAAAAA 2100

AAAAAAAAAA A 2111

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 2

CTCCAGAGGT TCTCCTAAGC 20

<210> 3

<211> 58

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 3

TAATACGACT CACTATAGCT CCAGAGGTTC TCCTAAGCGT TTTAGAGCTA GAAATAGC 58

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 4

AAAGCACCGA CTCGGTGCCA 20